循环伏安曲线测试方法具体如下:
[0025](1)使用电化学工作站Gamry reference 600，采用三电极体系进行微电极的电化学表征。
[0026](2)用PDMS将一个塑料腔体粘在基底上，微电极阵列区域位于腔体内。在腔体内注入PBS溶液。
[0027](3)以石墨烯三维微电极位点作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极，三个电极浸入(2)中所述的PBS溶液。
[0028](4)进行电化学阻抗分析时，电化学工作站输出峰值为50mV的正弦交流信号，频率范围从0.01HZ到1MHz。
[0029](5)进行循环伏安分析时，扫描电压范围-0.5V-0.5V，扫描速度100mV/S。
[0030]电化学阻抗检测结果如图3所示，在1kHz时，石墨烯三维微电极结构测到较小的阻抗值为300ΚΩ左右，能够满足细胞检测的阻抗条件。对于传统平面微电极结构来说，经过绝缘层封装之后其电极位点会低于绝缘层的高度，电极阵列将是一个一个的凹陷结构。经本发明提供的三维丘形状凸起结构，不仅增大了电极位点的表面积，同时也保证了待测细胞组织与电极位点的有效接触，避免因细胞与电极之间贴合不严造成的电荷泄漏，提高检测的信噪比。
[0031]循环伏安曲线测试如图4所示，测量多个石墨烯电极，得到了重复性较好的CV图，证实了本发明提供的丘形状石墨烯微电极位点每一个均具有稳定的电荷转移能力。本实施例虽只选取了三个微电极位点，但对数十个丘形状电极位点都适用。
[0032]实施例3
[0033]在石墨烯三维微电极阵列芯片上进行细胞培养和检测
[0034](1)石墨烯三维微电极阵列的表面处理:在接种细胞前，石墨烯三维微电极在75 %的乙醇溶液中浸泡一小时后，紫外灯下晾干;然后将多聚右旋赖氨酸(PDL)溶液按照2yg/cm2的浓度滴加在石墨烯三维微电极阵列表面，常温过夜，再用超纯水冲洗三遍，风干。
[0035](2)石墨烯三维微电极阵列表面接种细胞:用消化液(0.25 %胰蛋白酶，0.02 %m)TA溶液)将常规培养的SH-SY5Y细胞消化、离心、吹打，以1.0 X 107cells/mm3的密度接种于石墨烯三维微电极阵列芯片上。
[0036](3) SH-SY5Y细胞诱导分化:因全反式维甲酸能诱导SH-SY5Y分化为神经细胞，所以培养液采用含有ΙΟηΜ全反式维甲酸、10 %的胎牛血清、0.1 lg/L丙酮酸钠、300mg/L谷氨酰胺的MEM/F12培养基;因维甲酸光不稳定，培养过程中避光，每天换液。
[0037](4)细胞检测:培养5天后，将石墨烯三维微电极阵列芯片固定于多通道电信号检测系统的夹具中，然后将夹具放于倒置显微镜的样品台上，在进行成像观察的同时记录细胞产生的自发动作电位，检测结果如图5所示。
【主权项】
1.一种石墨烯三维微电极阵列芯片，其特征在于利用负性光刻胶制作微柱阵列，在微柱阵列上覆盖单层石墨烯薄膜制作出微电极阵列;所述的微电极芯片包括透明的石墨烯三维电极阵列区域和外围金电极引线引脚两部分。2.按权利要求1所述的芯片，其特征在于以硅片、石英或硼硅玻璃为基底用石墨烯薄膜制作成微电极阵列，利用固化的负性光刻胶微柱将二维的石墨烯顶起形成三维的丘形状微电极位点，而不损坏石墨烯薄膜。3.按权利要求2所述的芯片，其特征在于以硅片作为基底时，采用光刻胶SU8制作微柱阵列，以石英和硼硅玻璃作为基底时，采用聚酰亚胺光刻胶制作微柱阵列；具有光华的边缘。4.按权利要求2所述的微电极芯片，其特征在于丘形状微电极结构阵列利于刚性的微电极位点与柔软的细胞或组织形成紧密的电学耦合。5.按权利要求2或4所述的微电极阵列芯片，其特征在于所述的微电极位点为几个到数十个，为三维凸起。6.制作如权利要求1-3中任一项所述的石墨烯三维微电极芯片的方法，其特征在于具体步骤是: (1)清洗基底:使用Phiranha溶液清洗硅片、石英片或硼硅玻璃片，再用去离子水冲洗干净，氮气吹干，氧等离子体处理5分钟； (2)用Lift-off剥离工艺制作外微电极阵列区域外电极引线和引脚:在基底上旋涂AZ4620，光刻工艺进行图形化，然后溅射钛/金金属层，用丙酮去除光刻胶，留下金属图层； (3)三维微柱阵列制作:旋涂负性光刻胶，控制转速250-350r/min，光刻显影后，经过固化，形成微柱阵列； (4)石墨烯转移:使用化学气相沉积制备的单层石墨烯薄膜，实际为“铜/石墨烯/聚甲基酸甲酯”复合膜;该复合薄膜用过硫酸铵浸泡腐蚀铜箔，待铜被完全腐蚀后，留下支撑层”石墨烯/聚甲基酸甲酯”薄膜;再用去离子水漂洗薄膜，再将完整的薄膜转移到三维微柱阵列上，覆盖阵列并与金电极引线接触;静置一段时间后，用85°C烘箱烘30分钟，然后在丙酮溶液中浸泡去除聚甲基酸甲酯;最后用乙醇、去离子水依次清洗基底； (5)制作石墨烯微电极:旋涂AZ4620P光刻胶，通过光刻和氧等离子体刻蚀制作石墨烯图形，然后用丙酮去除光刻胶，依次用乙醇、去离子水对基底进行清洗； (6)制作电极绝缘层:旋涂SU83005，进行光刻、显影，暴露出石墨烯微电极位点和金电极引脚。7.按权利要求6所述的方法，其特征在于: ①所述的硼硅玻璃片Prex7740; ②三维微柱阵列制作时硅片用SU83005负性光刻胶，石英片或硼硅玻璃片采用PI7510； ③在透明基底上的石墨烯三维微电极阵列便于用倒置显微镜进行观察。8.按权利要求1所述的石墨烯三维微电极阵列芯片的应用，其特征在于进行细胞的培养和检测的结果是: ①所述的石墨烯三维电极位点结构，在ΙΚΗζ时的阻抗值为300k Ω，满足细胞检测的阻抗； ②所述的丘形状石墨稀电极位点每一个具有稳定的电荷转移能力。9.按权利要求8所述的应用，其特征在于具体步骤是: (1)石墨烯三维微电极阵列芯片的表面处理:在接种细胞前，石墨烯三维微电极在75%的乙醇溶液中浸泡一小时后，紫外灯下晾干;然后将多聚右旋赖氨酸PDL溶液按照2yg/cm2的浓度滴加在石墨烯三维微电极阵列表面，常温过夜，再用超纯水冲洗三遍，风干； (2)石墨烯三维微电极阵列表面接种细胞:用0.25%胰蛋白酶和0.02�TA溶液组成的消化液将常规培养的SH-SY5Y细胞消化、离心、吹打，以1.0X 107cells/mm3的密度接种于石墨烯三维微电极阵列芯片上； (3)SH-SY5Y细胞诱导分化:因全反式维甲酸能诱导SH-SY5Y分化为神经细胞，所以培养液采用含有ΙΟηΜ全反式维甲酸、10%的胎牛血清、0.11g/L丙酮酸钠、300mg/L谷氨酰胺的MEM/F12培养基;因维甲酸光不稳定，培养过程中避光，每天换液； (4)细胞检测:培养5天后，将石墨烯三维微电极阵列芯片固定于多通道电信号检测系统的夹具中，然后将夹具放于倒置显微镜的样品台上，在进行成像观察的同时记录细胞产生的自发动作电位。
【专利摘要】本发明涉及一种石墨烯三维微电极阵列芯片、方法及其应用。其特征在于所述的利用负性光刻胶制作微柱阵列，在微柱阵列上覆盖单层石墨烯薄膜制作出微电极阵列；所述的微电极芯片包括透明的石墨烯三维电极阵列区域和外围金电极引线引脚两部分。微电极位点为三维凸起。三维的微电极丘形状(或称为丘陵状)微电极结构利于刚性的微电极位点与柔软的细胞或组织形成紧密的电学耦合，加上石墨烯优异的电学特性，能够提高微电极阵列的电生理检测灵敏度。另外，制作在透明基底上的石墨烯三维微电极阵列便于用倒置显微镜进行观察，便于多种细胞显微成像方法的应用以及结合微流控芯片使用。
【IPC分类】G01N33/487, B81B1/00, G01N33/483, B81C1/00, G01N27/00
【公开号】CN105460882
【申请号】CN201510885266
【发明人】吴蕾, 唐琳, 金庆辉, 赵建龙
【申请人】中国科学院上海微系统与信息技术研究所
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月4日
[0025](1)使用电化学工作站Gamry reference 600，采用三电极体系进行微电极的电化学表征。
[0026](2)用PDMS将一个塑料腔体粘在基底上，微电极阵列区域位于腔体内。在腔体内注入PBS溶液。
[0027](3)以石墨烯三维微电极位点作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极，三个电极浸入(2)中所述的PBS溶液。
[0028](4)进行电化学阻抗分析时，电化学工作站输出峰值为50mV的正弦交流信号，频率范围从0.01HZ到1MHz。
[0029](5)进行循环伏安分析时，扫描电压范围-0.5V-0.5V，扫描速度100mV/S。
[0030]电化学阻抗检测结果如图3所示，在1kHz时，石墨烯三维微电极结构测到较小的阻抗值为300ΚΩ左右，能够满足细胞检测的阻抗条件。对于传统平面微电极结构来说，经过绝缘层封装之后其电极位点会低于绝缘层的高度，电极阵列将是一个一个的凹陷结构。经本发明提供的三维丘形状凸起结构，不仅增大了电极位点的表面积，同时也保证了待测细胞组织与电极位点的有效接触，避免因细胞与电极之间贴合不严造成的电荷泄漏，提高检测的信噪比。
[0031]循环伏安曲线测试如图4所示，测量多个石墨烯电极，得到了重复性较好的CV图，证实了本发明提供的丘形状石墨烯微电极位点每一个均具有稳定的电荷转移能力。本实施例虽只选取了三个微电极位点，但对数十个丘形状电极位点都适用。
[0032]实施例3
[0033]在石墨烯三维微电极阵列芯片上进行细胞培养和检测
[0034](1)石墨烯三维微电极阵列的表面处理:在接种细胞前，石墨烯三维微电极在75 %的乙醇溶液中浸泡一小时后，紫外灯下晾干;然后将多聚右旋赖氨酸(PDL)溶液按照2yg/cm2的浓度滴加在石墨烯三维微电极阵列表面，常温过夜，再用超纯水冲洗三遍，风干。
[0035](2)石墨烯三维微电极阵列表面接种细胞:用消化液(0.25 %胰蛋白酶，0.02 %m)TA溶液)将常规培养的SH-SY5Y细胞消化、离心、吹打，以1.0 X 107cells/mm3的密度接种于石墨烯三维微电极阵列芯片上。
[0036](3) SH-SY5Y细胞诱导分化:因全反式维甲酸能诱导SH-SY5Y分化为神经细胞，所以培养液采用含有ΙΟηΜ全反式维甲酸、10 %的胎牛血清、0.1 lg/L丙酮酸钠、300mg/L谷氨酰胺的MEM/F12培养基;因维甲酸光不稳定，培养过程中避光，每天换液。
[0037](4)细胞检测:培养5天后，将石墨烯三维微电极阵列芯片固定于多通道电信号检测系统的夹具中，然后将夹具放于倒置显微镜的样品台上，在进行成像观察的同时记录细胞产生的自发动作电位，检测结果如图5所示。
【主权项】
1.一种石墨烯三维微电极阵列芯片，其特征在于利用负性光刻胶制作微柱阵列，在微柱阵列上覆盖单层石墨烯薄膜制作出微电极阵列;所述的微电极芯片包括透明的石墨烯三维电极阵列区域和外围金电极引线引脚两部分。2.按权利要求1所述的芯片，其特征在于以硅片、石英或硼硅玻璃为基底用石墨烯薄膜制作成微电极阵列，利用固化的负性光刻胶微柱将二维的石墨烯顶起形成三维的丘形状微电极位点，而不损坏石墨烯薄膜。3.按权利要求2所述的芯片，其特征在于以硅片作为基底时，采用光刻胶SU8制作微柱阵列，以石英和硼硅玻璃作为基底时，采用聚酰亚胺光刻胶制作微柱阵列；具有光华的边缘。4.按权利要求2所述的微电极芯片，其特征在于丘形状微电极结构阵列利于刚性的微电极位点与柔软的细胞或组织形成紧密的电学耦合。5.按权利要求2或4所述的微电极阵列芯片，其特征在于所述的微电极位点为几个到数十个，为三维凸起。6.制作如权利要求1-3中任一项所述的石墨烯三维微电极芯片的方法，其特征在于具体步骤是: (1)清洗基底:使用Phiranha溶液清洗硅片、石英片或硼硅玻璃片，再用去离子水冲洗干净，氮气吹干，氧等离子体处理5分钟； (2)用Lift-off剥离工艺制作外微电极阵列区域外电极引线和引脚:在基底上旋涂AZ4620，光刻工艺进行图形化，然后溅射钛/金金属层，用丙酮去除光刻胶，留下金属图层； (3)三维微柱阵列制作:旋涂负性光刻胶，控制转速250-350r/min，光刻显影后，经过固化，形成微柱阵列； (4)石墨烯转移:使用化学气相沉积制备的单层石墨烯薄膜，实际为“铜/石墨烯/聚甲基酸甲酯”复合膜;该复合薄膜用过硫酸铵浸泡腐蚀铜箔，待铜被完全腐蚀后，留下支撑层”石墨烯/聚甲基酸甲酯”薄膜;再用去离子水漂洗薄膜，再将完整的薄膜转移到三维微柱阵列上，覆盖阵列并与金电极引线接触;静置一段时间后，用85°C烘箱烘30分钟，然后在丙酮溶液中浸泡去除聚甲基酸甲酯;最后用乙醇、去离子水依次清洗基底； (5)制作石墨烯微电极:旋涂AZ4620P光刻胶，通过光刻和氧等离子体刻蚀制作石墨烯图形，然后用丙酮去除光刻胶，依次用乙醇、去离子水对基底进行清洗； (6)制作电极绝缘层:旋涂SU83005，进行光刻、显影，暴露出石墨烯微电极位点和金电极引脚。7.按权利要求6所述的方法，其特征在于: ①所述的硼硅玻璃片Prex7740; ②三维微柱阵列制作时硅片用SU83005负性光刻胶，石英片或硼硅玻璃片采用PI7510； ③在透明基底上的石墨烯三维微电极阵列便于用倒置显微镜进行观察。8.按权利要求1所述的石墨烯三维微电极阵列芯片的应用，其特征在于进行细胞的培养和检测的结果是: ①所述的石墨烯三维电极位点结构，在ΙΚΗζ时的阻抗值为300k Ω，满足细胞检测的阻抗； ②所述的丘形状石墨稀电极位点每一个具有稳定的电荷转移能力。9.按权利要求8所述的应用，其特征在于具体步骤是: (1)石墨烯三维微电极阵列芯片的表面处理:在接种细胞前，石墨烯三维微电极在75%的乙醇溶液中浸泡一小时后，紫外灯下晾干;然后将多聚右旋赖氨酸PDL溶液按照2yg/cm2的浓度滴加在石墨烯三维微电极阵列表面，常温过夜，再用超纯水冲洗三遍，风干； (2)石墨烯三维微电极阵列表面接种细胞:用0.25%胰蛋白酶和0.02�TA溶液组成的消化液将常规培养的SH-SY5Y细胞消化、离心、吹打，以1.0X 107cells/mm3的密度接种于石墨烯三维微电极阵列芯片上； (3)SH-SY5Y细胞诱导分化:因全反式维甲酸能诱导SH-SY5Y分化为神经细胞，所以培养液采用含有ΙΟηΜ全反式维甲酸、10%的胎牛血清、0.11g/L丙酮酸钠、300mg/L谷氨酰胺的MEM/F12培养基;因维甲酸光不稳定，培养过程中避光，每天换液； (4)细胞检测:培养5天后，将石墨烯三维微电极阵列芯片固定于多通道电信号检测系统的夹具中，然后将夹具放于倒置显微镜的样品台上，在进行成像观察的同时记录细胞产生的自发动作电位。
【专利摘要】本发明涉及一种石墨烯三维微电极阵列芯片、方法及其应用。其特征在于所述的利用负性光刻胶制作微柱阵列，在微柱阵列上覆盖单层石墨烯薄膜制作出微电极阵列；所述的微电极芯片包括透明的石墨烯三维电极阵列区域和外围金电极引线引脚两部分。微电极位点为三维凸起。三维的微电极丘形状(或称为丘陵状)微电极结构利于刚性的微电极位点与柔软的细胞或组织形成紧密的电学耦合，加上石墨烯优异的电学特性，能够提高微电极阵列的电生理检测灵敏度。另外，制作在透明基底上的石墨烯三维微电极阵列便于用倒置显微镜进行观察，便于多种细胞显微成像方法的应用以及结合微流控芯片使用。
【IPC分类】G01N33/487, B81B1/00, G01N33/483, B81C1/00, G01N27/00
【公开号】CN105460882
【申请号】CN201510885266
【发明人】吴蕾, 唐琳, 金庆辉, 赵建龙
【申请人】中国科学院上海微系统与信息技术研究所
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月4日
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