一种基于胞外酶的人工湿地生物膜发育状态测定方法与流程

1.本发明属于人工湿地水处理和生物膜活性评价技术领域，具体地，涉及一种基于胞外酶的人工湿地生物膜发育状态评价方法。


背景技术：

2.人工湿地是20世纪50年代发展起来的一种低投入、高效率、易维护的水处理技术。相比传统水处理技术，人工湿地具有经济环保、高效低耗，且易于维护和管理等优势，因此被广泛应用于生活污水、工业废水、农业废水、矿山废水、垃圾渗滤液和地表径流等各种废水的处理。近年来，为了减轻富含氮磷营养物质的养殖尾水对受纳水体的影响，人工湿地也逐渐被应用于养殖尾水处理。
3.按照水流方式，人工湿地可分为表面流(sf)、水平潜流(hf)、垂直流(vf)三种。人工湿地处理污水时对污染物的吸附、降解和转化主要是由生物膜来完成的。污染物在人工湿地中被去除的过程，就是生物膜中微生物所产生的多种酶催化一系列的生物氧化还原反应过程。人工湿地中微生物主要附着在基质和根系生物膜表面，生物膜因其特有的特征和性能可以作为衡量人工湿地发育程度的关键指标。另外，生物膜的发育程度直接影响湿地系统的处理效率，生物膜生长状况及活性大小将直接影响湿地的净化功能和运行效果，特别是湿地建成初期,如何促进生物膜的发育，提高生物膜的降解性能是人工湿地系统提高处理效力的关键。人工湿地生物膜真正起作用的并不是所观察到的生物膜总量，而只是其中具有较强生物活性的生物量部分。因此，为了充分发挥湿地生物膜的功能，需研究准确而简单的方法测定湿地生物膜微生物活性，评价湿地生物膜的发育状态。现有评价生物膜生长和活性的方法主要包括测定胞外多糖和胞外蛋白质含量方法、dgge分子生物评价方法、水力传导率指标、生物膜的厚度指标、脱氢酶活性指标等。生物膜的厚度不能反映生物膜的功能，因为，当生物膜较小时，所有生物膜都是有活性的，这是生物膜厚度的增加使活性增加，当膜厚增加到大于最佳厚度时，尽管生物膜的总量仍在增大，但活性缺在降低，有研究表明，当载体表面生长的生物膜厚度增加到一定程度后，生物膜靠近载体表面的部分即惰性生物层的微生物难以获得养分，活性差，基本不参与生化反应，包裹于惰性层外的活性生物层则具有较强活性，污染物的去除主要依靠该层中的微生物。生物膜厚度过大反而造成处理效率低。生物膜要在适宜的厚度，太厚容易堵塞，太低没有活性，目前还未有适宜生物膜厚度的报道，且不同的系统的最佳生物膜厚度也不一致，很难确定统一的标准。dgge分子生物学方法、水力传导率、胞外多糖和胞外蛋白质含量等评价指标操作复杂，检测时间较长，不能快速反映湿地生物膜活性。胞外酶是物质降解过程的限制步骤，可以反映生物膜的活性和湿地内物质降解能力和运行状况。而基于脱氢酶活性的评价方法虽然可以反映生物膜中活性微生物量及其对有机物的降解活性，但选择的酶种类单一，不能反映生物膜对具体类别有机物的降解活性，不能反映湿地生物膜代谢种类活性，难以反映人工湿地发育的真实状况。因此，需要建立基于多种胞外酶的潜流人工湿地生物膜活性和发育状态评价方法和综合评价指标体系，根据人工湿地基质和根系微生物新陈代谢特征，同时监测这些酶
和代谢的变化来反映其生物膜活性的高低，将有助于进一步深化对人工湿地净化机理的理解，从而指导人工湿地的运转管理和评价。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明采用的技术方案如下：
5.本发明提供一种基于胞外酶的人工湿地生物膜发育状态测定方法，包括以下步骤：
6.同时测定所述人工湿地根系表面、根区基质和非根区基质生物膜中与氮、磷和有机物降解相关的
‑
胞外酶的活性，
7.基于所述胞外酶的活性解析所述人工湿地生物膜代谢活性和代谢途径，从而获得所述人工湿地生物膜发育状态。
8.在本发明的一些实施方案中，所述与氮、磷和有机物降解相关的胞外酶包括磷酸酶、酯酶、肽酶和糖酵解酶。
9.在本发明的一些具体实施方案中，所述磷酸酶包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、萘酚
‑
as
‑
bi
‑
磷酸水解酶。
10.在本发明的一些具体实施方案中，所述酯酶包括类脂酯酶、类脂酶和酯酶。
11.在本发明的一些具体实施方案中，所述肽酶包括亮氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶和胱氨酸芳胺酶。
12.在本发明的一些具体实施方案中，所述糖发酵酶包括β
‑
半乳糖苷酶、n
‑
乙酰
‑
葡萄糖胺酶、α
‑
葡萄糖苷酶、β
‑
糖醛酸苷酶、α
‑
甘露糖苷酶和岩藻糖苷酶。
13.在本发明的一些实施方案中，所述生物膜包括人工湿地植物根系表面生物膜、根区基质生物膜、非根区基质生物膜。
14.在本发明的一些实施方案中，所述胞外酶的活性是利用酶种类数、酶多样性指数和酶综合指数进行计算的。
15.在本发明的一些具体实施方案中，所述酶种类数是指所有显示阳性的酶种类数。
16.在本发明的一些具体实施方案中，所述酶多样性指数包括酶的香农多样性指数。进一步地，所述酶的香农多样性指数利用以下公式进行计算：
17.h’＝
‑
∑pi*lnpi
18.其中，h’表示酶的香浓多样性指数；pi是某一特定酶的活性与所有酶活性之和的比值。
19.在本发明的一些具体实施方案中，所述酶综合酶指数指所有酶显色反应后的颜色强度的总和。
20.在本发明中，所述人工湿地为处理池塘养殖尾水的人工湿地。
21.本发明的有益效果
22.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
23.(1)本发明通过测定与氮、磷和有机质降解相关的胞外酶的活性和多样性特征，考察启动挂膜阶段湿地基质和植物适应湿地环境过程中微生物活性变化，解析湿地从构建到稳定阶段的生物膜发育成熟过程，可以简单、快速、全面地评价人工湿地生物膜发育状态。为在启动挂膜过程中，对工艺条件进行优化，强化生物膜活性，辅助人工湿地系统快速形成
微生物群落提供基础依据。
24.(2)通过酶活性评价剖析和表征人工湿地运行的生物膜的活性状态，防止过多生物膜生长和生物膜过厚，堵塞基质，以便采取合理措施保持生物膜适当的厚度和最佳的运行状态和处理效果。同时可根据人工湿地基质和根系微生物对污染物的降解特征，养殖污染物的含量和种类等，筛选和接种相应的微生物菌剂，提高湿地对污染物质的降解能力，有助于人工湿地优化，并为人工湿地的建设、运行管理提供科学依据。
附图说明
25.图1示出了开展试验的人工湿地示意图。
26.图2示出了人工湿地根系表面、根区基质、非根区基质胞外酶种类数、酶综合指数和酶多样性指数随启动天数的变化。
27.图3示出了人工湿地非根区基质胞外酶种类数、酶综合指数和酶多样性指数沿湿地流程的变化。
28.图4示出了人工湿地生物膜发育过程中湿地生物膜生物量与酶综合指数线性回归分析结果。
29.图5示出了人工湿地生物膜发育过程中湿地生物膜生物量与酶多样性指数线性回归分析结果。
具体实施方式
30.为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
31.实施例
32.以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
33.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
34.那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
35.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
36.实施例1
37.1材料与方法
38.1.1试验地点
39.选取一组新建的用于处理养殖尾水的人工湿地开展试验，湿地系统(见图1)由五级不同流态的潜流人工湿地单元组成。二级和四级湿地为上行流，分别栽种花叶芦竹和美人蕉，一级、三级和五级湿地为表面流，均栽种再力花。湿地中基质均为陶粒，试验期间，人
工湿地在水力停留时间为5h条件下运行，每天早上6点到下午18点湿地进水12h，其余时段停止进水，阴雨天不运行。
40.1.2胞外酶测定及分析
41.采用酶试剂盒法(api zym
tm strips，biomerieux，marcy l"etoile，france)测定根系表面和基质表面生物膜19种酶活性。于湿地正式开始运行的0d、20d、40d、60d、80d共5次，均匀取二级上行流潜流湿地和四级上行流潜流湿地非根区和根区上层、中层和下层基质，20d、40d、60d、80d共4次采集湿地种植的花叶芦竹和美人蕉根系。
42.取基质样品50g置于250ml锥形瓶中，加入50ml无菌水，振荡30min后，再静置10min，制成基质洗脱液，并分成两份，一份用于胞外酶活性测定，另一份保留20ml基质洗脱液用于基质生物膜生物量测定。随机剪取花叶芦竹和美人蕉根系，将5g根系置于锥形瓶中，加入50ml无菌水，后续处理与基质样品处理方法一致，制成根面洗脱液。分别取65μl基质和根面洗脱液的上清液于api zym试剂条小室中，标记后于37℃培养4h，培养结束后分别加一滴zym a试剂和zym b试剂，待反应5min后，在1000瓦灯泡下照射10s，根据小室内显色程度记录打分结果。采用胞外酶种类数(n)、香农(shannon)指数(h’)和综合酶指数(sei)对酶的活性和多样性进行分析。胞外酶种类数(n)指所有显示阳性的酶种类数，综合酶指数(sei)指所有酶显色反应后的颜色强度的总和，shannon多样性指数(h’)通过公式h’＝
‑
∑pi*ln(pi)计算，pi是某一特定酶的活性与所有酶活性之和的比值。
43.1.3生物膜生物量测定
44.挥发性固体(vss)作为反映生物膜生物量的指标。将gf/f玻璃纤维滤膜(孔径为0.7μm)在马福炉中灼烧5h(温度为450℃),然后称量(w0)并作好标记。分析时,在0.3pa条件下抽滤20ml基质洗脱液,将带有样品的玻璃纤维滤膜在恒温干燥箱中烘干48h(温度为60℃),然后称量(w
60
)；再把称量后的玻璃纤维滤膜在马福炉中灼烧5h(温度为450℃),然后称量(w
450
)。用电子天平称量(精确到0.01mg)。计算每克基质的生物膜生物量。vss＝(w
60
‑
w
450
)/s，s为基质生物量。
45.2结果与分析
46.2.1启动期湿地胞外酶活性动态特征
47.启动过程中，随运行时间延长，人工湿地植物根系表面、根区基质、非根区基质生物膜检测到的胞外酶种类数(n)、shannon指数(h’)和综合酶指数(sei)均呈逐渐增加趋势(图2)，其中，从20d
‑
80d，植物根系表面酶种类数由6种上升到15种，shannon指数(h’)由1.59上升到2.55，综合酶指数(sei)由9升高到37；从0d
‑
80d，根区基质酶种类数由5种上升到15种，shannon指数(h’)由1.61上升到2.55，综合酶指数(sei)由5升高到38；非根区基质酶种类数由5种上升到9种，shannon指数(h’)由1.12上升到2.13，综合酶指数(sei)由2.5升高到22。由变化趋势可以看出，启动60d后，植物根系和根区基质胞外酶种类数(n)、综合酶指数(sei)和shannon指数(h’)增高幅度均变缓，逐渐趋于稳定，表明植物根系和根区基质在60d基本达到稳定，非根区基质胞外酶种类数(n)在60d基本达到稳定，但其综合酶指数(sei)和shannon指数(h’)持续增高至80d仍未达到稳定状态。
48.从单种酶的变化趋势可以看出(表1、表2)，湿地启动的前20d，湿地根区基质、非根区基质以及根系表面均仅可检测到碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、萘酚
‑
as
‑
bi
‑
磷酸水解酶、酯酶、类脂酯酶、亮氨酸芳胺酶等六种酶，表现出对有机磷和有机氮的降解能力。湿地启动运
行至40d，更多的糖发酵酶和肽酶类胞外酶相继被检测到，表明随着挂膜过程，蛋白质和多糖等胞外聚合物在根系和基质表面形成和积累，比较准确地判定和表征了启动过程中生物膜的发育形成稳定状态，以及生物模上不同功能微生物对污染物降解能力动态变化过程。
49.表1非根区基质胞外酶活性
[0050][0051]
注：1.阴性反应：0；阳性反应：1～5。
[0052]
表2植物根系表面和根区基质胞外酶活性
[0053]
[0054][0055]
注：1.阴性反应：0；阳性反应：1～5。
[0056]
如图3所示，两级上行流湿地内，非根区基质胞外酶种类数、h’多样性指数和sei指数均由下层至上层逐渐升高，上层基质最高，反映了启动期湿地生物膜发育过程中上层基质首先成熟稳定。
[0057]
根系表面、根区基质以及生物膜检测到的胞外酶种类数(n)、shannon指数(h’)和综合酶指数(sei)均显著大于非根区(p<0.05)，但根系表面与根区基质之间差异不显著(p>0.05)。且至80d实验结束时，根系表面和根区基质比非根区基质生物膜检测到多的酶种类全部为糖酵酶，包括：n
‑
乙酰
‑
β
‑
氨基葡萄糖苷酶、β
‑
葡萄糖醛酸酶、α
‑
甘露糖苷酶和岩藻糖苷酶。利用本发明计算的酶种数(n)、酶综合指数(sei)和多样性指数(h’)等指标，反映了湿地启动20d后，随着植物根系快速生长和代谢能力增强，根系表面酶种类和活性迅速提高，同时根系生长过程中，植物根系与基质结合牢固，与基质共同形成复杂的空间结构，最终根区基质和根系表面生物膜产生的胞外酶活性和种类基本一致，表现出稳定状态，体现了启动过程中植物根系促进湿地内部微生物生长以及湿地植物根系
‑
基质互作形成生物膜的动态过程。结果如表3所示。
[0058]
表3非根区基质、植物根系表面及根区基质胞外n、h’和(sei)差异
[0059][0060]
注：*p<0.05，nsp>0.05。
[0061]
2.2启动期湿地胞外酶与基质生物膜的关系
[0062]
湿地启动过程中，湿地基质生物膜生物量与基质酶综合指数和多样性指数均显著正相关(r2＝0.337，p＝0.000和r2＝0.213，p＝0.004)(图4和图5)，反映了人工湿地生物膜生长发育中生物膜不断积累和代谢活性逐渐增强的过程是一致的。可通过本发明检测人工湿地内基质生物膜多种酶活性和计算酶综合指数和多样性对相应废水中有机物的处理效能以及对哪一类污染物的去除降解能力进行预测。这些结果提示.在用人工湿地处理养殖尾水时，可针对养殖尾水的特性，添加不同的促进剂提高对相应种类污染物的去除。
[0063]
以上结果表明：
[0064]
本发明提出了人工湿地酶种类数、酶综合指数和多样性指数等指标形成的酶综合评价法，该方法实验操作简单、快速，数据分析方法简单且具有代表性，可以作为预测人工湿地基质生物膜活性的有效指标，解析湿地基质生物膜降解能力和活性状态，为处理养殖
尾水人工湿地发育运行状态监测提供了一种新的实用方法。
[0065]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。