具有酰胺骨架的寡聚核苷酸的制作方法

专利名称：：具有酰胺骨架的寡聚核苷酸的制作方法合成的寡聚核苷酸与RNA或单链DNA之间的高度特异性反应已在分子生物学中有许多应用。寡聚核苷酸在克隆、诊断分析中用作杂交探针，且在聚合酶链反应(PCR)技术中用作必需的引物。通过WatsonCrick碱基配对原则控制结合的特异性。根据这一特征，只需知道目的RNA或DNA的序列便可几乎直接地设计寡聚核苷酸。作为这一有吸引力的原理的进一步扩展，已经研究将寡聚核苷酸与其互补mRNA序列相结合作为抑制特定蛋白产物的转录过程的新工具。Zamecnik和Stephenson在1978年阐明了这一方法抑制被感染的鸡成纤维细胞中劳斯肉瘤病毒的生长中的实用性(Zamecmik，P.C.；Stephenson，M.L.Proc.NatlAcad.Sci.U.S.A.1978.75，280)。这一开拓性工作促使了该领域研究的发展，并对扩展这一理论用于治疗产生了更多兴趣。由于所用的寡聚核苷酸剂与mRNA靶中包含的遗传信息的意义互补(相反)，所以这种新方法被称为“反义DNA”技术。硫代磷酸酯是广为人知的反义化合物。它们是用硫代替磷酸双酯基团中的一个氧的骨架类似物。这一保守修饰为分子提供了核酸酶抗性并使其在细胞培养物及动物模型中显示出生物学活性。硫代磷酸酯反义药物已作为抗病毒或抗癌药进入临床实验评价阶段。尽管硫代磷酸酯反义药物的潜力是有前途的，但由于副作用的原因，需要新型的反义药物。特别是由于硫代磷酸酯的聚硫酯骨架是离子型的，所以它们表现出非反义副反应。这些副反应影响到蛋白质的结合(Stein，C.A.；Narayanan，R.CurrentOpinioninOncology，6(1994)587)、免疫细胞及转录因子的激活(Branda，R.F.；Moore，A.L.；Mathews，L.；McCormack，J.J.；Zon，G.Biochem.Pharmacol.1993，8，33；以及McIntyre，K.W.等AntisenseRes.Devel，1993，3，309)，并且由于部分互补结合，引起非目的序列的RNA酶H的裂解(Giles，R.V.；Spiller，D.G.；Tidd，D.M.AnticancerDrugDesign1993，8，33)。为了降低离子型骨架引起的非反义活性，已经合成了一些掺入几个用酰胺代替磷酸二酯连接基团进行修饰之残基的寡聚核苷酸(Burgess，K.；Gibbs，R.A.；Metzker，M.L.；Raghavachari，R；J.C.S.Chem.Commun.1994，915；Chur，A.；Holst，B.；Dahl，O.；Valentin-Hanesn，P.；Pedersen，E.B.；Nu-cleicAcidRes.1993，21，5179；Idziak，I.；Just，G.；Damha，M.；Giannaris，P；Tet.Lett.1993，34，5417；DeMesmaeker，A.；Waldner，A.；Lebreton，J.；Hoffmann，P.；Fritsch，V.；wolf，R.；Freier，S.；Angew.Chem.Intl.Ed.Engl.1994.33，226)。将这些修饰后的连接基团掺入单链DNA分子通常会引起其与互补RNA或DNA的结合亲和力下降。但还未报道过用酰胺基团全部取代磷酸二酯基团的实例。另一类具有较高结合亲和力的类似物是肽核酸(PNA)(Nielsen，P.；Egholm，M.；Berg，R.；Buchardt，O.；Science.1991，254，1497)。这些分子含有与肽骨架而不是糖—磷酸骨架相连的常见核酸碱基—腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。尽管这类化合物具有与DNA和RNA的高度结合亲和力，但这类化合物与反向平行互补及平行互补的RNA序列的结合特异性差。另外，这种分子的水溶性差，使之成为实际应用中的缺陷。因此，需要一种其骨架连接基团具有多种特征的反义分子，即连接基团应对酶的裂解稳定，应为中性从而可避免与多阴离子结构相关的副作用，当与RNA结合时应具有可接受的亲和性及特异性，并且应具有所需的物化性质，如水溶性。本发明的反义分子满足了这些要求。与现有技术不同，本发明的反义分子是一种新型的寡聚核苷酸，其中整个磷酸二酯连接而成的骨架被酰胺连接而成的骨架所代替。本发明提供了一类新型的寡聚体(寡聚核苷酸)，它是由被酰胺连接基团连接起来的修饰核苷单体单位组成的。可用例如固相或溶液偶联法通过单体中间体(也是本发明的一部分)寡聚反应来合成这些化合物。由于本发明的特异结构，此处公开的反义分子具有稳定性及水溶性方面的优点，并可避免离子的副作用及非特异性蛋白结合。具体地说，本发明目的在于具有下列结构的寡聚体式I中，R1可为H，含有一至四个碳原子(C1-C4)的低级烷基，含有一至十八个碳原子(C1-C18)的酰基，或羟基—低级烷基；R2为H，芳烷基或含有一至四个碳原子(C1-C4)的低级烷基；B为选自包括腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的核苷碱基；X可为H、OR1、NHR2或NH-酰基；Y可为OR1或NHR2；以及n可为5至25的任一数字。该寡聚体能够与所选的mRNA序列结合。优选地，所述寡聚核苷酸化合物具有与所选的RNA序列互补的碱基序列。还包括本发明化合物的盐。R1可具体地为甲基、乙酰基或羟乙基。在一具体实施方案中R2为H，X为H、OR1或NHR2以及R1，B和Y同上式I中所定义的。在一优选化合物中R1和R2均为H或R1为甲基、R2为H2在一优选的组合中X为NH2或NH-酰基，Y为OH或NH2，R1为H或酰基，R2为H以及n为6—13。另外，具有上述结构但在B位上具有适当保护的核苷碱基(下面定义为B′)并且其中m(而不是n)为0至5的寡聚体也是本发明的一个目的，特别是其中m为0、1或2。这样的寡聚体可用作其中n为5至25的寡聚体的中间体。式I的寡聚体是由被酰胺连接基团连接起来的经修饰的核苷单体组成的。本发明的寡聚体适用于与寡聚体相关的任何用途，特别因为它比未修饰连接基团的寡聚体提高了稳定性，比其它类型已修饰连接基团的寡聚体提高了特异性和水溶性。另外，按照本发明的方法可以获得其所有核苷组分被酰胺连接基团连接的寡聚体。由于这些寡聚体具有酰胺连接基团，因此可装配成稳定、溶于水、特别是有核酸酶抗性的反义化合物。因此，本发明的寡聚体可用作反义治疗药，与目的mRNA结合阻断或减低目的蛋白的生成。按照Akhtar和Ivinson在NatureGenetics，19934，215中阐述的方法进行反义治疗。作为设计反义寡聚体的实例，可选择引起不良情况或与不良情况相关的目的蛋白，然后用已知方法获得该蛋白相应的基因或mRNA的核苷酸序列，从而可设计出与该序列的一部分互补的寡聚体。可根据mRNA编码蛋白这一基础来确定mRNA序列，该蛋白的翻译需被阻断，从而降低或消除该蛋白的生成，来减低由于该蛋白的存在所引起的不良作用。可通过用遗传密码翻译被编码蛋白质的序列来测定未知的mRNA序列。如果不知道蛋白质的序列，则可用已知技术分离蛋白质并测定其序列。另外，可用已知方法鉴别、分离编码该蛋白的mRNA或DNA并测定其序列。该寡聚体的优选大小是在约7至约27个，特别是约8至约15个单体(n＝7-13)的范围之内。当用下面提供的本发明方法来制备使之具有本发明的酰胺连接基因时，这些反义寡聚体可形成稳定的反义化合物，然后可施用该化合物来减轻与靶蛋白的存在相关的状态。本发明寡聚体作为反义化合物特别适用于与内在的或外来的不良或过量蛋白质的生成相关状态的治疗，并且适用于抑制病毒或癌细胞的增殖。设计与靶基因的mRNA互补的反义寡聚体，并使其与RNA结合来阻止RNA的翻译，从而减低或阻止靶基因所编码的蛋白质的合成。因此，在生理条件下与核酸稳定结合的能力代表了反义功效。另外，反义化合物必须具有适当的序列结合特异性，以便与靶基因的特异性mR-NA相结合。最后；反义化合物必须充分溶解才能在生理下有效并能接触靶mRNA。这些寡聚体还在PCR反应中用作PCR引物，并在PCR中具有稳定和特异性结合的优越性，还在使用核酸杂交技术的诊断实验中用作探针。可用任何常规方法修饰本发明寡聚体的3′—和5′—未端残基使该化合物更适合于固相合成或得到所需的物化性质。具有本发明连接基团的寡聚体的一个具体应用是用于色素沉着过度的反义治疗中。色素沉着过度是黑素细胞(色素细胞)中酪氨酸酶的过度生成引起的。加入具有与编码酪氨酸酶的mRNA相关部分(Miiller，G.；Ruppert，S.；Schmid，E.；Schiitz，G.EM-BO1988，7，2723—30)相应的序列的本发明寡聚体，抑制酪氨酸酶的生成，从而消除有关细胞中的色素沉着过度(Ando，S.；Ando，O.；Suemoto，Y.；Mishima，Y.J.Invest.Dermatol.1993，100，1505—1555)(Kuzumaki.T.；Matsuda，A.；Wakamatsu，K.；Ito.S.；Ishikawa，K.Expt.CellRes.1993，207，33—40)。反义寡聚体减低色素沉着过度的效力可用基于细胞的反义分析来测定，例如实施例11中的分析。低级烷基是指甲基、乙基、丙基、或丁基。芳烷基是指芳香基取代的烷基，例如苄基。酰基是指通过除去羟基基团从有机酸衍生的有机残基，例如脂肪酸或芳香酸(分别如乙酸或苯甲酸)，如需要，可以是取代形式或是杂环芳香酸，优选含有至少一个杂原子O、S或N的5至6元环，如2—呋喃羧酸或2—吡啶羧酸。羟基低级烷基是指如羟乙基、羟丙基这样的基团，其中羟基基团可以是游离的或者是被常用的保护基如酰基或成醚基团包括甲硅烷基醚所保护的羟基基团。式I的碱基B可包括已知天然的或经修饰的嘧啶及嘌呤核苷酸碱基的任意组合。优选的核苷酸碱基是天然的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、以及尿嘧啶碱基。也可使用本领域中已知的那些经修饰的碱基，如7—去氮腺嘌呤、5—氮胞嘧啶、或6—巯基嘌呤。所选择的反义寡聚体碱基序列是与所选择的mRNA互补的寡聚体碱基序列。一旦获得所需的碱基序列，则可用本发明的中间体来制备本发明反义寡聚体。制备这些中间体，并按下面的方法(这也是本发明的一部分)适当地连接在一起。可用常规的热解链技术测定寡聚体的RNA结合性质。在另一方面，本发明目的在于具有下式的中间体化合物式II中，R1’是任何常用的羟基保护基如有一至四个碳(C1-C4)的低级烷基、有一至十八个碳(C1-18)的酰基、羟基低级烷基、或苄基；R2是H、芳烷基或(C1-C4)烷基；R3是氨基保护基；以及R4是H或酰基保护基。B1是适当保护的核苷碱基，如N—苯甲酰或N—乙酰胞嘧啶，N—苯甲酰腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶，或N—乙酰或N—异丁酰鸟嘌呤。式II的化合物是一种新中间体，它用于合成其所有核苷组分被酰胺连接基团连接的寡聚体。因此，这些式II的关键的中间体以及用式II的中间体制备式I的化合物的方法是本发明的一个目的。在优选的式II化合物中，R3是9—芴基甲氧羰基、叔丁基氧羰基、苄氧羰基、烯丙氧羰基、三苯甲基、或4，4′—二甲氧三苯甲基。在另一个优选化合物中，R4是叔丁基、含有一至四个碳的低级烷基、苄基、苯基、或2—三甲基甲硅烷基乙基。优选的R3与R4的任何结合形成了本发明化合物。式II中的每种化合物具有选自上述碱基的单个碱基作为其核苷碱基。在一具体实施方案中R2为H。另一种本发明的中间体化合物具有下式其中R7是羟基保护基；R4是H，或酰基保护基；R1’是任何常用的羟基保护基；以及B′是适当保护的核苷碱基。式I的寡聚体及其药用盐可作为药物，例如以药物制剂的形式。含有反义寡聚体的药物制剂可以局部给药，例如真皮内给药或作为软膏涂在皮肤上，经注射或随时间缓慢输注的肠胃外给药。可以静注、腹膜内、肌内、皮下或口服给药。可与治疗上的惰性载体配制，制备式I寡聚体或其药用盐的药物制剂。肠胃外给药制剂包括无菌水或非水溶液、悬浮液、以及乳液。非水载体的例子是丙二醇、聚乙二醇，植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐水或缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、加乳酸盐的林格氏溶液、或混合油。静注赋形剂包括液体及营养补充剂、电解质补充剂、例如基于林格氏葡萄糖的那些，等等。特别是，可使用能向细胞运输寡聚体并进入细胞的载体，例如脂质体、聚乙二醇化的脂质体、或阳离子脂类。还可存在保护剂或其它添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等。通常参见Remington’sPharmaceuticalScience，18thEd.，MackEds.，1990。特别是，本发明包括减低细胞中靶蛋白的生成的药物组合物，其中包括有效量的任何上述式I化合物及药用载体，(该化合物在所述细胞中与编码靶蛋白的核酸(例如mRNA)序列有效地结合并减低所述蛋白质的生成)。含有式I化合物或其药用盐和药用载体的药物制剂以及制备该药物制剂的方法也是本发明的目的。该方法包括将式I化合物或其药用盐与治疗上惰性的载体物质相混合并将这种混合物制成盖仑制剂的给药形式。如上所述，式I化合物及其药用盐可用来减低细胞中靶蛋白的生成。可由本领域普通技术人员不经过多实验来确定反义寡聚体的给药剂量范围。通常，适宜的剂量是足以产生所需效果的剂量。剂量不应太大以至引起有害的副作用，如不希望的交叉反应、过敏性反应等等。通常，剂量应随年龄、身体条件、性别以及病人的病情发展、禁忌症(如果有)、免疫耐受性以及其它变量来改变，应由每个医生进行调节。将用下列实施例进一步描述本发明，但不意味着对本发明有任何限制。单体链节的合成式II关键中间体的最直接合成是用核苷，如腺苷、尿苷、鸟苷、以及胞苷作为原料，然后设计一种方法用碳取代基代替C-3′的羟基。已经利用类似的方法用自由基化学合成了2′—脱氧类似物。(Fiandor，J.；Tam，S.Tet.Lett.1990，31，597)。但在核苷系列中，同样的游离基反应不能达到所需的立体特异性。下面的新合成法可具体解决这一问题(概要图A)。原料为市场上买得到的D—木糖。封闭C-1与C-2处的OH基使之为缩酮，用伯醇的常规保护基封闭C-5羟基(R7)，例如三苯甲基或二甲基叔丁基甲硅烷基，或优选磺酰基，例如甲苯磺酰基(Ts)、甲基磺酰基(Ms)或三氟甲基磺酰基(Tf)。然后用常规方法将剩下的OH基氧化成酮(IV)，例如DMSO/乙酸酐法或TEMPO法。IV中的酮与Wittig或Homer型试剂烯化，生成顺式及反式不饱和酯(V)的混合物。R4是常规酰基保护基。可用于本发明的酰基保护基是其中R4与其所连接的氧形成可水解的酯的那些保护基。催化氢化所得混合物V提供了具有核糖(ribo)构型的所需产物VI。这种高度的立体特异性是通过双环系统刚性构象来控制的，它只允许试剂从外向攻击。VI中的缩酮水解然后酰化生成糖基乙酸酯VII，其中R8为烷基或芳基，它可通过常用方法直接用于核苷偶联反应。在β—核苷的合成中使用适当保护的核—碱基的甲硅烷基化形式、呋喃糖基乙酸酯以及活化剂如三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸盐、氯化锡或其它Lewis酸催化剂，这些步骤是本领域中广为人知的。例如中间体VII可用于制备各种核苷VIII，包括带有天然核—碱基的那些，例如带有胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和腺嘌呤；以及带有非天然碱基的那些核苷酸，例如带有7—去氮腺嘌呤、5—氮胞嘧啶、6—巯基嘌呤等。可通过用叠氮化物或邻苯二甲酰亚胺基团取代磺酸酯而轻易地将氮原子引入VIII的C-5′位上。然后还原叠氮化物，如选择性氢化，或使邻苯二甲酰亚胺基团解封，从而生成胺IX。对于其中R2为氢的通式X化合物来说，可通过已知步骤由式IX的化合物轻易获得，其中涉及的试剂为如氯甲酸9—芴基甲基酯、N—(9—芴基甲氧羰基氧基)琥珀酰亚按、2—(叔丁氧羰基氧亚氨基)—2—苯基乙腈(BOC—ON)、氯甲酸苄酯、或4，4′—二甲氧三苯甲基氯。对于其中R2为低级烷基或芳烷基的通式X化合物来说，可通过还原胺化作用和氨基保护步骤从式IX的化合物轻易获得。这时，最后除去X中的酯基，例如氢化除去苄酯后，为寡聚体的合成提供了适当保护的单体链节(X，R4＝H同式II，其中R1’＝-COR8)。应指出，在核苷形成步骤前还可以引入C-5氨基功能团。例如，XI是各种核苷更通用的中间体，它相当于其中R1’＝-COR8的通式II。按照概要图B制备其中R1’＝低级烷基、苄基、被保护链烷醇(羟基—烷基)，以及R4＝H的式II化合物。该路线的关键是从式VI的化合物(参见概要图A)制备4—戊烯基糖苷中间体XIV。因此，用4—戊烯基—1—醇和TMS—三氟甲磺酸盐处理中间体VI，生成内酯XII。可用三乙胺—甲醇—水混合物处理使内酯打开生成羟酸，可通过常规的烷基化方法使羟酸转化成通式XIII的化合物。在C-2处OH基这一简单烷基化的过程中，XIII中端基异构中心处的戊烯基烷氧基可以作为封闭基团(例如在氢化钠的存在下用烷基卤化物或被保护的W—OH—烷基卤衍生物的反应)，但在核苷偶联步骤中可被重新活化。XIII中加入酸保护基后(例如苄基)，将核碱基引入糖部分(其中已在C-2处含有所需的烷基取代基)(见式XIV)。也可按照本领域中的已知方法将戊烯基糖苷转化成其它离去基团例如乙酸酯或卤化物。该方法的实例示于路线10中。按照概要图A讨论的方法也可将式XV的化合物转化成关键的中间体XVI(II，其中R1’＝低级烷基、苄基、被保护的烃基—烷基以及R4＝H)。作为另一变化方案，引入核碱基之前可将XIV先转化成XVII，这是一种更常用的中间体。在2′—OH位引入烷基的另一条合成路线示于概要图C。在该路线中，最通用的中间体是XIX，它可通过XVIII羧基的选择性烷基化来获得，而XVIII是通过水解VIII中的酯基制得的。为了避免核碱基保护基同时水解，可使用酶法或更有选择性的碱，例如三甲基硅烷醇钾(Potassiumtrimethylsilanoate)。向2′—OH位引入所需的取代基后，可按照概要图A中讨论的方法将化合物XV化成关键的中间体II，其中R1′＝低级烷基、苄基、被保护的羟基—烷基，R4＝H。概要图A概要图B概要图c寡聚体的合成可通过固相法或常规液相偶联法将通式II的经适当保护的单体链节装配成寡聚体。通过选择适当的连接臂或树脂，可合成C-末端为游离羧酸(Y＝OH)或酰胺(Y＝NH2)的寡聚体。例如用羟甲基型树脂(例如Wang树脂)，酸解则生成作为酸形式的寡聚体；氨解则会生成酰胺。另外，使用Rink酸连接臂或Rink酰胺连接臂，可通过寡聚体从固体支持物上简单地温和酸解分别获得酸产物或酰胺产物。这些方法对于本领域的技术人员来说是熟知的。作为参考，已公开了许多有关固相法的综述，其中一个是使用了9—芴基甲氧羰基保护的氨基酸(Fields，G.和Noble，R.Int.J.PeptideProteinRes.35，1990，161—214)。用液相法进行二聚体的合成示于实施例5和6中。固相合成的详细步骤示于实施例8中。在该实施例中，出于分析目的将赖氨酸与C—末端偶联。为了制备通式I中X＝H，OH，或OR′的寡聚体，可在装配寡聚体的最后一步使用通式III的单体链节。可用本领域中已知的常规方法从VIII和XV(分别示于概要图A和B)轻易获得这种通用型化合物(III)。例如，可用还原反应(例如使用锂铝氢)将磺酸基还原成氢，或者用苯甲酸钠的取代反应将其变成氧官能团。为了制备通式I中X为NH酰基的寡聚体，在常规的固相寡聚体合成封端步骤中可引入所选择的酰基基团。路线1路线2路线3路线4路线5路线6路线9路线10路线11实施例1胸腺嘧啶链节11的合成步骤1化合物2的合成用40ml无水吡啶处理40.0g1，2—异亚丙基—α—D—木呋喃糖1(pfanstiehl)于125mlCH2Cl2中的溶液，冷却至-5℃。然后用44.2g甲苯磺酰氯于140mlCH2Cl2中的溶液处理30分钟。搅拌过夜，反应混合物经这段时间后温热至室温，用500mlCH2Cl2稀释反应混合物，用800ml水洗涤，最后用400ml盐水洗涤。在Na2SO4上干燥有机层，过滤，浓缩，然后在高度真空下进一步干燥过夜，生成淡黄色固体粗产物75.0g。用CH2Cl2/己烷结晶粗产物，生成56.7g纯甲苯磺酸酯2。1H-NMR(ppm)2.44(3H，甲苯磺酰基的CH3)，5.89(1H，端基异构的—H—1)，7.34&amp;7.80(4H，甲苯磺酰基的苯基)，由此得以确证。步骤2化合物3的合成用84ml乙酸酐处理7.24g甲苯磺酸酯2与130mlDMSO的溶液，然后在室温下将反应混合物搅拌过夜。之后用250mlEtOAc和100ml水稀释，搅拌半小时，分离有机层。用250mlEtOAc洗涤水层。合并有机层并用800ml水洗涤，然后用400ml饱和NaHCO3洗涤。分离有机层，最后用200ml盐水洗涤。在Na2SO4上干燥，浓缩得到粗产物。用硅胶柱进行纯化，用1.1∶1比例的己烷/E-tOAc作为洗脱液，得到5.54g淡黄色油状的酮3。1H-NMR(ppm)2.44(3H，甲苯磺酰基的CH3)，6.15(1H，端基异构的—H—1)；IR(cm-1)1783(酮的峰)；( )EI(MW)342，由此得以确证。步骤3化合物4(a与b)的合成用7.83g(三苯基正膦亚基)乙酸甲酯处理4.01g酮3与80mlCH3CN的溶液。将这种淡黄色反应混合物加热至回流，3.5小时后冷却至室温，并浓缩至干。将所得物质再溶于少量CH2Cl2中，上样于硅胶柱并以己烷/EtOAc(1.9∶1)作为洗脱液进行洗脱，得到2.74g烯烃4a和4b的混合产物。1H-NMR(ppm)2.44(3H，甲苯磺酰基的CH3)，5.8-5.9(1H，烯烃—H)；IR(cn-1)1725(酯的峰)；( )EI(MW)398，由此得以确证。步骤4化合物5的合成在S.T.P.条件下于氢气氛中用10％Pd/C搅拌1.65g烯烃4于20mlEtOAc中的溶液7小时。然后经硅藻土饼过滤溶液。浓缩滤液，得到白色固态粗产物。用MeOH/Et2O结晶粗产物，得到1.18g饱和酯5。1H-NMR(ppm)2.45(3H，甲苯磺酰基的CH3)，3.71(3H，COOCH3)，5.71(1H，端基异构的-H-1)；IR(cm-1)1734(酯的峰)；( )FAB(M＋1)401，由此得以确证。步骤5化合物6的合成在室温下用40ml0.5NNaOH处理7.3g甲酯5于70mlTHF中的溶液，搅拌3小时。反应完成后，浓缩至干，然后于0℃将残余物溶于70mlDMF中。用5.2gNaHCO3和3.3ml苄基溴处理该溶液。将反应液搅拌过夜，同时升至室温。然后，将其浓缩至干，将残余物在200mlCH2Cl2与50mlH2O中分配。分离有机层，用盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥，再浓缩得到粗产物。用2×100ml己烷洗涤，倾去己烷层，在高度真空下干燥固体，得到7g白色固态纯苄基酯6。1H-NMR(ppm)5.70(1H，端基异构的-H-1)，5.14&amp;5.16(2H，PhCH2)；( )FAB(M＋1)477；IR(cm-1)1733(酯的峰)，由此得以确证。步骤6化合物7的合成于-78℃用5ml一溴二甲基甲硼烷处理8.48g苄基酯6于105nlCH2Cl2的溶液并搅拌2小时。除去冷浴，再将反应物搅拌3小时。用10分钟的时间将反应混合物缓缓倒入搅拌好的饱和NaHCO3/THF(4∶1)溶液中(150ml)。然后将溶液再搅拌15分钟。用250mlCH2Cl2和10mlH2O稀释。分离有机层并用100ml盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，浓缩，得到7.8g粗品二羟基中间体。将粗产物溶于18ml无水乙酸酐中并冷却至0℃。然后用8.5ml吡啶处理并搅拌过夜，在这一过程中升至室温。然后在0℃用10mlH2O淬火，再搅拌15分钟。在高度真空下于50℃将反应混合物浓缩至干。将残渣溶于300mlEtOAc中，相继用125mlH2O125ml盐水洗涤。在Na2SO4上干燥EtOAc层，浓缩，得到8.6g泡沫状固态双乙酸酯7。1H-NMR(ppm)6.22(1H，端基异构的—H—1)，2.01&amp;2.04(6H，OCOCH3)；( )FABMW520；IR(cm-1)1746(酯峰)，由此得以确证。步骤7化合物8的合成用2.6ml新蒸氯化锡(IV)处理8.6g双乙酸酯7和7.21gN，O—双(三甲基甲硅烷基)—胸腺嘧啶在105ml二氯乙烷中的悬浮液，将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后于90℃缓缓回流1小时。将反应混合物冷却至室温，用25mlCH2Cl2稀释，用10mlH2O淬火。搅拌30分钟后，用300m1CH2Cl2和150mlH2O进一步稀释。分离有机层，用150ml盐溶液洗涤，在Na2SO4上干燥，浓缩得到8.8g白色泡沫状固态核苷8。1H-NMR(ppm)5.80(1H，端基异构的H—1)，7.92(S，1H，CONHCO)；( )FAB(M＋1)587；IR(cm-1)1694(酰胺峰)，由此得以确证。步骤8化合物9的合成8.8g核苷8于80mlDMF中的溶液与4.94gNaN3一起剧烈搅拌，将反应混合物加热至75℃。将反应混合物在该温度下搅拌6小时。然后冷却至室温，在旋转蒸发仪上于50℃浓缩至干。将残渣在300mlEtOAc和200m1H2O之间分配。分离有机层，用100ml盐溶液洗涤，在Na2SO4上干燥，浓缩，然后用191CH2Cl2/MeOH层析，得到5.7g叠氮化物9。1H-NMR(ppm)5.77(1H，端基异构的H-1)；( )FAB(M＋1)458；IR(cm-1)2107(N3)，由此得以确证。步骤9化合物10的合成在STP条件下，于H2气氛中搅拌50ml甲醇中的化合物9和1.06g10％Pd/C的混合物。将反应混合物搅拌20小时，之后经硅藻土饼过滤。用25mlMeOH洗涤滤饼，将合并的滤液浓缩，得到3.08g氨基酸10，可以就这样用于下一步骤。1H—NMR(ppm)5.77(1H，端基异构的H—1)；( )FAB(M＋1)342；IR(CM-1)3000(COOH峰)，由此得以确证。步骤10化合物11的合成将氨基酸10和3.39gN—(9—芴基甲氧羰基氧基)琥珀酰亚胺于50ml1.4—二噁烷/H2O(1∶1)中的溶液冷却至0℃。然后用1.95gNaHCO3处理并搅拌4小时。除去冷浴，于室温继续搅拌4小时。然后，将反应混合物在旋转蒸发仪上于50℃浓缩至干。将残渣加入200mlEtOAc中。分离水层，用1.0NHCL酸化至pH4，然后冷冻干燥。在反相硅胶柱上用比例为1.86∶1的H2O/CH3CN作为洗脱液纯化粗产物，得到2g白色固态纯化合物11。1H—NMR(ppm)5.64(1H，端基异构的-H-1)，11.4(1H，FmocHN)；( )FAB(M＋1)564；IR(cm-1)1696(酰胺峰)，3401(COOH峰)，由此得以确证。实施例2腺嘌呤链节17的合成步骤11化合物12的合成将512mg叠氮化钠与712mg甲苯磺酸酯盐6于6.6mlDMF中的溶液充分搅拌，将反应混合物加热至65℃。在该温度下搅拌反应混合物5小时。然后冷却至室温，在旋转蒸发仪上于45℃浓缩至干。将残渣在150mlEtOAC和72mlH2O之间分配。分离有机层，用40ml盐溶液洗涤，在Na2SO4上干燥，然后用2∶1己烷/E-tOAc层析，得到467mg叠氮化物12。1H—NMR(ppm)5.82(1H，端基异构的H—1)，5.15(2H，phCH2)；IR(cm-1)2100(N3)，由此得以确证。步骤12化合物13的合成在STP条件下于H2气氛中130ml叠氮化物12于5mlEtOAc中的溶液与58mgLindlaar′s催化剂一起搅拌。将反应混合物搅拌6小时。然后经硅藻土饼过滤。用25mlEtOAc洗涤滤饼，将合并的滤液浓缩，得到100mg胺13，并就这样用于下一步骤。1H—NMR(ppm)5.77(1H，端基异构的H—1)，5.15(2H，PhCH2)；IR(cm-1)无叠氮化物峰，由此得以确证。步骤13化合物14的合成用0.07ml三乙胺和88mgFMOC—Cl相继处理100mg胺13于2ml乙腈中的溶液。将反应混合物在室温搅拌3小时。然后将反应混合物浓缩至干。将获得的残渣再溶于2mlCH2Cl2中，加样于硅胶柱上并用2∶1己烷/EtOAc洗脱，得到95mg纯化合物14。1H—NMR(ppm)5.80(1H，端基异构的H-1)，5.15(2H，PhCH2)，4.20—4.40(3H，Fmoc—CH2CH)；IR(cm-1)3451(NH峰)，1725(COOBn峰)；( )FAB(M＋1)544，由此得以确证。步骤14化合物15的合成于-78℃用2.9ml一溴二甲基甲硼烷处理化合物14于55mlCH2Cl2中的溶液并搅拌1.5小时。反应混合物受热升至0℃，并且再搅拌一小时。然后，用10ml饱和NaHCO3淬火，搅拌30分钟。用300mlEtOAc和75mlH2O稀释反应混合物。分离有机层，用100饱和NaHCO3、100ml盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，浓缩，得到二羟基中间体粗品。将粗产物溶于5.4ml无水乙酸酐中，冷却至0℃。然后用12.0ml无水吡啶处理，搅拌过夜，在这段时间受热升至室温。然后在0℃用10mlH2O淬火，再搅拌15分钟。在50℃于高度真空下将反应混合物浓缩至干。将残渣溶于300mlEtOAc中，用125mlH2O、125ml盐水充分洗涤。在Na2SO4上干燥EtOAc层，浓缩得到粗产物，用9∶5己烷/EtOAc层析，得到3.85g泡沫状固态双乙酸酯15。由1H-NMR(ppm)4.23-4.42(3H，Fmoc-CH2CH)，6.36(1H，端基异构的H-1)；IR(cm-1)3400(宽NH峰)，1740(COOBn峰)；( )FABMW587，由此得以确证。步骤15化合物16的合成用1.0mlTMSOTf处理1.51g双乙酸酯15和9.5gN-6.7-双(三甲基甲硅烷基)-N-6-苯甲酰腺嘌呤于20ml甲苯中的悬浮液，将反应混合物搅拌过夜。然后在45℃于高度真空下浓缩至干燥。残余物在250mlEtOAc和125mlH2O之间分配。分离有机层并用100ml饱和NaHCO3、100ml盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，浓缩，用65∶1CH2Cl2/MeOH层析，得到920mg纯的白色固态化合物16。1H-NMR(ppm)2.02(1H，OCOCH3)，4.20-4.40(3H，Frmoc-CH2CH)，5.95(1H，端基异构的H-1)，6.92(1H，FmocHN)，8.06(1H，Adenine-C-2H)，8.71(1H，腺嘌呤-C-8H)，8.97(1H，NHCOPh)，IR(cm-13400(宽NH峰)，1737(COOBn峰)，1714(NHCOO-尿烷峰)；( )FAB(M＋1)767，由此得以确证。步骤16化合物17的合成在STP条件下于H2气氛下，15mlMeOH中的760mg核苷16和5滴HCOOH的混合物与310mg10％Pd/C一起搅拌。将反应混合物搅拌18小时，然后经硅藻土饼过滤。用25mlMeOH洗涤滤饼，将合并的滤液浓缩，得到粗产物，然后在反相硅胶柱上以比例为1.5∶1的H2O/CH3CN作为洗脱液进行纯化，得到432mg白色固态纯化合物17。1H-NMR(p1m)2.16(1H，OCOCH3)，4.28-4.45(3H，Fmoc-CH2CH，6.03(1H，端基异构的H-1)，7.20(1H，FmocHN)，8.16(1H腺嘌呤-C-2H)，8.75(1H，腺嘌呤-C-8H)，9.42(1H，NHCOPh)；IR(cm-1)3400(宽NH峰)，1709&amp;1720(酸和酯的宽峰)；LR-EI(M＋1)677，由此得以确证。实施例3胞嘧啶链节19的合成步骤17化合物18的合成用0.07mlTMSOTf处理91mg双乙酸酯和76mg三甲基甲硅烷基-N-6-苯甲酰胞嘧啶于2ml甲苯中的溶液，将反应混合物在室温搅拌过夜。用50mlCH2Cl2稀释反应物，用25ml盐水、然后用25nl饱和NaHCO3洗涤，在Na2SO4上干燥，浓缩至干。用甲醇将残余物重量结晶，得到69mg白色固态纯化合物18。1H-NMR(ppm)2.02(3H，OCOCH3)，4.25—4.50(3H，Fmoc-CH2CH)，5.11(2HCH2Ph)，5.63(1H，C-1′-H)，8.66(1H，NHCOPh)；( )FABMW742，由此得以确证。步骤18化合物19的合成将0.65g苄基酯18的溶液溶于65ml二噁烷和0.1％甲酸中，在STP条件下于H2气氛中与285mg10％Pd/C一起搅拌。搅拌反应64小时，然后经硅藻土饼过滤。用200mlCH2C12洗涤滤饼，浓缩所合并的滤液，得到粗产物，用CH2Cl2/MeOH层析，得到356mg白色固态纯化合物19。1H-NMR(ppm)2.10(3H，COCH3)，4.20—4.40(3H，Fmoc—CH2CH)，5.49(1H，C-2′-H)，5.68(1H，C-1′-H)8.23(1H，胞嘧啶-C-6-H)；UV(MeHmax261nm，E＝37,600；max288nm，E＝11,900；IR(cm-1)1706(酸峰)，1671(酰胺峰)、( )FABMW652；C35H32N4O9.1H2O的CHN计算值，C＝62.68，H＝5.11，N＝8.35；实测值C＝62.29，H＝4.92，N＝8.20，由此得以确证。实施例4鸟嘌呤链节23的合成步骤19化合物20的合成用0.12mlTMSOTf处理0.26g甲苯磺酰二乙酯7与0.39g三甲基甲硅烷基-N-2-乙酰基-6-O-二苯基氨甲酰鸟嘌呤于4ml甲苯中的溶液，于50℃搅拌2小时。将混合物冷却至室温，然后用0.9ml三乙胺处理，蒸发成油状。将此粗产物用1∶1的CH2CL2/乙酸乙酯层析，得到216mg纯核苷20。1H-NMR(ppm)2.00(3H，COCH3)，2.29(3H，COCH3)，2.37(3H，PhCH3)，5.11(2H，OCH2Ph)，5.62(1H，C-2′-H)，5.81(1H，C-1′-H)，7.89(1H，嘌呤C-8-H)，8.03(1H，NHOCH3)；( )FABMW848；UV(MeOH)max226nm，E＝38,400，max278nm，E＝11,200；IR(cm-1)3428-3396(宽胺峰)，1740(酯峰)1695(乙酸酯和酰胺峰)；C43H40N6O11S的CHN计算值，C＝60.84，H＝4.75，N＝9.90，实测值C＝60.89，H＝4.64，N＝9.83，由此得以确证。步骤20化合物21的合成将0.85g甲苯磺酰基核苷20与2.3g叠氮化锂与25mlDMF的溶液于60℃搅拌5小明。蒸发反应混合物，然后在CH2Cl2与盐水之间分配。在Na2SO4上干燥有机层，蒸发，用CH2Cl2/MeOH25∶1层析，得到265mg叠氮化物21。1H-NMR(ppm)2.08(3H，COCH3)，2.27(3H，COCH3)，5.14(2H，OCH2Ph)，5.80(1H，C-1′-H)，5.91(1H，C-2′-H)，7.79(1H，嘌呤-C-8-H)，8.88(1H，NH；( )FABMw524；UV(pH1)max260nm，E＝17,400(pH7)max258nm，E＝16,850，(pH12)max264，E＝13,900；IR(cm-1)2102(叠氮化物峰)，1741(酯峰)，1678(酰胺峰)；C23H24N8O7，的CHN计算值，C＝52.67，H-4.61，N＝21.36，N＝21.36，实测值C＝52.11，H＝52.11，H＝4.47，N＝20.95，由此得到以确证。步骤21化合物22的合成在STP条件下于H2气氛下，0.28g叠氮化物于15mlMeOH中的溶液与114mg10％Pd/C一起搅拌。搅拌反应5小时，然后经硅藻土饼过滤。用甲醇洗涤滤饼，再用水洗涤。蒸发滤液，得到192mg粗氨基酸22。步骤22化合物23的合成用0.21ml三乙胺和199mgFmoc-羟基-琥珀酰亚胺先在4℃处理192mg氨基酸22于50ml(1∶1)CH3CN/THF中的溶液，然后于室温处理1小时。将反应混合物蒸发至干，溶于CH2Cl2/MeOH(5∶2)，得到139mg纯化合物23。H-NMR(ppm)2.08(3H，COCH3)，2.15(3H，COCH3)，4.19(3H，FmocCHCH2)，5.61(1H，C-2′-H)，5.87(1H，C-1′-H)；( )FABMW630；UV(MeOH)max261mn，E＝27,600，max288nn；E＝12,500；IR(cm-1)2880-3500(OH与NH宽峰)，由此得以确证。实施例5二聚物30的合成步骤23化合物24的合成用1.1ml-溴二甲基甲硼烷于-78℃处理1.04g甲酯5于12mlCH2Cl2中的溶液，搅拌2小时。除去冷溶，再搅拌反应1小时。将反应混合物缓缓倾入搅拌好的饱和NaHCO3/THF(2∶1)溶液中(75ml)，历时10分钟。将溶液再搅拌20分钟。用150mlCH2Cl2和100mlH2O稀释。分离有机层，用100ml盐水稀释，在Na2SO4上干燥，浓缩，得到7.8g粗品二羟基中间体将粗产物溶于10.0ml无水乙酸酐中，冷却至0℃。然后用5.0ml无水吡啶处理，搅拌过夜，在此过程中溶液受热升至室温。然后，于0℃用10mlH2O淬火，搅拌15分钟。于50℃，在高度真空下浓缩反应混合物至干燥。将残渣溶于150mlEtOAc中，相继用50mlH2O、125ml盐水洗涤。然后在Na2SO4上干燥EtOAc层，浓缩，得到1.07g白色固态二乙酸酯24。′H-NMR(ppm)6.03&amp;6.02(1H，端基异构的-H-1-a&amp;b)，3.07(s，3H，COOCH3)，2.06&amp;2.09(s，6H，OCOCH3)；IR(cm-1)1745(酯峰)，由此得到确证。步骤24化合物25的合成用0.75ml新蒸氯化锡(IV)处理2.85g二乙酯24与2.37gN，O-双(三乙基甲硅烷基)胸腺嘧啶于33ml二氯乙烷中的悬浮液，在室温搅拌反应混合物2小时，然后回流1小时，冷却反应混合物至室温，用250mlCH2Cl2稀释，用10mlH2O淬火。搅拌30分钟后，用50mlCH2Cl2和100mlH2O进一步稀释。分离有机层，用150ml盐溶液洗涤，在Na2SO4上干燥，浓缩，得到粗品产物，用CH2Cl2/MeOH(30∶1)作为洗脱液层析，得到3.15g白色泡沫状固体核苷25。1H-NMR(ppm)5.69(1H，端基异构的H-1)5.40(1H，H-2)，3.64(3H，COOCH3)，2.06(3H，OCOCH3)，1.89(3H，胸腺嘧啶-CH3)；( )FAB(M＋1)511；IR(cm-1)1693(内酰胺峰)，1739(酯峰)，由此得以确证。步骤25化合物26的合成263mg核苷25于3.0mlDMF中的溶液与234mg叠氮化钠一起剧烈搅拌，将反应混合物加热至75℃。在该温度下搅拌反应混合物3小时。然后冷却至室温，在50℃于旋转蒸发仪上浓缩至干。将残余物在100mlEtOAc和50mlH2O之间分配。分离有机层，用25ml盐溶液洗涤，在Na2SO4上干燥，浓缩，用30∶1CH2Cl2/MeOH层析，得到190mg叠氮化物26。由′H-NMR(ppm)5.73(1H，端基异构H-1)，5.48(1H，H-2)，3.07，COOCH3)，1.90，胸腺嘧啶的CH3)；( )FAB(M＋1)382；IR(cm-1)2107(CN3)，1739(酯峰)，1694(内酰胺峰)，由此得以确证。步骤26化合物27的合成将98mg叠氮化物26于3ml甲醇中的溶液冷却至0℃，向该溶液中鼓入无水氨气约5分钟。密封反应瓶，将所得溶液搅拌约12小时，然后除去溶剂，将羟基酰胺粗品用9∶1CH2Cl2/MeOH作为洗脱液进行层析，得到68mg纯品。将该化合物溶于1.0ml吡啶中，用0.1ml乙酸酐于0℃处理。搅拌反应12小时，用数滴水淬火，浓缩至干。用12∶1CH2Cl2/MeOH作为洗脱液层板所得粗品乙酸酯，得到63mg纯27。′H-NMR(ppm)5.77(1H，端基异构H-1)，5.44(1H，H-2)，2.10(3H，OCOH3)，1.90(3H，胸腺嘧啶的CH3)；( )FAB(M＋1)367；IR(cm-1)3408(宽NH峰)，2122(叠氮化物峰)，1705(酯峰)，1719(内酰胺峰)，1665(酰胺峰)，由此得以确证。步骤27化合物28的合成在STP条件下于H2气氛中搅拌3.5ml甲醇中的60mg叠氮化物27和20mg10％Pd/C的混合物。将反应混合物搅拌30分钟，然后经硅藻土饼过滤。用25mlMeOH洗涤滤饼，浓缩所合并的滤液，得到粗品，用9∶1∶0.1CH2Cl2/MeOH/异丙胺层析，得到39mg纯胺28。′H-NMR(ppm)5.56(H，端基异构H-1)，5.41(1H，H-2)，2.10(3H，OCOCH3)，1.89(3H，胸腺嘧啶的-CH3)；( )FAB(M＋1)341；IR(cm-1)3400(宽NH峰)，1740(酯峰)，1692(内酰胺与酰胺宽峰)，由此得以确证。步骤28化合物29的合成用0.12ml1.4-环己二烯处理32mg苄酯8于2.0mlMeOH中的溶液，加15mg10％Pd/C强烈搅拌，将反应混合物于室温搅拌16小时。然后在旋转蒸发仪上浓缩至干，得到28mg羧酸29。由1H-NMR(ppm)5.70(1H，端基异构H-1)，5.00(1H，H-2)；2.43(3H，甲苯磺酰基的CH3)，2.07(3H，OCOCH3)；( )FAB(M＋1)496；IR(cm-1)1747(酯峰)，1695&amp;1700(酸与内酰胺峰)，由此得以确证。步骤29化合物30的合成用0.027ml二异丙基乙胺处理19.5ml酸29和14.5mg胺28于1.5mlDMF中的溶液，然后用24mgHBTU在室温下处理。搅拌反应混合物16小时，然后浓缩至干，将所得残渣溶于少量MeOH中，加样于硅胶柱上，用7∶1∶1∶1EtOAc/MeCN/MeOH/H2O洗脱，得到25mg纯二聚物30。1H-NMR(ppm)5.59&amp;5.68(2H，端基异构的H-1)，5.00&amp;5.04(2H，H-2)，2.42&amp;2.81(6H，两个甲苯磺酰基的CH3)，2.08&amp;2.09(6H，两个-OCOCH3)，1.87&amp;1.89(6H，两个胸腺嘧啶的CH3)；( )FAB(M＋1)819；IR(cm-1)1690至1700(宽峰-酰胺、酯及内酰胺)，由此得以确证。实施例6二聚物链节32的合成步骤30化合物31的合成在STP条件下于H2气氛中加600mgLinelaar′s催化剂，与叠氮化物9于7mlEtOAc中的溶液一起搅拌反应6小时。然后转移到paar氢化器中，于3.5kg/cm2H2压力下振荡6小时。经硅藻土饼过滤反应混合物，用50mlEtOAc洗涤滤饼，浓缩所合并的滤液至干，得到粗产物，用7∶1∶1∶1EtOAc/MeCN/MeOH/H2O层析，得到165mg纯胺31。H-NMR(ppm)5.45&amp;5.63(2H，端基异构H-1&amp;H-2)，5.12-5.16(2H，PhCH2)；( )FAB(M＋1)432；IR(cm-1)3393(NH2峰)，1738(酯峰)，1692(内酰胺峰)，由此得以确证。步骤31化合物32的合成用0.18ml二异丙基乙胺处理179mg酸29与160mg胺31于3.0m1DMF中的溶液，然后于室温下用146mgHBTU处理。搅拌反应混合物3小时，浓缩至干，将所得残渣溶于小量MeOH中，加样于硅胶柱上，用7∶1∶1∶1EtOAc/MeCN/MeOH/H2O洗脱，得到200mg纯二聚物32。1H-NMR(ppm)5.45(2H，端基异构-1)5.82(2H，H-2)，2.43&amp;2.12(12H，两个甲苯磺酰基的CH3&amp;两个OCOCH3)，1.90&amp;1.93(6H，两个胸腺嘧啶的CH3)；( )FAB(M＋1)910；IR(cm-1)1738(酯峰)1693(宽峰—酰胺和内酰胺)，由此得以确证。实施例72′—OMe-类似物35的合成步骤32化合物33的合成在0℃用0.095mlDBU处理218mg甲苯磺酸酯25于2.5mlDMF中的溶液，然后在氩气下用0.15ml苄氧甲基氯处理并搅拌1.5小时。加2mlH2O使反应混合物淬火。搅拌20分钟，然后浓缩至干。将余物溶于150mlEtOAc和50mlH2O中。分离有机层，用25ml1NHC1、50mlH2O、50ml盐水连续洗涤，在Na2SO4干燥，浓缩，得到粗产物，用49∶1CH2Cl2∶MeOH层析，得到250mg纯品。1H-NMR(ppm)5.80(1H，端基异构H-1)，5.41-5.53(3H，H-2&amp;NCH2O)，4.67(2H，CH2pH)，3.67(3H，COOCH3)，2.43(3H，甲苯磺酰基CH3)，2.09(3H，O-COCH3)，1.90(3H，胸腺嘧啶-CH3)，由此得到确证。步骤33化合物34的合成在室温下用2.4ml0.5NNaOH处理245mg化合物33于4.0mlTHF中的溶液，搅拌3小时。然后用1.3ml1NHC1中和，用10mlH2O稀释，冷冻干燥，得到220mg粗羟基酸，不经进一步纯化便可使用。1H-NMR(ppm)5.65(1H，端基异构H-1)，5.33-5.34(2H，NCH2O)，4.59(2H，CH2Ph)，4.26&amp;4.27(1H，H-2)，2.40(3H，甲苯磺酰基的CH3)，1.82(3H，胸腺嘧啶-CH3)；( )FAB-MS(M＋1)575；IR(cm-1)1708(酸峰)1661(宽峰—酰胺和内酰胺)，由此得以确证。步骤34化合物35的合成将50mg羟基酸34于1.5mlTHF及0.11mlDMF中的悬浮液冷却至-10℃，用8mgNaH处理，搅拌20分钟。然后用0.06mlMeI处理，继续搅拌6小时，在此期间温度升至20℃。然后冷却至0℃，用15mlEtOAc稀释，加2ml饱和NH4Cl淬火，搅拌15分钟。用50mlEtOAc和10mlH2O进一步稀释。分离有机层，用25ml0.01NHCl、25ml盐水洗涤，在Na2SO4上干燥。除去E-tOAc后，粗品经7∶1∶0.5∶0.5EtOAc/MeCN/MeOH/H2O经硅胶柱层析，得到26mg纯甲醚—酸。1H-NMR(ppm)5.88(1H，端基异构H-1)，5.48-5.49(2H，NCH2O)，4.71(2H，CH2Ph)，3.94&amp;3.96(1H，H-2)，3.54(3H，OCH3)，2.45(3H，甲苯磺酰基的CH3)，1.91(3H，胸腺嘧啶的CH3)，由此得以确证。步骤35化合物36的合成在氩气下用37mlTMSOTf于100mlClC2H4Cl中的溶液于0℃处理37.0g甲酯5和23.5ml4-戊烯-1醇于150mlClC2H4Cl的溶液，搅拌30分钟。除去冰浴，再将反应液搅拌1小时。然后于0℃向反应混合物中加入200ml饱和NaHCO3(水溶液)。再搅拌该溶液30分钟。用200mlCH2C12稀释。分离有机层，用100ml盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，浓缩，得到粗品。用己烷/乙酸乙酯层析粗品，得到25.7g纯化合物36。( )FAB-MS(M＋1)397；C19H24O7S的CH计算值，C＝57.56，H＝6.10，实测值C＝57.32，H＝6.09，由此得以确证。步骤36化合物37的合成将25.7g化合物36于MeOH/H2O/Et3N(500ml/400ml/100ml)中的悬浮液于室温下搅拌3小时。在旋转蒸发仪上浓缩反应混合物至干，得到28g羟基酸。在0℃将所得羟基酸溶于350ml无水THF中，用经100mlTHF中漂洗过的4.7gNaH处理，搅拌30分钟。然后用60mlMeI处理，继续搅拌2小时，在此期间温度升至室温。然后冷却至0℃，用400mlEtOAc和200ml水稀释。蒸去THF，用1.0NHCl酸化该溶液至pH5，用500mlEtOAc萃取3次。分离有机层，用250ml盐水洗涤，在Na2SO4上干燥。除去EtOAc后将粗品加入220mlpMF中。用9.95gK2CO3和7.5ml苄基溴处理该溶液。搅拌反应3小时。然后浓缩至干，将残渣分配在1000mlEtOAc和200ml中。分离有机层，用盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥，得到粗品。用己烷/乙酸乙酸层析纯化该粗品，得到25.1g纯化合物37。FAB(M)518，由此得以确证。步骤37化合物38的合成1.81gN-碘琥珀酰亚胺和4.68g三甲基甲硅烷基-N-6-苯甲酰基胞嘧啶与3.8g戊烯基糖苷37于70mlCH3CN中的溶液搅拌15分钟。然后用2.8mlTMSOTf于25mlCH3CN中的溶液处理10分钟。3小时后，用300mlEtOAc和50ml10％Na2S2O3水溶液稀释反应液。经硅藻土饼过滤反应混合物，用200mlEtOAc洗涤滤饼，合并滤液，用25ml5％NaHCO3洗涤，再用25ml盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，浓缩至干燥。用CH2Cl2/MeOH层析该粗品，得到2.9g化合物38。从乙醇中重结晶，得到2.2g白色固态纯38。( )FAB-MS(M＋1)648；C33H33N3O9S的CHN计算值，C＝61.20，H＝5.14，N＝6.49，实测值C＝60.86，H＝5.12，N＝6.39，由此得以确证。步骤38化合物39的合成将2.1g甲苯磺酰基核苷38和0.95ml叠氮化锂与32mlDMF的溶液于80℃搅拌4小时。蒸发反应混合物，然后分配于EtOAc和水中。在Na2SO4上干燥有机层，蒸发，用CH2Cl2/MeOH层析，得到265mg叠氮化物39。( )FABMW519，由此得以确证。步骤39化合物40的合成用0.134g20％Pd(OH)2处理1.68g叠氮化物19于40ml二噁烷及20ml水中的溶液，在STP条件下于H2气氛中搅拌。将反应混合物搅拌2.5小时，然后经硅藻土饼过滤。用100ml二噁烷/水(1∶1)洗涤，浓缩所合并的滤液，得到所需氨基酸，将所得的氨基酸与1.39gN-(9-芴基甲氧羰氧基)-琥珀酰亚胺于90mlDMF/H2O(1∶1)中的溶液冷却至0℃。用0.8gNaHCO3处理，在室温搅拌4小时。然后于35℃在旋转蒸发仪上浓缩至干。将残余物溶于50mlH2O和500mlEtOAc中。用1.0NHCl酸化水层至pH4，然后用500mlEtOAc萃取3次。除去EtOAc后，在硅胶柱上用CH2Cl2/MeOH纯化粗产物，得到1.5g白色固态纯化合物40。( )FAB(M＋1)625，由此得以确证。步骤40化合物41的合成在室温下40分钟内向胺13(1mmol，参见路线3)和醛于含有1％乙酸(10ml)的MeOH中的溶液加入NaBH3CN(1mmol)。反应完成后淬火，蒸发该溶液至干，将残余物在EtOAc及饱和NaHCO3之间分配。分离有机层，用盐水洗涤，然后在Na2SO4上干燥，浓缩得到粗品。步骤41化合物42的合成用0.07ml三乙胺和88mgFMOC-Cl处理100mg胺41于2ml乙腈中的溶液，在室温下搅拌该反应混合物数小时。浓缩反应混合物至干。将残余物再溶于2mlCH2Cl2中，加样于硅胶柱上，用己烷/EtOAc洗脱得到纯品。按照步骤14—16(路线3)中所述的实验方法进行步骤42—44。实施例8寡聚体的固相合成在二苯甲基胺(BHA)树脂上用Fmoc-保护的单体通过固相法合成寡聚体(H-T-C-T-C-T-C-T-C-C-T-T-C-T-lys-NH2)[SEQIDNO3]。将树脂溶胀、中和、洗涤，然后与对-[(R，S)-α-[1-(9H-芴-9-基)-甲氧基甲酰氨基]-2，4-二甲氧苄基]—苯氧基乙酸或5-(9-Fmoc-氨基占吨-3-氧基)戊酸相偶联。在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中用20％哌啶处理从与树脂相连的Rink(或Xal)连接臂上除去Fnoc基团后，用Fmoc-N-ε-t-丁氧羰基-L-赖氨酸使所得的胺酰基化，从而获得Fmo-lys(Boc)-Rink(或Xal)-BHA树脂。在DMF中，用4.5当量偶联剂HATU[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐]、10当量碱N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)将第一个单体—Fmoc胸腺嘧啶单体(5当量)—与脱去Fmoc保护的树脂偶联15分钟。偶联结束并洗涤后，在DMF中用含有2％1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)的解封溶液除去临时的Fmoc保护基团(1分钟，7分钟，然后7分钟)。脱保护后，用二氯甲烷(CH2Cl2)和DMF洗涤树脂。用类似于与第一个单体(Fmoc胸腺嘧啶)相偶联的方法使其它单体依次偶联到树脂上。任选地在DMF中用5％乙酸酐进行封端。序列装配完毕后，洗涤树脂并除去末端Fmoc基团。然后，用DMF、二氯甲烷、和甲醇洗涤树脂，真空干燥，待裂解。用50％三氟乙酸于CH2Cl2中裂解完全保护的寡体，用反相HPLC纯化。在室温下用浓氢氧化铵处理寡聚核苷酸4小时，进行最后脱保护。向反应液中加入等体积20％乙二胺/苯酚并再搅拌1小时。在高速真空浓缩器中蒸发样品使反应终止，将得到的混合物用反相HPLC柱纯化。用分析性HPLC测定，纯化后的寡聚体是单一的，所预测的分子量用MALDI-TOF质谱测定得到证实[测定值(计算值)，3711.7(3712.1)]。用类似的固相法也可寡聚合成2′-OMe-类似物。同样，省去赖氨酸偶联步骤，按照上述方法可制备寡聚体(H-T-C-T-C-T-C-T-C-C-T-T-C-T-NH2)[SEQIDNO3]。也就是说，第一个单体直接偶联于连接臂[即H-Rink(或Xal)-BHA树脂]上。按照这种通用的步骤，可制备本发明的寡聚体。实施例9寡聚体的杂交特性热解链研究用配备有电热温度控制器并与IBMPS2/50Z电脑相连接的Cary3分光光度计于260nm测定吸收度对温度的曲线。寡聚核苷酸浓度为1.4μm，缓冲液含有100mMNaCl、10mM磷酸钠及0.1mMEDTA，pH7。用Reducep程序由一阶导数图原理测定Tm值(Koerber，S.C；Fink，A.L.AnalyticalBiochemistry1987，165，75-87)，其中使用了Savitzky-Golay算法(Savitzdy，A；Golay，M.J.E.AnalyticalChemistry1964，36，1627-39)，热动学常数得自与具有线性倾斜基线的双态模型的数据匹配(Petersheim，M；Turner，D.H.Biochemistry1983，22，256-263).条件100mMNaCl，10mM磷酸钠，0.1mMEDTA，pH7.解链温度(Tm′s)℃()指用陡降(rampdown)法测得的Tm值。由此表中可见，新寡聚体(R-RNA)的结合性质与硫代磷酸酯类似物很相似。它们具有相似的结合亲和力，结合极性以及与RNA的结合优先于与DNA的结合。相比之下，Danish-PNA序列表现出更强的结合亲和力。但是，它也表现出很明显的滞后作用以及对与DNA或RNA平行链的不当结合的分辨力差。因此，结合亲和力过强是Danish-PNA的一个缺点。因为其特异性差。R-PNA的2′-OMe衍生物(序列相同)及其互补的反向平行RNA间的双链分子的Tm测定值为43.7℃。实施例10寡聚体的碱基配对特异性热解链研究条件100mMNaCl，10mM磷酸钠，0.1mMEDTA，pH7.解链温度(Tm′s)℃</tables>表中结果清楚地表明新R-PNA系列的结合符合Watson-Crick互补碱基配对原则，C-A，C-C，及C-U的错配显示如所预期的那样大大减低结合亲和力。实施例11细胞中的反义分析按下述方法证明了反义分子能减低黑素细胞中的酪氨酸酶水平。这些反义分子对治疗数种色素沉着过度(黑素沉着过度)疾病具有潜在的实用性，这包括但不限于牛奶咖啡斑、斑痣、炎性后的黑素沉着(疹、药疹)以及硬皮病。用补有10％胎牛血清及50μg/ml艮他霉素的Dulbecco′sModi-fiedEagle′培养基在细胞培养板中培养常用的鼠黑素瘤细胞系(例如B-16)。实验开始时，向低浓度(即低度汇合)细胞培养物中加入反义寡聚核苷酸和对照寡核苷酸，然后连续处理数日。用盐水漂洗细胞，刮板收集，并提取细胞，用Bradford法(Bradford，M.M.Anal.Biochem.1976，72248)分析蛋白水平。基本按照已发表的方法(Pomerantz，S.H.J.Biol.Chem.1966，241161)测定固定量提取蛋白中靶酪氨酸酶的水平。简单地说，提取物与酪氨酸和辅助因子DOPA(3，4-二羟基苯丙氨酸)一起孵育。酪氨酸的3位和5位用氚标记，以便通过生成的氚标记的水量测定酪氨酸酶的活力。用液体闪烁计数法测定氚标记的水量。测定酪氨酸酶的目的是通过计算引起酪氨酸酶水平抑制50％所需浓度来确定每种反义分子的效力。为了控制非特异毒性效应，将细胞以低浓度加入96孔板，然后在反义及对照寡聚核苷酸存在下生长数日。用广泛使用的四唑翁染色法(Mosmann，T.J.Immunol.Meth.1983，65，55)测定细胞的增殖。将使生长速率抑制50％的每种寡聚核苷酸的浓度与使酪氨酸酶活力抑制50％的寡聚核苷酸的浓度相比较。下列情况表示反义效果a)活性寡聚核苷酸在序列上与靶信息RNA互补，b)正义的和错配对照比完全匹配的反义寡聚苷核酸活力低，c)酪氨酸酶活力被不抑制细胞生长的反义寡聚核苷酸的浓度所抑制。序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名F.HOFFMANN-LAROCHEAG(B)街道Grenzacherstrasse124(C)城市Basle(D)州BS(E)国别瑞士(F)邮编(ZIP)CH-4002(G)电话061—6883943(H)传真061—6881395(I)电传962292/965542hlrch(ii)发明名称具有酰胺骨架的寡聚核苷酸(iii)序列数目6(iv)电脑可读形式(A)媒体类型软盘(B)电脑AppleMacintosh(C)操作系统系统7.1(Macintosh)(D)软件Word5.1(2)SEQIDNO1为信息(i)序列特征(A)长度13个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(iii)假设无(iv)反义是(xi)序列描述SEQIDNO1AGAGAGAGGAAGA(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)长度13个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(iii)假设无(iv)反义是(xi)序列描述SEQIDNO2AGAAGGAGAGAGA(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)长度13个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(iii)假设无(iv)反义是(xi)序列描述SEQIDNO3TCTCTCTCCTTCT(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)长度13个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(iii)假设无(iv)反义是(xi)序列描述SEQIDNO2AGAAGAAGAGAGA(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)长度13个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(iii)假设无(iv)反义是(xi)序列描述SEQIDNO5AGAAGCAGAGAGA(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)长度13个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(iii)假设无(iv)反义是(xi)序列描述SEQIDNO6AGAAGUAGAGAGA权利要求1.具有下列结构的寡聚体及其盐其中R1为H、C1-4烷基、C1-18酰基或羟基—低级烷基；R2为H、芳烷基、或C1-4烷基；B为选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶的核苷碱基；X为H、OR1、NHR2或NH-酰基；Y为OR2或NHR2；以及n为5至25的数字。2.根据权利要求1的寡聚体，其中R2为H，以及X为H、OR1或NHR2。3.根据权利要求1或2的寡聚体，其中R1为甲基、乙酰基或羟乙基。4.根据权利要求1的寡聚体，其中R1和R2分别为H。5.根据权利要求1的寡聚体，其中R1为甲基，以及R2为H。6.根据权利要求1至5中的任一项的寡聚体，其中n为6至13的数字。7.根据权利要求1的寡聚体，其中X为NH2或NH酰基，Y为OH或NH2，R1为H或乙酰基，R2为H，以及n为6—13。8.具有下列结构的寡聚体及其盐其中R1为H、C1-4烷基、C1-18酰基或羟基—低级烷基；R2为H、芳烷基、的核苷碱基；X为H、OR1、NHR2或NH-酰基；Y为OR2或NHR2；以及m为0至5的数字。9.根据权利要求8的寡聚体，其中m为0、1或2。10.具有下式的化合物其中R1’为羟基保护基，R2为H、芳烷基或(C1-C4)烷基，R3为氨基保护基；R4为H或酰基保护基；B′为适当保护的核苷碱基残基。11.根据权利要求10的化合物，其中B′为N-乙酰胞嘧啶，N-苯甲酰胞嘧啶，N-苯甲酰腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N-乙酰鸟嘌呤，或N-异丁酰鸟嘌呤残基。12.根据权利要求10或11的化合物，其中R1’为C1-4烷基、C1-18酰基、羟基-低级烷基、或苄基。13.根据权利要求10—12中任一项的化合物，其中R3为9-芴基-甲氧羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、烯丙氧羰基；三苯甲基或4，4′-二甲氧三苯甲基。14.根据权利要求10—13中任一项的化合物，其中R4为叔丁基，C1-4烷基、苄基、苯基、或2-三甲基甲硅烷基乙基。15.具有下列的化合物其中R7为羟基保护基；R4为H、或酰基保护基，R1’为羟基保护基；以及B′为适当保护的核苷碱基残基。16.含有根据权利要求1—7中任一项的化合物以及治疗学惰性载体物质的药物。17.一种减低细胞中靶蛋白生成的药物，该药物包含有效量的权利要求1—7中任一项的寡聚体及药用载体，该寡聚体在所述细胞中与编码靶蛋白的mRNA序列有效结合并减低所述蛋白的生成。18.特别用于减低细胞中靶蛋白生成的药物的制备方法，该方法包括将权利要求1—7中任一项的寡聚体或其药用盐与治疗学惰性的载体物质相混合，并将这种混合物制成盖仑制剂的给药形式。19.根据权利要求1—7中任一项的寡聚体，其用作为治疗活性化合物，特别是用作减低细胞中靶蛋白生成的治疗活性化合物。20.根据权利要求1—7中任一项的寡聚体的用途，用于减低细胞中靶蛋白的生成。21.如前面所述的本发明，特别是如前面所述的化合物，中间体、步骤、配方及方法。全文摘要下式具有酰胺连接基团的寡聚体及其盐其中R文档编号C07H19/167GK1128269SQ95119988公开日1996年8月7日申请日期1995年11月30日优先权日1994年11月30日发明者李文仁,S·Y-K·塔姆申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司