专利名称：用微生物转化体制备的乙醛酸和氨甲基膦酸混合物的制作方法
背景技术：
1.发明领域本发明涉及一种生产乙醛酸和氨甲基膦酸(AMPA)混合物的方法，其中，在存在AMPA和催化剂的情况下，乙醇酸和氧在水溶液中发生反应，其中的催化剂是由表达菠菜中乙醇酸氧化酶((S)-2-羟酸氧化酶，EC1.1.3.15)和表达过氧化氢酶(EC1.11.1.6)的基因工程微生物转化体组成。此方法制备的乙醛酸和氨甲基膦酸混合物，对于生产N-(膦酰甲基)甘氨酸，一种广谱的后应急性(post-emergent)除莠剂，是有用的中间体。
2.相关技术的说明乙醇酸氧化酶，是一种同时存在于绿色植物叶和哺乳动物细胞中的酶，它催化乙醇酸氧化成乙醛酸，同时产生过氧化氢N.E图尔伯特等(生物化学杂志，Vol.181，905-914(1949))首先报导了一种从烟草叶中提取的酶，它能催化乙醇酸经过形成乙醛酸中间体氧化生成甲酸和CO2。加入某些化合物如乙二胺，可限制中间体乙醛酸进一步氧化。典型的氧化过程可用浓度约3-40mM的乙醇酸，在pH值约8的条件下进行。有人报导乙醇酸氧化的最适pH是8-9。还有人报导，草酸(100mM)能抑制乙醇酸氧化酶的催化作用。类似的情况是，K.E.理查逊和N.E图尔伯特(生物化学杂志，Vol.236，1280-1284(1961))曾报导，含有三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)的缓冲液，可抑制在乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化的过程中生成草酸。C.O.克拉盖特，N.E图尔伯特和R.H.伯立斯(生物化学杂志，Vol 178，977-987(1949))还曾报导，乙醇酸氧化酶催化用氧来氧化乙醇酸的最适pH是约7.8-8.6，最适温度是35-40℃。
I.泽立奇和S.奥赫阿(生物化学杂志，Vol 201，707-718(1953))和J.C.罗宾逊等(生物化学杂志，Vol.237，2001-2009(1962))曾报导，在菠菜乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化中，甲酸和CO2的生成是由于H2O2和乙醛酸的非酶促反应所致。他们观察到，加入过氧化氢酶(催化H2O2分解的酶)，通过抑制甲酸和CO2生成，可大大提高乙醛酸的产率。还发现，加入FMN(黄素单核苷酸)可大大增加乙醇酸氧化酶的稳定性。
N.A.弗里格里奥和H.A.哈伯利(生物化学杂志，Vol.231，135-157(1958))已经报导了从菠菜中分离的乙醇酸氧化酶的制备方法和特性。发现这种纯化的酶在溶液中非常不稳定，这种不稳定性是由于黄素单核苷酸(FMN)对酶活性部位的结合比较弱，并且还由于具有酶活性的酶四聚体和/或八聚体解离变成无酶活性的单体和二聚体所致，这些单体和二聚体将发生不可逆的凝集和沉淀。将FMN(黄素单核苷酸)加入酶溶液会大大地增加其稳定性，并且高蛋白质浓度或高离子强度能维持酶的八聚体或四聚体的构型。
还有许多关于乙醇酸氧化酶催化氧化乙醇酸的其它参考文献。下列参考文献中描述了该酶的分离(和测定)方法I.泽立奇，酶学方法，Vol.1，学术出版社，纽约，1955，p.528-532(从菠菜和烟草叶中)，M.Nishimura等，生物化学和生物物理丛刊，Vol.222，397-402(1983)(从西葫芦子叶中)，H阿斯卡和D.戴维斯，生物化学和生物物理学报，Vol.761，103-108(1983)(从大鼠肝中)，以及M.J.埃米斯和K.H埃里斯曼，国际生物化学杂志，Vol.16，1373-1378(1984)(从浮萍属植物中)。关于该酶的结构也有如下报导E赛得兰德等，欧洲生物化学杂志，Vol.173，523-530(1988)和Y.林德魁斯特和C.布兰登，生物化学杂志，Vol.264，3624-3628(1989)。
发明概述本发明涉及乙醛酸(或者它的盐)和氨甲基膦酸(AMPA)(或者它的盐)混合物的制备方法，该方法是通过在水溶液中，并在存在AMPA和两个催化剂的条件下用氧来氧化乙醇酸完成的，所用催化剂是表达菠菜乙醇酸氧化酶((S)-2-羟酸氧化酶，EC1.1.3.15)的基因工程微生物转化体，以及过氧化氢酶(EC1.11.16)。这种乙醛酸和AMPA混合物可用于制备N-(膦酰甲基)甘氨酸，一种后应急性除莠剂。
生物材料库的简要说明申请人根据布达佩斯协议条款，建立了如下的生物材料库保藏物参考名称国际保藏名称 保藏日期构巢曲霉(AspergillusNRRL Y-21000 1992年9月24日nidulans)T17斯德毕赤氏酵母菌 NRRL Y-21001 1992年9月24日(Pichia pastoris)，GS 115-MSP 10多形汉逊氏酵母菌 NRRLY-21065 1993年9月30日(Hansenula polymorpha)，G01其中“NRRL”代表北部研究实验室(Northern RegionalResearch Laboratory)，农业研究机构培养物收集国际保藏库，位于11815N，大学街，Peioria，IL 61604 U.S.A。“NRRL号码”是在NRRL的贮存库中查找培养物的号码。
对优选实施方案的说明一个有关的专利，U.S. 5,135,860(1992年8月4日)，“制备乙醛酸/氨甲基膦酸混合物的方法”(PCT/US92/09419)描述了一种在存在氧，氨甲基膦酸(AMPA)，以及可溶性乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的情况下，将乙醇酸酶促转化成乙醛酸的方法。在pH7-9的范围内，对乙醇酸的酶促氧化反应加入AMPA，将得到高产率的乙醛酸，这是出人意料的，因为据信，未质子化的胺对于与乙醛酸一起形成一个抗氧化的N-取代半胺和/或亚胺复合物是必需的。有人报导，AMPA质子化胺的pKa是10.8(朗氏化学手册，J.A.邓恩编辑，McGraw-Hill，纽约，1979，第12版)，因此，AMPA将主要作为质子化铵离子存在于反应混合物中，预计将不与乙醛酸形成这样的保护性复合物。本发明对以上方法提出了一种改进，以完整微生物细胞(whole microbial cell)作为这种方法的催化剂。
以前报告的用可溶性酶作为生产乙醛酸和氨甲基膦酸混合物的催化剂，存在如下几个问题催化剂不容易回收再用，酶活性不如固定化酶或完整细胞催化系统稳定，以及可溶性乙醇酸氧化酶在将氧充入反应混合物(为增加氧溶解的速度，从而增加反应速度)时不稳定。第二个有关的专利申请，U.S.S.N.08/085,488,1993年7月1日提交的申请，题为“乙醇酸氧化酶生产”(PCT/US94/___)，描述了用本专业人员通常熟知的基因工程技术，构建几个表达菠菜乙醇酸氧化酶以及表达内源性过氧化氢酶的构巢曲霉菌转化体的过程。本发明用这种完整的细胞催化剂生产乙醛酸和氨甲基膦酸混合物，比用可溶性的酶催化剂有以下几个优点(1)完整细胞催化剂在反应结束后，容易从反应混合液中回收再用，而可溶性的酶回收非常困难，并会失去活性；(2)它们比可溶性的酶更稳定，从与可溶性的酶比的催化周转数以及反应结束时回收的酶活性都表明这点；(3)最重要的是，它们对如下反应条件是稳定的为了增加氧溶解速度和增加反应速度，氧气或含氧的气体被充入反应混合液，在相同反应条件下，可溶性的乙醇酸氧化酶很快变性失活。
构巢曲霉转化体的制备是通过首先克隆编码甘醇酸氧化酶的菠菜基因，然后将这种基因导入已经能产生内源性过氧化氢酶的构巢曲霉菌株。得到的转化体可在摇瓶内或者振荡的发酶罐内用基本培养基或富含SYG的培养基培养，并且，为了增强表达乙醇酸氧化酶和/或过氧化氢酶的水平，可额外加入不同的成分，如油酸(OL)，乙醇酸(HA)，或玉米浸出液(CSL)。然后对不同的转化体进行筛选，可通过测定完整细胞(未经处理)的过氧化氢酶和乙醇酸氧化酶的活性，以及通过用细胞作催化剂进行乙醇酸氧化生成乙醛酸的反应来筛选。
在用作乙醇酸氧化生成乙醛酸反应的催化剂时，不必为了增加反应混合物与细胞内酶的接触，而对构巢曲霉细胞作预处理或增加渗透性处理；可能在细胞暴露于反应混合物或其中任何成分时，或者在保存和启用完整细胞催化剂的冷冻和融化过程中，对细胞的某些增加渗透性处理已经发生了。
以前已经证明，可以用构巢曲霉转化体作完整细胞催化剂用于生产乙醛酸(PCT/US93/00077，“用微生物细胞转化体作催化剂，氧化乙醇酸生成乙醛酸”)，其中使用了一个能与乙醛酸形成化学加成产物的胺类缓冲液(例如乙二胺或TRIS)，导致乙醛酸的产率高达98％。在上述情况下，细胞中的内源性过氧化氢酶的浓度足以限制乙醛酸被副产品H2O2氧化成甲酸。在本发明的情况下，AMPA对防止乙醛酸被H2O2氧化较少有效，细胞中的内源性构巢曲霉过氧化氢酶的浓度不足以产生所希望的高产率乙醛酸。已经发现，向用这种完整细胞作为乙醇酸氧化酶活性来源的，含有AMPA的反应混合物中加入额外的可溶性过氧化氢酶(例如来源于黑色曲霉(A.niger或啤酒糖酵母菌(S.cerevisiae))，可使乙醛酸的产率与用可溶性酶或固定化酶时的产率相似。
当以构巢曲霉转化体作催化剂用于乙醇酸/AMPA混合物的氧化过程时，在含有乙醇酸氧化酶的细胞内，既产生了乙醛酸，又产生了H2O2，在不存在外加的可溶性过氧化氢酶的情况下，乙醛酸迅速被氧化成甲酸(例如在实施例2中，甲酸的产率是87％，乙醛酸的产率是1.7％)。出乎预料的是，通过向反应加入可溶性过氧化氢酶的简单步骤，可以得到高产率的乙醛酸，因为(1)通过反应过程产生的乙醛酸和H2O2的相对浓度，在细胞内的比在周围水溶液中的高，(2)构巢曲霉细胞中的内源性过氧氢酶的浓度，一般是通常加入到反应混合物中的可溶性过氧化氢酶浓度的2％-15％。以及(3)H2O2要被可溶性过氧化氢酶分解成水和氧，必须从细胞内部扩散进入周围的水溶液。但是，用以前仅以可溶性过氧化氢酶和可溶性乙醇酸氧化酶作催化剂时(美国专利No.5,135,860，PCT/US92/09419)使用过的相同浓度的可溶性过氧化氢酶，简单地加入到反应混合物中，已经得到了产率高达94％的乙醛酸。
已经用于本发明的第二个微生物细胞催化剂，是一个能表达菠菜乙醇酸氧化酶，以及表达内源性过氧化氢酶的多形汉逊氏酵母菌(Hansenula Polymorpha)(一种甲基营养性酵母菌)转化体。通过在甲酸脱氢酶(FMD)启动子的控制下，将乙醇酸氧化酶基因的DNA片段插入表达载体，已经制备出几种具有足够乙醇酸氧化酶活性的多形汉逊氏酵母菌转化体。用这种载体转化多形汉逊氏酵母菌，选择出了一个能产生高水平乙醇酸氧化酶的菌株，被命名为多形汉逊氏酵母菌GO1(NRRL Y-21065)。
多形汉逊氏酵母菌细胞催化剂典型的制备程序是首先将多形汉逊氏酵母菌转化体接种物在500ml YPD(Difco)，pH4.4中培养生长。然后将此培养物接种到发酵罐中，其中含有10升(L)酵母氮基(YeastNitrogen Base(YBN Difco))(重量百分比)氨基酸(14g)，硫酸铵(50g)和甲醇(100g)，pH5.0。发酵罐运转42.5小时，条件是37℃，旋转速度为400rpm，恒定pH5.0，含40％溶解氧(受控)，气压14psig(磅/英时2)。在发酵终点，加入1.0kg甘油，通过离心收集细胞，用液氮冷冻，-80℃保存。
已经用于本发明的第三个微生物细胞催化剂，是能表达菠菜乙醇酸氧化酶，以及表达内源性过氧化氢酶的巴斯德毕赤氏酵母菌(Pichiapastoris)(一种甲基营养性酵母菌)转化体。通过在例如甲醇诱导的醇氧化酶I启动子的控制下，将含有菠菜乙醇酸氧化酶基因的DNA片段插入巴斯德毕赤氏酵母菌表达载体(pHIL-D4)形成质粒pMP1，已经制备出几种具有足够乙醇酸氧化酶活性的巴斯德毕赤氏酵母菌转化体。用质粒pMP1转化巴斯德毕赤氏酵母菌株GTS 115(NRL Y-15851)，并进行筛选，使线性化的质粒pMP1整合进入染色体醇氧化酶I座位，并且以乙醇酸氧化酶基因取代醇氧化酶基因。下一步是从这样一些转化体中，挑选出具有最大整合拷贝数的表达盒(expressioncassette)。已分离出一个命名为巴斯德毕赤氏酵母菌GS 115-MSP 10株的高拷贝数转化体，存放在NRRL Peoria，Illinois。
巴斯德毕赤氏酵母细胞典型地是通过使接种物在100ml含1％甘油的YNB培养基中生长来制备。在30℃下培养生长48小时之后，将细胞转移到发酵罐中，发酵罐中含有10L由酵母氮基(YBN)(重量百分比)氨基酸(134g)，甘油(100g)，生物素(20mg)组成的培养基。发酵运转条件是pH5.0(用NH4OH控制)，温度30℃，发酵罐旋转速度为200rpm，通气5slpm，气压5psig，溶解氧饱和度不低于50％。当甘油被耗尽后，通过使细胞生长在仅以甲醇(50g)代替甘油的相同培养基内，诱导细胞表达乙醇酸氧化酶。诱导过程中，以酶测定法监测乙醇酸氧化酶的活性。诱导24小时后，先用甘油(1kg)处理，然后收集细胞。收集的细胞在液氮中冷冻，保存于-80℃。
与构巢曲霉转化体不同，在用作氧化乙醇酸生成乙醛酸反应的催化剂之前，需要对多形汉逊氏酵母菌和巴斯德毕赤氏酵母菌细胞转化体进行增加渗透性处理。有各种已知的增加渗透性处理方法可用于处理具有足够乙醇酸氧化酶活性的细胞(见Felix，H分析生物化学，Vol.120，211-234，(1982))；典型的方法是，向含10％湿重的细胞悬液加入0.1％(V/V)“TRITON”X-100/20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)，处理15分钟，然后在液氮中冷冻，再融化，用20mM磷酸盐/0.1mM FMN缓冲液(pH7.0)洗。
当用多形汉逊氏酵母菌和巴斯德毕赤氏酵母菌细胞转化体作氧化乙醇酸/AMPA混合物反应催化剂时，再次发现，为了得到高产率的乙醛酸，加入可溶性黑色曲霉过氧化氢酶同样是必需的。尽管经增加渗透性处理的多形汉逊氏酵母菌或巴斯德毕赤氏酵母菌细胞可达到的过氧化氢酶活性比构巢曲霉菌大10倍左右，但是，这二种甲基营养性酵母菌的内源性过氧化氢酶，与来源于构巢曲霉或黑色曲霉菌的过氧化氢酶相比较，在含有AMPA的反应混合物中分解副产品H2O2的效果较差。加入可溶性黑色曲霉过氧化氢酶，或者对完整啤酒糖酵母菌细胞作增加渗透性处理，作为过氧化氢酶的补充来源，导致与不加入过氧化氢酶的反应相比较，乙醛酸的产量明显增加了。
第四个用于本发明的微生物细胞催化剂，是能表达菠菜乙醇酸氧化酶，并表达内源性过氧化氢酶的大肠杆菌(Escherichia coli)(一种细菌)转化体。这种大肠杆菌转化体的制备方法如Macheroux等在生物化学和生物物理学报，Vol.1132，11-16(1992)中所述。在用作本发明的催化剂之前，这种表达乙醇酸氧化酶活性的大肠杆菌转化体不需要作增加渗透性处理。
用可溶性酶作催化剂的许多缺点，在本申请中都通过使用完整微生物细胞转化体(不需要或需要作增加渗透性处理)作催化剂而消除了。完整细胞催化剂的回收和再利用容易实现，通过从反应混合物中离心或过滤分出催化剂，就可以将它在新的反应混合物中再循环使用；按这种方式，已经得到了高达106的乙醇酸氧化酶的转换数。由于具有吹入气泡给反应混合物供氧，而不会使乙醇酸氧化酶迅速变性失活的能力，使反应速度比不对反应混合物吹入气泡供氧时至少增加了10倍(在用可溶性酶时，可看到吹入气泡通氧引起的酶变性失活)，由于反应速度增加，可显著地降低该方法的生产成本。
用于反应的乙醇酸氧化酶活性(以完整微生物细胞转化体的形式加入的)应该存在于一个有效的浓度之中，浓度通常是0.01至约100IU/ml(国际单位/ml)，优选的是约0.1至10IU/ml。IU(国际单位)的定义是每分钟催化转化1微摩尔底物的酶量。在I.泽立奇和S.奥赫阿，生物化学杂志，Vol.201，707-718(1953)中可找到测定这种酶的方法。这种方法也可以用于检测回收或再循环的乙醇酸氧化酶的活性。反应混合物中过氧化氢酶的浓度应该是50-100000IU/ml，优选的是500-14000IU/ml。优选的情况是，乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶都存在于同一微生物细胞内(在所附的实施例中，构巢曲霉，多形汉逊氏酵母菌，巴斯德毕赤氏酵母菌或大肠杆菌转化体都是这样)。如果细胞中的内源性过氧化氢酶的浓度不足以有效地分解所产生的H2O2(如在所附的实施例中)，可加入其他来源的过氧化氢酶(例如可溶性黑色曲霉过氧化氢酶，或完整的啤酒糖酵母菌细胞)以补充内源性过氧化氢酶不足。此外，过氧化氢酶和乙醇酸氧化酶的浓度应调整在上述范围内，使过氧化氢酶对乙醇酸氧化酶的比率(测定每种酶的IU)至少是约250∶1。黄素单核苷酸(FMN)是一个任选的补加成分，用0.0-2.0mM的浓度，优选的是0.01-0.2mM。
鉴于上述有效的浓度范围，应该意识到本发明的改进方法本身已涉及应用微生物细胞催化剂，并打算包括应用这些在有效操作范围内表达乙醇酸氧化酶和/或过氧化氢酶的所有微生物细胞催化剂，即完整细胞催化剂。因此，对本发明来说，名词“完整微生物细胞催化剂”包括(通过实施例的方式，但不限于此)优选实施方案中的基因工程微生物转化体，还包括从具有高表达能力的天然微生物或突变微生物中选取的菌株，和/或能实际产生上述有效浓度范围酶活性的这些微生物的混合体。
乙醇酸(2-乙醇酸)可从商业途径买到。在本发明的反应中，它的初始浓度在0.10M-2.0M的范围内，优选的范围在0.25M和1.0M之间。它能以酸的形式被使用，也能以其相容的盐的形式使用，所说的相容的盐是一种水溶性盐，它的阳离子不会干扰所需的乙醇酸转变成乙醛酸的反应，或者对以后的乙醛酸产物与氨甲基膦酸形成N-(膦酰甲基)甘氨酸的反应也不会有干扰。适当的和相容的成盐阳离子基团还应容易用试验测定。这些代表性的盐可以是碱金属盐，碱土金属盐，铵盐，取代的铵盐，鏻盐和取代的鏻盐。
乙醇酸转变成乙醛酸的反应可容易地并优选地在水溶性基质中进行。加入氨甲基膦酸(AMPA)，或其适当的盐，使之产生一个在0.01/1.0-3.0/1.0范围内的AMPA/乙醇酸摩尔比(起始量)，优选的范围是0.25/1.0-1.05/1.0。AMPA和乙醇酸在水溶液中结合之后，将此混合液的pH校准至6-10之间，优选地在7.0-8.5之间。在此pH范围之内，通过加入任何相容的非干扰性碱，包括碱金属的氢氧化物，碳酸盐，碳酸氢盐和磷酸盐，可以校准得到所要求的精确的pH值。因为反应过程中反应混合物的pH稍有下降，所以在反应开始时，使pH接近最大酶活性pH范围的上限常常是有用的，此pH大约是9.0-8.5，这样可允许pH在反应过程中下降。pH还可任选地通过分别加入非干扰性无机或有机缓冲液来维持，因为酶活性随pH变化而改变。
已认识到，在水中乙醇酸和乙醛酸是高度离解的，在pH7-10之间，如果不是基本上全部，则大部分是以乙醇酸盐和乙醛酸离子的形式存在。本领域的专业人员还将意识到，乙醛酸(和它的共轭碱，乙醛酸盐阴离子)可能也是以水合物的形式存在的，例如以(HO)2CHCOOH和/或以半缩醛HOOCCH(OH)OCH(OH)COOH的形式，其组合物和它们的阴离子对应部分应该是与乙醛酸和它的阴离子等价的，以达到成为形成N-(膦酰甲基)甘氨酸的适合反应物的目的。
氧(O2)，作为使乙醇酸转变为乙醛酸的氧化剂，可以作为气体加入反应，加入过程可经透氧膜通过在气-液界面搅拌液体，或者在反应混合液中充入(鼓泡)氧气来完成。据信，在绝大多数情况下，反应速率至少部分地受氧溶于水基质速率的控制。因此，虽然氧可以由空气加入到反应中，但优选的是用比较纯的氧，甚至用高压氧。尽管还不知道所用氧压的上限，但可以用高达50个大气压的氧，优选的上限是15个大气压。为了维持氧的高溶解速率(因此有高反应速率)，搅拌是重要的。任何方便的搅拌形式都可使用，例如旋转搅拌。
反应温度是一个重要的可变因素，它既影响反应速率，又影响酶的稳定性。大约0℃-40℃的反应温度都可使用，但是，优选的反应温度范围是从5℃到15℃。在优选的温度范围内操作反应，在反应的终点可得到最高的回收酶活性。温度不应该低到水溶液开始结冰的状态。温度可通过各种通常的方法来控制，例如可以用有夹套的反应容器，并使有适当温度的液体通过此夹套层，但方法并不局限于此。反应容器可以用任何对反应成分惰性的材料构成。
反应液停止与O2接触之后，其中的微生物细胞催化剂，可以通过倾析法、过滤或离心被分离出，并再利用。黄素单核苷酸(FMN)可以任选地通过使反应液与活性碳接触而被除去。含有乙醛酸和氨甲基膦酸(被认为是与相应的亚胺处于平衡状态)的溶液可按照本专业人员已知的任何方法处理，用于生产N-(膦酰甲基)甘氨酸。
催化加氢是从含有乙醛酸和氨甲基膦酸的混合物制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的优选方法，适合于这个目的的加氢催化剂包括(但不局限于)各种铂族金属如铱、锇、铑、钌、铂和钯；还有各种其它过渡金属如钴、铜、镍、锌。这些催化剂可以是无承载体的，如Ranev镍或氧化铂，或者也可以是有承载体的，如披铂碳，披钯氧化铝，或披镍硅藻土。优选的是披钯碳，披镍硅藻土和Raney镍。加氢作用可以在pH4-11下进行，优选的是pH5-10。加氢作用的温度和压力可以在较宽的范围内改变。一般的温度范围是0°-150℃，优选的是20℃-90℃，而H2压力一般是在大约1个大气压到大约100个大气压，优选的是1到10个大气压。用作后应急性除莠剂的N-(膦酰甲基)甘氨酸可以从还原液中回收得到，无论用哪种还原方法，用任何本专业人员熟知的回收方法都可以。
在下面的实施例中，将对本发明作进一步说明，其乙醛酸，甲酸和草酸的产率，以及乙醇酸的回收产率，是基于在反应开始时，存在的乙醇酸总量的百分数。用高压液相色谱法对反应混合物进行分析有机酸用Bio-Rad HPX-87H柱分析，AMPA和N-(膦酰甲基)甘氨酸用Bio-Rad Aminex Glyphosate分析柱分析。
测定微生物细胞转化体乙醇酸氧化酶活性的方法如下精确称取约5-10mg湿细胞，置于3ml的石英小杯内，加入含有0.12mM 2，6-二氯酚-靛酚(DCIP)和80mM TRIS缓冲液(pH8.3)的溶液2.0ml，并放入磁性旋转小棒。用橡胶膜盖上小杯，并通入氮气5分钟使溶液脱氧。然后用注射器向小杯内加入40μl 1.0M乙醇酸/1.0M TRIS(pH8.3)，在波长605nm(ε＝22.000)，在不同时间点测定混合液的光密度改变，测定时进行电磁搅拌。
过氧化氢酶活性测定法如下精确称取约2-5mg湿细胞，置于3ml的石英杯内，加入2.0ml蒸馏水，放入磁性搅拌小棒，然后再加入用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)配制的59mM H2O21.0ml，在240nm(ε＝39.4)，在不同时间点测定光密度改变。在不同培养基中培养的构巢曲霉湿细胞(未经增加渗透性处理的)的乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶活性范围是乙醇酸氧化酶活性为0.5-4.0 DCIP IU/每克湿细胞，内源性过氧化氢酶活性为500-7000IU/每克湿细胞。在不同培养基内培养的多形汉逊氏酵母菌或巴斯德毕赤氏酵母菌湿细胞(增加渗透性的)乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的活性范围乙醇酸氧化酶为20-60 DCIP IG/克湿细胞，内源性过氧化氢酶为30000-80000IU/克湿细胞。
实施例1在一个300ml的EZE-Seal搅拌压力釜反应器(AutoclaveEngineers)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液pH8.3(用50％NaOH校正)，并冷却至5℃。然后向反应器内加入26g冷冻的(-80℃)构巢曲霉菌FT17SYCSL/OL(124IU乙醇酸氧化酶和57800IU过氧化氢酶)和1.4×106单位黑色曲霉菌可溶性过氧化氢酶(Sigma)，使细胞在5℃解冻，所形成的混合物用50％NaOH校正至pH8.3。以400rpm的速度搅拌此混合物，在5℃，以120psig氧压，使氧通过混合物以50ml/min的速度吹入气泡。反应监测法按有规律的时间间隔，分别取出0.40ml等分量反应混合物，用微孔“ULTRAFREE”-MC10.000 NMWL滤器过滤各等分量液，并用HPLC分析滤出液。10小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是91％，0％，和7.9％，乙醇酸的回收率为2.5％。乙醇酸氧化酶和黑色曲霉过氧化氢酶的最后活性为它们初始活性的11％和87％。
实施例2(比较试验)重复实施例1所述的反应，只是不加入黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)。22小时后乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是1.7％，0％，和87.4％，乙醇酸完全转化了。在反应结束时，构巢曲霉菌FT17SYCSL/OL细胞内没有可测定的乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的活性。
实施例3在一个300ml的EZE-Seal搅拌压力釜反应器(AutoclaveEngineers)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液为pH8.3(用50％NaOH校准)，并冷却至5℃。然后向反应器内加入26g冷冻的(-80℃)构巢曲霉FT17SYCSL/OL细胞(124IU乙醇酸氧化酶和57800IU过氧化氢酶)和5.6×105单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)，使细胞在5℃解冻，所形成的混合物用50％NaOH校正至pH8.3。以400rpm的速度搅拌此混合物，在5℃，120psig氧压下，使氧通过混合物，以50ml/min的速率吹入气泡。10小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是83％，0％，和9.4％，乙醇酸的回收率为44％。乙醇酸氧化酶和黑色曲霉过氧化氢酶的最后活性为它们初始活性的17％和88％。
实施例4在一个300ml的EZE-Seal搅拌压力釜反应器(AutoclaveEngineers)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液pH为8.3(用50％NaOH校正)，并冷却至5℃。然后向反应器内加入15g冷冻的(-80℃)构巢曲霉菌FT17SYCSL/OL(72IU乙醇酸氧化酶和33300IU过氧化氢酶)和1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)，使细胞在5℃解冻，所形成的混合物用50％NaOH校正至pH8.3。以400rpm的速度搅拌此混合物，在5℃，以120psig氧压，使氧通过混合物，以50mlmin的速率吹入气泡。17小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是76％，0％，和4.1％，乙醇酸的回收率为16.8％。乙醇酸氧化酶和黑色曲霉过氧化氢酶的最后活性为它们初始活性的7％和49％。
实施例5在一个300ml的EZE-Seal搅拌压力釜反应器(AutoclaveEngineers)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液pH为8.3(用50％NaOH校准)，并冷却至5℃。先将冷冻的(-80℃)构巢曲霉FT17SYCSL/OL细胞(26g，124IU乙醇酸氧化酶和57800IU过氧化氢酶)在5℃解冻，然后在5℃下，用100ml KH2PO4(50mM，pH7.0)/FMN(0.01mM)缓冲液洗细胞2次，再将此洗过的细胞及1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)加入反应器内。再次用50％NaOH校准此混合物的pH至8.3。然后以400rpm速度搅拌，并在5℃，以120psig氧压，使氧通过混合物，以50ml/min的速率吹入气泡。11.5小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是94％，3.5％，和2.7％，乙醇酸的回收率为1.3％。乙醇酸氧化酶和黑色曲霉过氧化氢酶的最后活性为它们初始活性的7％和77％。
实施例6在一个300ml的EZE-Seal搅拌压力釜反应器(AutoclaveEngineers)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液为pH8.3(用50％NaOH校准)，并冷却至5℃。将新收集的构巢曲霉FT17SYCSL/OL细胞(37g，44IU乙醇酸氧化酶和57800IU过氧化氢酶)在5℃下用100ml KH2PO4(50mM，pH7.0)/FMN(0.01mM)缓冲液洗4次，然后将此洗过的细胞，连同1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)，加入反应器内。形成的混合物用50％NaOH再次校准pH至8.3，然后以400rpm的速度搅拌，并在5℃，120psig氧压下使氧通过混合物，以50ml/min的速度吹入气泡。15小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别84％，0％，和9.4％，乙醇酸的回收率为6.4％。
反应完成后，在5℃离心反应混合液，倾倒去上清液。将得到的构巢曲霉细胞，在5℃再悬浮于100ml新的反应混合液内，在与上述相同的条件下重复进行反应。25小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是59％，1.1％，和1.6％，乙醇酸的回收率为43％。此时测定乙醇酸氧化酶显示，已没有剩余的酶活性。
实施例7在一个300ml的EZE-Seal搅拌压力釜反应器(AutoclaveEngineers)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，黄素单核苷酸(0.01mM)，不加HPLC内标(溶液用50％NaOH校正至pH8.3)，将溶液冷却至5℃。先将冷冻的(-80℃)构巢曲霉FT17SYCSL/OL细胞(26g，124IU乙醇酸氧化酶和57800IU过氧化氢酶)在5℃解冻，然后用100ml KH2PO4(50mM，pH7.0)/FMN(0.01mM)缓冲液在5℃下洗四次，将此洗过的细胞连同1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)加入反应器内。形成的混合物以400rpm的速度搅拌，并在5℃，120psig氧压使氧通过混合物，以50ml/min的速率吹入气泡。11小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是89％，4.5％和2.0％，乙醇酸已被完全转化。
实施例8在一个3盎司的Fischer-Porter玻璃气溶胶反应瓶内放入一个磁搅拌小棒，并加入10ml含有下列成分的水溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)，和黄素单核苷酸(0.01mM)，pH8.3(用50％NaOH校准)，并将溶液冷却至5℃。然后向反应瓶内加入0.47g多形汉逊氏酵母菌转化体GO1(10IU乙醇酸氧化酶和22100IU过氧化氢酶)和1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)，其中转化体GO1已通过用0.1％“TRITON”X-100/l冻融法作了增加渗透性处理。再次用50％NaOH校正反应液pH至8.3后，将反应瓶密封，使反应混合物冷却至5℃。通过用氧气加压至70psig，吹扫反应瓶，再放气至大气压，如此重复5次同时进行搅拌，然后再使反应瓶加压至70psig氧压，并使混合物在5℃下搅拌。按规定的时间间隔，用注射器通过加样孔(不破坏反应瓶内压力)取出等分量(0.10ml)反应混合物，进行HPLC分析，以监测反应进程。16小时后，乙醛酸，甲酸和草酸的HPLC分析产率分别为90.1％，1.3％，和5.9％，剩余乙醇酸盐3.0％。剩余的乙醇酸氧化酶活性和总过氧化氢酶活性分别为它们初始活性的86％和136％。
实施例9(对比试验)重复实施例8中的反应，只是不加入1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigme)。16小时后，乙醛酸，甲酸和草酸的HPLC分析产率分别为57.6％，32.5％和2.6％，剩余乙醇酸盐8.9％。增加渗透性处理细胞剩余的乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的活性，分别为它们初始活性的60％和378％。
实施例10(对比试验)重复实施例8中的反应，只是以加入具有1.4×106单位过氧化氢酶活性的，经增加渗透性处理(0.1％“TRITON”X-100/l冻融处理)的啤酒糖酵母细胞1.67g，代替1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigme)，16小时以后，乙醛酸，甲酸和草酸的HPLC分析产率分别为67.2％，19.7％和6.0％，没有乙醇酸盐剩余。
实施例11在一个3盎司的Fischer-Porter玻璃气溶胶反应瓶内放入一个磁搅拌小棒，并加入10ml含有下列成分的水溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)和黄素单核苷酸(0.01mM)，pH8.3(用50％NaOH校正)，并将溶液冷却至5℃。然后向反应瓶内加入经过用0.1％“TRITON”X-100/l冻融处理，以增加渗透性的巴斯德毕赤氏酵母转化体GS 115-MSP 10细胞(13.2IU乙醇酸氧化酶和21200IU过氧化氢酶)0.75g。用50％NaOH再次校正此混合物的pH至8.3后，将反应瓶密封，使反应混合物冷却至5℃。在搅拌下，通过用氧加压至70psig吹扫反应瓶，再放气至大气压，如此重复5次，然后再使反应瓶加压至70psig氧压，并使混合物在5℃下搅拌。按规定的时间间隔，用注射器通过加样孔(不破坏反应瓶内压力)取出等分量(0.1ml)反应混合物，进行HPLC分析，以监测反应进程。16小时后，乙醛酸，甲酸和草酸的HPLC分析产率分别为30.5％，59.2％，和10.7％，乙醇酸盐剩余0.8％。
实施例12在一个配有Dispersimax旋转混合器的300ml EZE-Seal搅拌压力釜反应器(Autoclave Engineeris)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)，和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液pH8.3(用50％NaOH校正)，并冷却至5℃。然后向反应器内加入10g经过用0.1％“TRION”X-100/l冻融处理，增加渗透性的巴斯德毕赤氏酵母菌转化体NRRL Y-21001细胞(391IU乙醇酸氧化酶和457000IU过氧化氢酶)，以及1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)。用50％NaOH再次校正此混合物的pH至8.3。以1000rpm的速度搅拌此混合物，氧气经旋转混合器叶轮的作用通过混合物吹入气泡，温度5℃，氧压120psig。反应监测法按规定的时间间隔，分别取出0.40ml等分量反应混合物，用微孔“ULTRAFREE”-MC 10000 NMWL滤器过滤各等分量液，并用HPLC分析滤出液。1.0小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别为89.8％，6.0％，和2.9％，乙醇酸回收率为1.7％。经过增加渗透性处理细胞的乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的最后活性为它们初始活性的117％和78％。
用离心法从上述反应混合物中回收微生物细胞催化剂。将此细胞沉淀未经进一步处理就与100ml新的反应液混合，并另加入1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶，重复进行反应。1.0小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别为87.8％，5.0％和5.3％，乙醇酸回收率为2.9％。经增加渗透性处理细胞的乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的最后活性为它们初始活性的172％和61％。
实施例13将经过实施例2中所述反应产生的乙醛酸和AMPA混合物，离心除去构巢曲霉完整细胞催化剂，然后用Amicon“CENTRIPREP”10浓缩器(截止分子量为10000)过滤，除去可溶性黑色曲霉过氧化氢酶。得到的溶液与活性碳(0.50g)共同搅拌除去FMN，过滤后置于300ml的Autoclave Engineers EZE-Seal反应器的316SS杯内，并加入0.50g10％披钯活性碳。反应器用氮气吹扫，然后充入压力300psig氢气，并在27℃，以1000rpm速度搅拌。22小时后，N-(膦酰甲基)-甘氨酸的产率(根据AMPA计算)为80％。
实施例14将经过实施例4中所述反应产生的乙醛酸和AMPA混合物，离心除去构巢曲霉完整细胞催化剂，然后用Amicon“CENTRIPREP”10浓缩器(截止分子量为10000)过滤，除去可溶性黑色曲霉过氧化氢酶。得到的溶液与活性碳(0.50g)共同搅拌除去FMN，过滤后置于300ml的Autoclave Engineers EZE-Seal反应器的316SS杯内，并加入0.50g10％披钯活性碳。反应器用氮气吹扫，然后充入压力300psig氢气，并在27℃，以1000rpm速度搅拌。22小时后，N-(膦酰甲基)-甘氨酸的产率(根据AMPA计算)为89％。
实施例15将经过实施例6中所述反应产生的乙醛酸和AMPA混合物，离心除去构巢曲霉完整细胞催化剂，然后用Amicon“CENTRIPREP”10浓缩器(截止分子量为10000)过滤，除去可溶性黑色曲霉过氧化氢酶。得到的溶液与活性碳(0.50g)共同搅拌除去FMN，过滤后置于一个300ml的玻璃套管内，并加入0.50g 10％披钯活性碳。将此玻璃套管密封在压力釜内，并用氮气吹扫，然后充入压力1000psig氢气，在27℃下振荡混合。11小时后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的产率(根据AMPA计算)为76％。
实施例16在一个配有Dispersimax旋转混合器的300ml EZE-Seal搅拌压力釜反应器(Autoclave Engineeris)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.50M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)，和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液pH8.3，并冷却至5℃。然后向反应器内加入30g大肠杆菌转化体细胞(25.2IU乙醇酸氧化酶和39900IU过氧化氢酶)，以1000rpm的速度搅拌此混合物，氧气经旋转混合器叶轮的作用，通过混合物吹入气泡，温度5℃，氧压120psig。反应监测法按规定的时间间隔，分别取出0.40ml等分量反应混合物，用微孔“Ultrafree”-MC 10000 NMWL滤器过滤各等分量液，并用HPLC分析滤出液。19小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别为8.6％，8.3％和1.1％，剩余57.3％乙醇酸。微生物乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的回收活性分别为它们初始活性的10％和68％。
实施例17用具有较高甘醇酸脂氧化酶活性(72IU乙醇酸氧化酶和29600IU过氧化氢酶)的第二个大肠杆菌转化体生长物30g，重复实施例16所述的反应。23小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别为18.3％，1.9％和2.9％，剩余42.6％乙醇酸。微生物乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的回收活性分别为它们初始活性的18％和71％。
通过以上对具有某种程度特殊性的本发明所作的叙述和示例，应该意识到，下列权利要求不是因此而被限制，而是提出了一个与权利要求及其等价物的每个要点的措辞相应的范围。
权利要求
1.一种制备乙醛酸和氨甲基膦酸混合物的方法，该方法包括用氧在含有氨甲基膦酸以及乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的水溶液中，氧化乙醇酸的步骤，其特征在于对该方法的改进包括用表达乙醇酸氧化酶的微生物细胞催化剂。
2.权利要求1的方法，其中所说的微生物细胞催化剂也能表达内源性过氧化氢酶。
3.权利要求2的方法，其中也使用可溶性过氧化氢酶。
4.权利要求1的方法，其中所说的微生物催化剂选自曲霉菌属，汉逊酵母菌属和毕赤酵母菌属。
5.权利要求1的方法，其中所说的微生物催化剂是巴斯德毕赤氏酵母菌。
6.权利要求1的方法，其中所说的微生物催化剂是多形汉逊氏酵母菌。
7.权利要求1的方法，其中所说的微生物催化剂是构巢曲霉菌。
8.权利要求1的方法，其中所说的微生物催化剂是大肠杆菌。
全文摘要
一种改进的，使乙醇酸和氧在存在氨甲基膦酸的水溶液中反应的酶促反应方法，其中的改进包括使用表达乙醇酸氧化酶的徽生物细胞催化剂(例如巴斯德毕赤氏酵母菌，多形汉逊氏酵母菌，构巢曲霉菌或大肠杆菌)和内源性过氧化氢酶；还可能包括可溶性过氧化氢酶。生成的混合物是生产N-(膦酰甲基)甘氨酸的有用中间体。
文档编号C07F9/00GK1153532SQ94195139
公开日1997年7月2日 申请日期1994年6月29日 优先权日1994年6月29日
发明者D·L·安敦, R·迪科西莫 申请人:纳幕尔杜邦公司
背景技术：
1.发明领域本发明涉及一种生产乙醛酸和氨甲基膦酸(AMPA)混合物的方法，其中，在存在AMPA和催化剂的情况下，乙醇酸和氧在水溶液中发生反应，其中的催化剂是由表达菠菜中乙醇酸氧化酶((S)-2-羟酸氧化酶，EC1.1.3.15)和表达过氧化氢酶(EC1.11.1.6)的基因工程微生物转化体组成。此方法制备的乙醛酸和氨甲基膦酸混合物，对于生产N-(膦酰甲基)甘氨酸，一种广谱的后应急性(post-emergent)除莠剂，是有用的中间体。
2.相关技术的说明乙醇酸氧化酶，是一种同时存在于绿色植物叶和哺乳动物细胞中的酶，它催化乙醇酸氧化成乙醛酸，同时产生过氧化氢N.E图尔伯特等(生物化学杂志，Vol.181，905-914(1949))首先报导了一种从烟草叶中提取的酶，它能催化乙醇酸经过形成乙醛酸中间体氧化生成甲酸和CO2。加入某些化合物如乙二胺，可限制中间体乙醛酸进一步氧化。典型的氧化过程可用浓度约3-40mM的乙醇酸，在pH值约8的条件下进行。有人报导乙醇酸氧化的最适pH是8-9。还有人报导，草酸(100mM)能抑制乙醇酸氧化酶的催化作用。类似的情况是，K.E.理查逊和N.E图尔伯特(生物化学杂志，Vol.236，1280-1284(1961))曾报导，含有三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)的缓冲液，可抑制在乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化的过程中生成草酸。C.O.克拉盖特，N.E图尔伯特和R.H.伯立斯(生物化学杂志，Vol 178，977-987(1949))还曾报导，乙醇酸氧化酶催化用氧来氧化乙醇酸的最适pH是约7.8-8.6，最适温度是35-40℃。
I.泽立奇和S.奥赫阿(生物化学杂志，Vol 201，707-718(1953))和J.C.罗宾逊等(生物化学杂志，Vol.237，2001-2009(1962))曾报导，在菠菜乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化中，甲酸和CO2的生成是由于H2O2和乙醛酸的非酶促反应所致。他们观察到，加入过氧化氢酶(催化H2O2分解的酶)，通过抑制甲酸和CO2生成，可大大提高乙醛酸的产率。还发现，加入FMN(黄素单核苷酸)可大大增加乙醇酸氧化酶的稳定性。
N.A.弗里格里奥和H.A.哈伯利(生物化学杂志，Vol.231，135-157(1958))已经报导了从菠菜中分离的乙醇酸氧化酶的制备方法和特性。发现这种纯化的酶在溶液中非常不稳定，这种不稳定性是由于黄素单核苷酸(FMN)对酶活性部位的结合比较弱，并且还由于具有酶活性的酶四聚体和/或八聚体解离变成无酶活性的单体和二聚体所致，这些单体和二聚体将发生不可逆的凝集和沉淀。将FMN(黄素单核苷酸)加入酶溶液会大大地增加其稳定性，并且高蛋白质浓度或高离子强度能维持酶的八聚体或四聚体的构型。
还有许多关于乙醇酸氧化酶催化氧化乙醇酸的其它参考文献。下列参考文献中描述了该酶的分离(和测定)方法I.泽立奇，酶学方法，Vol.1，学术出版社，纽约，1955，p.528-532(从菠菜和烟草叶中)，M.Nishimura等，生物化学和生物物理丛刊，Vol.222，397-402(1983)(从西葫芦子叶中)，H阿斯卡和D.戴维斯，生物化学和生物物理学报，Vol.761，103-108(1983)(从大鼠肝中)，以及M.J.埃米斯和K.H埃里斯曼，国际生物化学杂志，Vol.16，1373-1378(1984)(从浮萍属植物中)。关于该酶的结构也有如下报导E赛得兰德等，欧洲生物化学杂志，Vol.173，523-530(1988)和Y.林德魁斯特和C.布兰登，生物化学杂志，Vol.264，3624-3628(1989)。
发明概述本发明涉及乙醛酸(或者它的盐)和氨甲基膦酸(AMPA)(或者它的盐)混合物的制备方法，该方法是通过在水溶液中，并在存在AMPA和两个催化剂的条件下用氧来氧化乙醇酸完成的，所用催化剂是表达菠菜乙醇酸氧化酶((S)-2-羟酸氧化酶，EC1.1.3.15)的基因工程微生物转化体，以及过氧化氢酶(EC1.11.16)。这种乙醛酸和AMPA混合物可用于制备N-(膦酰甲基)甘氨酸，一种后应急性除莠剂。
生物材料库的简要说明申请人根据布达佩斯协议条款，建立了如下的生物材料库保藏物参考名称国际保藏名称 保藏日期构巢曲霉(AspergillusNRRL Y-21000 1992年9月24日nidulans)T17斯德毕赤氏酵母菌 NRRL Y-21001 1992年9月24日(Pichia pastoris)，GS 115-MSP 10多形汉逊氏酵母菌 NRRLY-21065 1993年9月30日(Hansenula polymorpha)，G01其中“NRRL”代表北部研究实验室(Northern RegionalResearch Laboratory)，农业研究机构培养物收集国际保藏库，位于11815N，大学街，Peioria，IL 61604 U.S.A。“NRRL号码”是在NRRL的贮存库中查找培养物的号码。
对优选实施方案的说明一个有关的专利，U.S. 5,135,860(1992年8月4日)，“制备乙醛酸/氨甲基膦酸混合物的方法”(PCT/US92/09419)描述了一种在存在氧，氨甲基膦酸(AMPA)，以及可溶性乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的情况下，将乙醇酸酶促转化成乙醛酸的方法。在pH7-9的范围内，对乙醇酸的酶促氧化反应加入AMPA，将得到高产率的乙醛酸，这是出人意料的，因为据信，未质子化的胺对于与乙醛酸一起形成一个抗氧化的N-取代半胺和/或亚胺复合物是必需的。有人报导，AMPA质子化胺的pKa是10.8(朗氏化学手册，J.A.邓恩编辑，McGraw-Hill，纽约，1979，第12版)，因此，AMPA将主要作为质子化铵离子存在于反应混合物中，预计将不与乙醛酸形成这样的保护性复合物。本发明对以上方法提出了一种改进，以完整微生物细胞(whole microbial cell)作为这种方法的催化剂。
以前报告的用可溶性酶作为生产乙醛酸和氨甲基膦酸混合物的催化剂，存在如下几个问题催化剂不容易回收再用，酶活性不如固定化酶或完整细胞催化系统稳定，以及可溶性乙醇酸氧化酶在将氧充入反应混合物(为增加氧溶解的速度，从而增加反应速度)时不稳定。第二个有关的专利申请，U.S.S.N.08/085,488,1993年7月1日提交的申请，题为“乙醇酸氧化酶生产”(PCT/US94/___)，描述了用本专业人员通常熟知的基因工程技术，构建几个表达菠菜乙醇酸氧化酶以及表达内源性过氧化氢酶的构巢曲霉菌转化体的过程。本发明用这种完整的细胞催化剂生产乙醛酸和氨甲基膦酸混合物，比用可溶性的酶催化剂有以下几个优点(1)完整细胞催化剂在反应结束后，容易从反应混合液中回收再用，而可溶性的酶回收非常困难，并会失去活性；(2)它们比可溶性的酶更稳定，从与可溶性的酶比的催化周转数以及反应结束时回收的酶活性都表明这点；(3)最重要的是，它们对如下反应条件是稳定的为了增加氧溶解速度和增加反应速度，氧气或含氧的气体被充入反应混合液，在相同反应条件下，可溶性的乙醇酸氧化酶很快变性失活。
构巢曲霉转化体的制备是通过首先克隆编码甘醇酸氧化酶的菠菜基因，然后将这种基因导入已经能产生内源性过氧化氢酶的构巢曲霉菌株。得到的转化体可在摇瓶内或者振荡的发酶罐内用基本培养基或富含SYG的培养基培养，并且，为了增强表达乙醇酸氧化酶和/或过氧化氢酶的水平，可额外加入不同的成分，如油酸(OL)，乙醇酸(HA)，或玉米浸出液(CSL)。然后对不同的转化体进行筛选，可通过测定完整细胞(未经处理)的过氧化氢酶和乙醇酸氧化酶的活性，以及通过用细胞作催化剂进行乙醇酸氧化生成乙醛酸的反应来筛选。
在用作乙醇酸氧化生成乙醛酸反应的催化剂时，不必为了增加反应混合物与细胞内酶的接触，而对构巢曲霉细胞作预处理或增加渗透性处理；可能在细胞暴露于反应混合物或其中任何成分时，或者在保存和启用完整细胞催化剂的冷冻和融化过程中，对细胞的某些增加渗透性处理已经发生了。
以前已经证明，可以用构巢曲霉转化体作完整细胞催化剂用于生产乙醛酸(PCT/US93/00077，“用微生物细胞转化体作催化剂，氧化乙醇酸生成乙醛酸”)，其中使用了一个能与乙醛酸形成化学加成产物的胺类缓冲液(例如乙二胺或TRIS)，导致乙醛酸的产率高达98％。在上述情况下，细胞中的内源性过氧化氢酶的浓度足以限制乙醛酸被副产品H2O2氧化成甲酸。在本发明的情况下，AMPA对防止乙醛酸被H2O2氧化较少有效，细胞中的内源性构巢曲霉过氧化氢酶的浓度不足以产生所希望的高产率乙醛酸。已经发现，向用这种完整细胞作为乙醇酸氧化酶活性来源的，含有AMPA的反应混合物中加入额外的可溶性过氧化氢酶(例如来源于黑色曲霉(A.niger或啤酒糖酵母菌(S.cerevisiae))，可使乙醛酸的产率与用可溶性酶或固定化酶时的产率相似。
当以构巢曲霉转化体作催化剂用于乙醇酸/AMPA混合物的氧化过程时，在含有乙醇酸氧化酶的细胞内，既产生了乙醛酸，又产生了H2O2，在不存在外加的可溶性过氧化氢酶的情况下，乙醛酸迅速被氧化成甲酸(例如在实施例2中，甲酸的产率是87％，乙醛酸的产率是1.7％)。出乎预料的是，通过向反应加入可溶性过氧化氢酶的简单步骤，可以得到高产率的乙醛酸，因为(1)通过反应过程产生的乙醛酸和H2O2的相对浓度，在细胞内的比在周围水溶液中的高，(2)构巢曲霉细胞中的内源性过氧氢酶的浓度，一般是通常加入到反应混合物中的可溶性过氧化氢酶浓度的2％-15％。以及(3)H2O2要被可溶性过氧化氢酶分解成水和氧，必须从细胞内部扩散进入周围的水溶液。但是，用以前仅以可溶性过氧化氢酶和可溶性乙醇酸氧化酶作催化剂时(美国专利No.5,135,860，PCT/US92/09419)使用过的相同浓度的可溶性过氧化氢酶，简单地加入到反应混合物中，已经得到了产率高达94％的乙醛酸。
已经用于本发明的第二个微生物细胞催化剂，是一个能表达菠菜乙醇酸氧化酶，以及表达内源性过氧化氢酶的多形汉逊氏酵母菌(Hansenula Polymorpha)(一种甲基营养性酵母菌)转化体。通过在甲酸脱氢酶(FMD)启动子的控制下，将乙醇酸氧化酶基因的DNA片段插入表达载体，已经制备出几种具有足够乙醇酸氧化酶活性的多形汉逊氏酵母菌转化体。用这种载体转化多形汉逊氏酵母菌，选择出了一个能产生高水平乙醇酸氧化酶的菌株，被命名为多形汉逊氏酵母菌GO1(NRRL Y-21065)。
多形汉逊氏酵母菌细胞催化剂典型的制备程序是首先将多形汉逊氏酵母菌转化体接种物在500ml YPD(Difco)，pH4.4中培养生长。然后将此培养物接种到发酵罐中，其中含有10升(L)酵母氮基(YeastNitrogen Base(YBN Difco))(重量百分比)氨基酸(14g)，硫酸铵(50g)和甲醇(100g)，pH5.0。发酵罐运转42.5小时，条件是37℃，旋转速度为400rpm，恒定pH5.0，含40％溶解氧(受控)，气压14psig(磅/英时2)。在发酵终点，加入1.0kg甘油，通过离心收集细胞，用液氮冷冻，-80℃保存。
已经用于本发明的第三个微生物细胞催化剂，是能表达菠菜乙醇酸氧化酶，以及表达内源性过氧化氢酶的巴斯德毕赤氏酵母菌(Pichiapastoris)(一种甲基营养性酵母菌)转化体。通过在例如甲醇诱导的醇氧化酶I启动子的控制下，将含有菠菜乙醇酸氧化酶基因的DNA片段插入巴斯德毕赤氏酵母菌表达载体(pHIL-D4)形成质粒pMP1，已经制备出几种具有足够乙醇酸氧化酶活性的巴斯德毕赤氏酵母菌转化体。用质粒pMP1转化巴斯德毕赤氏酵母菌株GTS 115(NRL Y-15851)，并进行筛选，使线性化的质粒pMP1整合进入染色体醇氧化酶I座位，并且以乙醇酸氧化酶基因取代醇氧化酶基因。下一步是从这样一些转化体中，挑选出具有最大整合拷贝数的表达盒(expressioncassette)。已分离出一个命名为巴斯德毕赤氏酵母菌GS 115-MSP 10株的高拷贝数转化体，存放在NRRL Peoria，Illinois。
巴斯德毕赤氏酵母细胞典型地是通过使接种物在100ml含1％甘油的YNB培养基中生长来制备。在30℃下培养生长48小时之后，将细胞转移到发酵罐中，发酵罐中含有10L由酵母氮基(YBN)(重量百分比)氨基酸(134g)，甘油(100g)，生物素(20mg)组成的培养基。发酵运转条件是pH5.0(用NH4OH控制)，温度30℃，发酵罐旋转速度为200rpm，通气5slpm，气压5psig，溶解氧饱和度不低于50％。当甘油被耗尽后，通过使细胞生长在仅以甲醇(50g)代替甘油的相同培养基内，诱导细胞表达乙醇酸氧化酶。诱导过程中，以酶测定法监测乙醇酸氧化酶的活性。诱导24小时后，先用甘油(1kg)处理，然后收集细胞。收集的细胞在液氮中冷冻，保存于-80℃。
与构巢曲霉转化体不同，在用作氧化乙醇酸生成乙醛酸反应的催化剂之前，需要对多形汉逊氏酵母菌和巴斯德毕赤氏酵母菌细胞转化体进行增加渗透性处理。有各种已知的增加渗透性处理方法可用于处理具有足够乙醇酸氧化酶活性的细胞(见Felix，H分析生物化学，Vol.120，211-234，(1982))；典型的方法是，向含10％湿重的细胞悬液加入0.1％(V/V)“TRITON”X-100/20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)，处理15分钟，然后在液氮中冷冻，再融化，用20mM磷酸盐/0.1mM FMN缓冲液(pH7.0)洗。
当用多形汉逊氏酵母菌和巴斯德毕赤氏酵母菌细胞转化体作氧化乙醇酸/AMPA混合物反应催化剂时，再次发现，为了得到高产率的乙醛酸，加入可溶性黑色曲霉过氧化氢酶同样是必需的。尽管经增加渗透性处理的多形汉逊氏酵母菌或巴斯德毕赤氏酵母菌细胞可达到的过氧化氢酶活性比构巢曲霉菌大10倍左右，但是，这二种甲基营养性酵母菌的内源性过氧化氢酶，与来源于构巢曲霉或黑色曲霉菌的过氧化氢酶相比较，在含有AMPA的反应混合物中分解副产品H2O2的效果较差。加入可溶性黑色曲霉过氧化氢酶，或者对完整啤酒糖酵母菌细胞作增加渗透性处理，作为过氧化氢酶的补充来源，导致与不加入过氧化氢酶的反应相比较，乙醛酸的产量明显增加了。
第四个用于本发明的微生物细胞催化剂，是能表达菠菜乙醇酸氧化酶，并表达内源性过氧化氢酶的大肠杆菌(Escherichia coli)(一种细菌)转化体。这种大肠杆菌转化体的制备方法如Macheroux等在生物化学和生物物理学报，Vol.1132，11-16(1992)中所述。在用作本发明的催化剂之前，这种表达乙醇酸氧化酶活性的大肠杆菌转化体不需要作增加渗透性处理。
用可溶性酶作催化剂的许多缺点，在本申请中都通过使用完整微生物细胞转化体(不需要或需要作增加渗透性处理)作催化剂而消除了。完整细胞催化剂的回收和再利用容易实现，通过从反应混合物中离心或过滤分出催化剂，就可以将它在新的反应混合物中再循环使用；按这种方式，已经得到了高达106的乙醇酸氧化酶的转换数。由于具有吹入气泡给反应混合物供氧，而不会使乙醇酸氧化酶迅速变性失活的能力，使反应速度比不对反应混合物吹入气泡供氧时至少增加了10倍(在用可溶性酶时，可看到吹入气泡通氧引起的酶变性失活)，由于反应速度增加，可显著地降低该方法的生产成本。
用于反应的乙醇酸氧化酶活性(以完整微生物细胞转化体的形式加入的)应该存在于一个有效的浓度之中，浓度通常是0.01至约100IU/ml(国际单位/ml)，优选的是约0.1至10IU/ml。IU(国际单位)的定义是每分钟催化转化1微摩尔底物的酶量。在I.泽立奇和S.奥赫阿，生物化学杂志，Vol.201，707-718(1953)中可找到测定这种酶的方法。这种方法也可以用于检测回收或再循环的乙醇酸氧化酶的活性。反应混合物中过氧化氢酶的浓度应该是50-100000IU/ml，优选的是500-14000IU/ml。优选的情况是，乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶都存在于同一微生物细胞内(在所附的实施例中，构巢曲霉，多形汉逊氏酵母菌，巴斯德毕赤氏酵母菌或大肠杆菌转化体都是这样)。如果细胞中的内源性过氧化氢酶的浓度不足以有效地分解所产生的H2O2(如在所附的实施例中)，可加入其他来源的过氧化氢酶(例如可溶性黑色曲霉过氧化氢酶，或完整的啤酒糖酵母菌细胞)以补充内源性过氧化氢酶不足。此外，过氧化氢酶和乙醇酸氧化酶的浓度应调整在上述范围内，使过氧化氢酶对乙醇酸氧化酶的比率(测定每种酶的IU)至少是约250∶1。黄素单核苷酸(FMN)是一个任选的补加成分，用0.0-2.0mM的浓度，优选的是0.01-0.2mM。
鉴于上述有效的浓度范围，应该意识到本发明的改进方法本身已涉及应用微生物细胞催化剂，并打算包括应用这些在有效操作范围内表达乙醇酸氧化酶和/或过氧化氢酶的所有微生物细胞催化剂，即完整细胞催化剂。因此，对本发明来说，名词“完整微生物细胞催化剂”包括(通过实施例的方式，但不限于此)优选实施方案中的基因工程微生物转化体，还包括从具有高表达能力的天然微生物或突变微生物中选取的菌株，和/或能实际产生上述有效浓度范围酶活性的这些微生物的混合体。
乙醇酸(2-乙醇酸)可从商业途径买到。在本发明的反应中，它的初始浓度在0.10M-2.0M的范围内，优选的范围在0.25M和1.0M之间。它能以酸的形式被使用，也能以其相容的盐的形式使用，所说的相容的盐是一种水溶性盐，它的阳离子不会干扰所需的乙醇酸转变成乙醛酸的反应，或者对以后的乙醛酸产物与氨甲基膦酸形成N-(膦酰甲基)甘氨酸的反应也不会有干扰。适当的和相容的成盐阳离子基团还应容易用试验测定。这些代表性的盐可以是碱金属盐，碱土金属盐，铵盐，取代的铵盐，鏻盐和取代的鏻盐。
乙醇酸转变成乙醛酸的反应可容易地并优选地在水溶性基质中进行。加入氨甲基膦酸(AMPA)，或其适当的盐，使之产生一个在0.01/1.0-3.0/1.0范围内的AMPA/乙醇酸摩尔比(起始量)，优选的范围是0.25/1.0-1.05/1.0。AMPA和乙醇酸在水溶液中结合之后，将此混合液的pH校准至6-10之间，优选地在7.0-8.5之间。在此pH范围之内，通过加入任何相容的非干扰性碱，包括碱金属的氢氧化物，碳酸盐，碳酸氢盐和磷酸盐，可以校准得到所要求的精确的pH值。因为反应过程中反应混合物的pH稍有下降，所以在反应开始时，使pH接近最大酶活性pH范围的上限常常是有用的，此pH大约是9.0-8.5，这样可允许pH在反应过程中下降。pH还可任选地通过分别加入非干扰性无机或有机缓冲液来维持，因为酶活性随pH变化而改变。
已认识到，在水中乙醇酸和乙醛酸是高度离解的，在pH7-10之间，如果不是基本上全部，则大部分是以乙醇酸盐和乙醛酸离子的形式存在。本领域的专业人员还将意识到，乙醛酸(和它的共轭碱，乙醛酸盐阴离子)可能也是以水合物的形式存在的，例如以(HO)2CHCOOH和/或以半缩醛HOOCCH(OH)OCH(OH)COOH的形式，其组合物和它们的阴离子对应部分应该是与乙醛酸和它的阴离子等价的，以达到成为形成N-(膦酰甲基)甘氨酸的适合反应物的目的。
氧(O2)，作为使乙醇酸转变为乙醛酸的氧化剂，可以作为气体加入反应，加入过程可经透氧膜通过在气-液界面搅拌液体，或者在反应混合液中充入(鼓泡)氧气来完成。据信，在绝大多数情况下，反应速率至少部分地受氧溶于水基质速率的控制。因此，虽然氧可以由空气加入到反应中，但优选的是用比较纯的氧，甚至用高压氧。尽管还不知道所用氧压的上限，但可以用高达50个大气压的氧，优选的上限是15个大气压。为了维持氧的高溶解速率(因此有高反应速率)，搅拌是重要的。任何方便的搅拌形式都可使用，例如旋转搅拌。
反应温度是一个重要的可变因素，它既影响反应速率，又影响酶的稳定性。大约0℃-40℃的反应温度都可使用，但是，优选的反应温度范围是从5℃到15℃。在优选的温度范围内操作反应，在反应的终点可得到最高的回收酶活性。温度不应该低到水溶液开始结冰的状态。温度可通过各种通常的方法来控制，例如可以用有夹套的反应容器，并使有适当温度的液体通过此夹套层，但方法并不局限于此。反应容器可以用任何对反应成分惰性的材料构成。
反应液停止与O2接触之后，其中的微生物细胞催化剂，可以通过倾析法、过滤或离心被分离出，并再利用。黄素单核苷酸(FMN)可以任选地通过使反应液与活性碳接触而被除去。含有乙醛酸和氨甲基膦酸(被认为是与相应的亚胺处于平衡状态)的溶液可按照本专业人员已知的任何方法处理，用于生产N-(膦酰甲基)甘氨酸。
催化加氢是从含有乙醛酸和氨甲基膦酸的混合物制备N-(膦酰甲基)甘氨酸的优选方法，适合于这个目的的加氢催化剂包括(但不局限于)各种铂族金属如铱、锇、铑、钌、铂和钯；还有各种其它过渡金属如钴、铜、镍、锌。这些催化剂可以是无承载体的，如Ranev镍或氧化铂，或者也可以是有承载体的，如披铂碳，披钯氧化铝，或披镍硅藻土。优选的是披钯碳，披镍硅藻土和Raney镍。加氢作用可以在pH4-11下进行，优选的是pH5-10。加氢作用的温度和压力可以在较宽的范围内改变。一般的温度范围是0°-150℃，优选的是20℃-90℃，而H2压力一般是在大约1个大气压到大约100个大气压，优选的是1到10个大气压。用作后应急性除莠剂的N-(膦酰甲基)甘氨酸可以从还原液中回收得到，无论用哪种还原方法，用任何本专业人员熟知的回收方法都可以。
在下面的实施例中，将对本发明作进一步说明，其乙醛酸，甲酸和草酸的产率，以及乙醇酸的回收产率，是基于在反应开始时，存在的乙醇酸总量的百分数。用高压液相色谱法对反应混合物进行分析有机酸用Bio-Rad HPX-87H柱分析，AMPA和N-(膦酰甲基)甘氨酸用Bio-Rad Aminex Glyphosate分析柱分析。
测定微生物细胞转化体乙醇酸氧化酶活性的方法如下精确称取约5-10mg湿细胞，置于3ml的石英小杯内，加入含有0.12mM 2，6-二氯酚-靛酚(DCIP)和80mM TRIS缓冲液(pH8.3)的溶液2.0ml，并放入磁性旋转小棒。用橡胶膜盖上小杯，并通入氮气5分钟使溶液脱氧。然后用注射器向小杯内加入40μl 1.0M乙醇酸/1.0M TRIS(pH8.3)，在波长605nm(ε＝22.000)，在不同时间点测定混合液的光密度改变，测定时进行电磁搅拌。
过氧化氢酶活性测定法如下精确称取约2-5mg湿细胞，置于3ml的石英杯内，加入2.0ml蒸馏水，放入磁性搅拌小棒，然后再加入用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)配制的59mM H2O21.0ml，在240nm(ε＝39.4)，在不同时间点测定光密度改变。在不同培养基中培养的构巢曲霉湿细胞(未经增加渗透性处理的)的乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶活性范围是乙醇酸氧化酶活性为0.5-4.0 DCIP IU/每克湿细胞，内源性过氧化氢酶活性为500-7000IU/每克湿细胞。在不同培养基内培养的多形汉逊氏酵母菌或巴斯德毕赤氏酵母菌湿细胞(增加渗透性的)乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的活性范围乙醇酸氧化酶为20-60 DCIP IG/克湿细胞，内源性过氧化氢酶为30000-80000IU/克湿细胞。
实施例1在一个300ml的EZE-Seal搅拌压力釜反应器(AutoclaveEngineers)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液pH8.3(用50％NaOH校正)，并冷却至5℃。然后向反应器内加入26g冷冻的(-80℃)构巢曲霉菌FT17SYCSL/OL(124IU乙醇酸氧化酶和57800IU过氧化氢酶)和1.4×106单位黑色曲霉菌可溶性过氧化氢酶(Sigma)，使细胞在5℃解冻，所形成的混合物用50％NaOH校正至pH8.3。以400rpm的速度搅拌此混合物，在5℃，以120psig氧压，使氧通过混合物以50ml/min的速度吹入气泡。反应监测法按有规律的时间间隔，分别取出0.40ml等分量反应混合物，用微孔“ULTRAFREE”-MC10.000 NMWL滤器过滤各等分量液，并用HPLC分析滤出液。10小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是91％，0％，和7.9％，乙醇酸的回收率为2.5％。乙醇酸氧化酶和黑色曲霉过氧化氢酶的最后活性为它们初始活性的11％和87％。
实施例2(比较试验)重复实施例1所述的反应，只是不加入黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)。22小时后乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是1.7％，0％，和87.4％，乙醇酸完全转化了。在反应结束时，构巢曲霉菌FT17SYCSL/OL细胞内没有可测定的乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的活性。
实施例3在一个300ml的EZE-Seal搅拌压力釜反应器(AutoclaveEngineers)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液为pH8.3(用50％NaOH校准)，并冷却至5℃。然后向反应器内加入26g冷冻的(-80℃)构巢曲霉FT17SYCSL/OL细胞(124IU乙醇酸氧化酶和57800IU过氧化氢酶)和5.6×105单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)，使细胞在5℃解冻，所形成的混合物用50％NaOH校正至pH8.3。以400rpm的速度搅拌此混合物，在5℃，120psig氧压下，使氧通过混合物，以50ml/min的速率吹入气泡。10小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是83％，0％，和9.4％，乙醇酸的回收率为44％。乙醇酸氧化酶和黑色曲霉过氧化氢酶的最后活性为它们初始活性的17％和88％。
实施例4在一个300ml的EZE-Seal搅拌压力釜反应器(AutoclaveEngineers)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液pH为8.3(用50％NaOH校正)，并冷却至5℃。然后向反应器内加入15g冷冻的(-80℃)构巢曲霉菌FT17SYCSL/OL(72IU乙醇酸氧化酶和33300IU过氧化氢酶)和1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)，使细胞在5℃解冻，所形成的混合物用50％NaOH校正至pH8.3。以400rpm的速度搅拌此混合物，在5℃，以120psig氧压，使氧通过混合物，以50mlmin的速率吹入气泡。17小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是76％，0％，和4.1％，乙醇酸的回收率为16.8％。乙醇酸氧化酶和黑色曲霉过氧化氢酶的最后活性为它们初始活性的7％和49％。
实施例5在一个300ml的EZE-Seal搅拌压力釜反应器(AutoclaveEngineers)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液pH为8.3(用50％NaOH校准)，并冷却至5℃。先将冷冻的(-80℃)构巢曲霉FT17SYCSL/OL细胞(26g，124IU乙醇酸氧化酶和57800IU过氧化氢酶)在5℃解冻，然后在5℃下，用100ml KH2PO4(50mM，pH7.0)/FMN(0.01mM)缓冲液洗细胞2次，再将此洗过的细胞及1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)加入反应器内。再次用50％NaOH校准此混合物的pH至8.3。然后以400rpm速度搅拌，并在5℃，以120psig氧压，使氧通过混合物，以50ml/min的速率吹入气泡。11.5小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是94％，3.5％，和2.7％，乙醇酸的回收率为1.3％。乙醇酸氧化酶和黑色曲霉过氧化氢酶的最后活性为它们初始活性的7％和77％。
实施例6在一个300ml的EZE-Seal搅拌压力釜反应器(AutoclaveEngineers)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液为pH8.3(用50％NaOH校准)，并冷却至5℃。将新收集的构巢曲霉FT17SYCSL/OL细胞(37g，44IU乙醇酸氧化酶和57800IU过氧化氢酶)在5℃下用100ml KH2PO4(50mM，pH7.0)/FMN(0.01mM)缓冲液洗4次，然后将此洗过的细胞，连同1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)，加入反应器内。形成的混合物用50％NaOH再次校准pH至8.3，然后以400rpm的速度搅拌，并在5℃，120psig氧压下使氧通过混合物，以50ml/min的速度吹入气泡。15小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别84％，0％，和9.4％，乙醇酸的回收率为6.4％。
反应完成后，在5℃离心反应混合液，倾倒去上清液。将得到的构巢曲霉细胞，在5℃再悬浮于100ml新的反应混合液内，在与上述相同的条件下重复进行反应。25小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是59％，1.1％，和1.6％，乙醇酸的回收率为43％。此时测定乙醇酸氧化酶显示，已没有剩余的酶活性。
实施例7在一个300ml的EZE-Seal搅拌压力釜反应器(AutoclaveEngineers)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，黄素单核苷酸(0.01mM)，不加HPLC内标(溶液用50％NaOH校正至pH8.3)，将溶液冷却至5℃。先将冷冻的(-80℃)构巢曲霉FT17SYCSL/OL细胞(26g，124IU乙醇酸氧化酶和57800IU过氧化氢酶)在5℃解冻，然后用100ml KH2PO4(50mM，pH7.0)/FMN(0.01mM)缓冲液在5℃下洗四次，将此洗过的细胞连同1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)加入反应器内。形成的混合物以400rpm的速度搅拌，并在5℃，120psig氧压使氧通过混合物，以50ml/min的速率吹入气泡。11小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别是89％，4.5％和2.0％，乙醇酸已被完全转化。
实施例8在一个3盎司的Fischer-Porter玻璃气溶胶反应瓶内放入一个磁搅拌小棒，并加入10ml含有下列成分的水溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)，和黄素单核苷酸(0.01mM)，pH8.3(用50％NaOH校准)，并将溶液冷却至5℃。然后向反应瓶内加入0.47g多形汉逊氏酵母菌转化体GO1(10IU乙醇酸氧化酶和22100IU过氧化氢酶)和1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)，其中转化体GO1已通过用0.1％“TRITON”X-100/l冻融法作了增加渗透性处理。再次用50％NaOH校正反应液pH至8.3后，将反应瓶密封，使反应混合物冷却至5℃。通过用氧气加压至70psig，吹扫反应瓶，再放气至大气压，如此重复5次同时进行搅拌，然后再使反应瓶加压至70psig氧压，并使混合物在5℃下搅拌。按规定的时间间隔，用注射器通过加样孔(不破坏反应瓶内压力)取出等分量(0.10ml)反应混合物，进行HPLC分析，以监测反应进程。16小时后，乙醛酸，甲酸和草酸的HPLC分析产率分别为90.1％，1.3％，和5.9％，剩余乙醇酸盐3.0％。剩余的乙醇酸氧化酶活性和总过氧化氢酶活性分别为它们初始活性的86％和136％。
实施例9(对比试验)重复实施例8中的反应，只是不加入1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigme)。16小时后，乙醛酸，甲酸和草酸的HPLC分析产率分别为57.6％，32.5％和2.6％，剩余乙醇酸盐8.9％。增加渗透性处理细胞剩余的乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的活性，分别为它们初始活性的60％和378％。
实施例10(对比试验)重复实施例8中的反应，只是以加入具有1.4×106单位过氧化氢酶活性的，经增加渗透性处理(0.1％“TRITON”X-100/l冻融处理)的啤酒糖酵母细胞1.67g，代替1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigme)，16小时以后，乙醛酸，甲酸和草酸的HPLC分析产率分别为67.2％，19.7％和6.0％，没有乙醇酸盐剩余。
实施例11在一个3盎司的Fischer-Porter玻璃气溶胶反应瓶内放入一个磁搅拌小棒，并加入10ml含有下列成分的水溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)和黄素单核苷酸(0.01mM)，pH8.3(用50％NaOH校正)，并将溶液冷却至5℃。然后向反应瓶内加入经过用0.1％“TRITON”X-100/l冻融处理，以增加渗透性的巴斯德毕赤氏酵母转化体GS 115-MSP 10细胞(13.2IU乙醇酸氧化酶和21200IU过氧化氢酶)0.75g。用50％NaOH再次校正此混合物的pH至8.3后，将反应瓶密封，使反应混合物冷却至5℃。在搅拌下，通过用氧加压至70psig吹扫反应瓶，再放气至大气压，如此重复5次，然后再使反应瓶加压至70psig氧压，并使混合物在5℃下搅拌。按规定的时间间隔，用注射器通过加样孔(不破坏反应瓶内压力)取出等分量(0.1ml)反应混合物，进行HPLC分析，以监测反应进程。16小时后，乙醛酸，甲酸和草酸的HPLC分析产率分别为30.5％，59.2％，和10.7％，乙醇酸盐剩余0.8％。
实施例12在一个配有Dispersimax旋转混合器的300ml EZE-Seal搅拌压力釜反应器(Autoclave Engineeris)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.500M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)，和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液pH8.3(用50％NaOH校正)，并冷却至5℃。然后向反应器内加入10g经过用0.1％“TRION”X-100/l冻融处理，增加渗透性的巴斯德毕赤氏酵母菌转化体NRRL Y-21001细胞(391IU乙醇酸氧化酶和457000IU过氧化氢酶)，以及1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶(Sigma)。用50％NaOH再次校正此混合物的pH至8.3。以1000rpm的速度搅拌此混合物，氧气经旋转混合器叶轮的作用通过混合物吹入气泡，温度5℃，氧压120psig。反应监测法按规定的时间间隔，分别取出0.40ml等分量反应混合物，用微孔“ULTRAFREE”-MC 10000 NMWL滤器过滤各等分量液，并用HPLC分析滤出液。1.0小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别为89.8％，6.0％，和2.9％，乙醇酸回收率为1.7％。经过增加渗透性处理细胞的乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的最后活性为它们初始活性的117％和78％。
用离心法从上述反应混合物中回收微生物细胞催化剂。将此细胞沉淀未经进一步处理就与100ml新的反应液混合，并另加入1.4×106单位黑色曲霉可溶性过氧化氢酶，重复进行反应。1.0小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别为87.8％，5.0％和5.3％，乙醇酸回收率为2.9％。经增加渗透性处理细胞的乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的最后活性为它们初始活性的172％和61％。
实施例13将经过实施例2中所述反应产生的乙醛酸和AMPA混合物，离心除去构巢曲霉完整细胞催化剂，然后用Amicon“CENTRIPREP”10浓缩器(截止分子量为10000)过滤，除去可溶性黑色曲霉过氧化氢酶。得到的溶液与活性碳(0.50g)共同搅拌除去FMN，过滤后置于300ml的Autoclave Engineers EZE-Seal反应器的316SS杯内，并加入0.50g10％披钯活性碳。反应器用氮气吹扫，然后充入压力300psig氢气，并在27℃，以1000rpm速度搅拌。22小时后，N-(膦酰甲基)-甘氨酸的产率(根据AMPA计算)为80％。
实施例14将经过实施例4中所述反应产生的乙醛酸和AMPA混合物，离心除去构巢曲霉完整细胞催化剂，然后用Amicon“CENTRIPREP”10浓缩器(截止分子量为10000)过滤，除去可溶性黑色曲霉过氧化氢酶。得到的溶液与活性碳(0.50g)共同搅拌除去FMN，过滤后置于300ml的Autoclave Engineers EZE-Seal反应器的316SS杯内，并加入0.50g10％披钯活性碳。反应器用氮气吹扫，然后充入压力300psig氢气，并在27℃，以1000rpm速度搅拌。22小时后，N-(膦酰甲基)-甘氨酸的产率(根据AMPA计算)为89％。
实施例15将经过实施例6中所述反应产生的乙醛酸和AMPA混合物，离心除去构巢曲霉完整细胞催化剂，然后用Amicon“CENTRIPREP”10浓缩器(截止分子量为10000)过滤，除去可溶性黑色曲霉过氧化氢酶。得到的溶液与活性碳(0.50g)共同搅拌除去FMN，过滤后置于一个300ml的玻璃套管内，并加入0.50g 10％披钯活性碳。将此玻璃套管密封在压力釜内，并用氮气吹扫，然后充入压力1000psig氢气，在27℃下振荡混合。11小时后，N-(膦酰甲基)甘氨酸的产率(根据AMPA计算)为76％。
实施例16在一个配有Dispersimax旋转混合器的300ml EZE-Seal搅拌压力釜反应器(Autoclave Engineeris)内装入100ml含有下列成分的溶液乙醇酸(0.50M)，氨甲基膦酸(0.375M)，异丁酸(0.100M，HPLC内标)，和黄素单核苷酸(0.01mM)，溶液pH8.3，并冷却至5℃。然后向反应器内加入30g大肠杆菌转化体细胞(25.2IU乙醇酸氧化酶和39900IU过氧化氢酶)，以1000rpm的速度搅拌此混合物，氧气经旋转混合器叶轮的作用，通过混合物吹入气泡，温度5℃，氧压120psig。反应监测法按规定的时间间隔，分别取出0.40ml等分量反应混合物，用微孔“Ultrafree”-MC 10000 NMWL滤器过滤各等分量液，并用HPLC分析滤出液。19小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别为8.6％，8.3％和1.1％，剩余57.3％乙醇酸。微生物乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的回收活性分别为它们初始活性的10％和68％。
实施例17用具有较高甘醇酸脂氧化酶活性(72IU乙醇酸氧化酶和29600IU过氧化氢酶)的第二个大肠杆菌转化体生长物30g，重复实施例16所述的反应。23小时后，乙醛酸，草酸和甲酸的产率分别为18.3％，1.9％和2.9％，剩余42.6％乙醇酸。微生物乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的回收活性分别为它们初始活性的18％和71％。
通过以上对具有某种程度特殊性的本发明所作的叙述和示例，应该意识到，下列权利要求不是因此而被限制，而是提出了一个与权利要求及其等价物的每个要点的措辞相应的范围。
权利要求
1.一种制备乙醛酸和氨甲基膦酸混合物的方法，该方法包括用氧在含有氨甲基膦酸以及乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的水溶液中，氧化乙醇酸的步骤，其特征在于对该方法的改进包括用表达乙醇酸氧化酶的微生物细胞催化剂。
2.权利要求1的方法，其中所说的微生物细胞催化剂也能表达内源性过氧化氢酶。
3.权利要求2的方法，其中也使用可溶性过氧化氢酶。
4.权利要求1的方法，其中所说的微生物催化剂选自曲霉菌属，汉逊酵母菌属和毕赤酵母菌属。
5.权利要求1的方法，其中所说的微生物催化剂是巴斯德毕赤氏酵母菌。
6.权利要求1的方法，其中所说的微生物催化剂是多形汉逊氏酵母菌。
7.权利要求1的方法，其中所说的微生物催化剂是构巢曲霉菌。
8.权利要求1的方法，其中所说的微生物催化剂是大肠杆菌。
全文摘要
一种改进的，使乙醇酸和氧在存在氨甲基膦酸的水溶液中反应的酶促反应方法，其中的改进包括使用表达乙醇酸氧化酶的徽生物细胞催化剂(例如巴斯德毕赤氏酵母菌，多形汉逊氏酵母菌，构巢曲霉菌或大肠杆菌)和内源性过氧化氢酶；还可能包括可溶性过氧化氢酶。生成的混合物是生产N-(膦酰甲基)甘氨酸的有用中间体。
文档编号C07F9/00GK1153532SQ94195139
公开日1997年7月2日 申请日期1994年6月29日 优先权日1994年6月29日
发明者D·L·安敦, R·迪科西莫 申请人:纳幕尔杜邦公司
再多了解一些
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