专利名称：纳米金属硫蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，具体指一种采用纳米技术制备的、具有高生物敏感性、高生物亲和性和高生物活性的纳米金属硫蛋白及其制备方法。
背景技术：
金属硫蛋白(Metallothionein，简称MT)，是一种广泛存在于动物、植物和微生物体内的生物基团，结构相当稳定，富含功能巯基，具有生物活性的蛋白质，能参与微量元素的代谢和调控，对有害的重金属元素，如铅、镉、汞等具有解毒功能，是目前人们发现的清除自由基、抗衰老、抗辐射能力最强的生物制品，已被联合国教科文组织列为21世纪生物制品的推荐项目。
金属硫蛋白的制备方法一般为先对动物子皮下注射金属诱导剂，如CdCl2诱导其在体内产生金属硫蛋白，取其脏器或肾脏或脑组织切碎匀浆，用Tris-HCl—乙醇—氯仿混合液萃取后分离，冷冻干燥制得。其流程可概括为金属诱导→切碎匀浆→离心分离→上柱分离→超滤脱盐→冷冻干燥→金属硫蛋白制剂。
但由于目前采用的生产技术只能制得粒径在微米级的制品，从而限制了其性能的发挥。
发明内容
本发明的目的在于提出一种采用纳米诱导剂诱导和采用纳米技术处理的工艺方法制备金属硫蛋白，使金属硫蛋白产品的粒径达到纳米级(粒径为0.1-100nm)的水平，即成为纳米金属硫蛋白(Nano-Metallothionein，简称N-MT)，以提高和扩展其性能。
本发明的一种纳米金属硫蛋白，由金属硫蛋白经纳米技术处理获得，所述金属硫蛋白是在对动物体进行诱导剂诱导后在其脏器中提取出的一种低分子量、富含半胱氨酸、且具有高度可诱导性的金属与硫蛋白结合物，在每摩尔金属硫蛋白中含有60-61个氨基酸结合，7-12个金属离子，相对分子量为6000-7000u，含有18-20个巯基，其中半胱氨酸占23-33％，其特征在于金属硫蛋白在诱导时采用由纳米溶质与纳米溶剂构成的纳米诱导剂进行诱导，并对提取的金属硫蛋白以超声雾化纳米化或/和甚低温超声粉碎纳米化技术处理所获得的纳米级微粒。
本发明的一种纳米金属硫蛋白的制备方法，其流程为纳米诱导、捣碎匀浆、分离、超滤脱盐、超声雾化纳米化或/和甚低温超声粉碎纳米化，所述工艺过程均在低温状态下进行。现分述如下●纳米诱导—通过将纳米金属诱导剂注射入动物体，使动物体产生金属与硫蛋白的结合物。如对动物进行5-8天分2-4次皮下注射，诱导动物的脏器产生金属硫蛋白，在诱导结束后一天，摘取动物的脏器；纳米金属诱导剂是以经纳技术制备的纳米金属盐类作溶质，纯水经电子或超声纳米化处理所获得的纳米溶剂配制而成。纳米金属诱导剂是以经纳技术制备的纳米金属盐类作溶质，纯水经电子或超声纳米化处理所获得的纳米溶剂配制而成。
●捣碎匀浆—将动物脏器清洗、捣碎后、进行匀浆处理；●分离—匀浆后进行第一次离心分离，除去沉淀和杂蛋白，取上清液；再次分离，清除杂质，弃上清液；上色谱柱层析分离，收集洗脱液；●超滤脱盐；●纳米制备a)取上道工序的收集液，进行低温超声雾化纳米化，收集产物即为纳米金属硫蛋白；b)或取上道工序的收集液，进行甚低温超声粉碎纳米化，收集产物即为纳米金属硫蛋白；c)或取上道工序的收集液，进行低温超声雾化纳米化和甚低温超声粉碎纳米化，收集产物即为纳米金属硫蛋白。
综上所述，其中捣碎匀浆、分离、超滤脱盐基本上与现行生化工艺相似，而纳米诱导和纳米制备工艺则为本发明所特有。
本发明的优点在于，采用本发明的工艺所获得的纳米金属硫蛋白，由于其微粒粒径已达到纳米级，从而其穿透性、扩张性、表面能、趋向性、附集性均产生质的飞跃，成为一种具有高生物敏感性、高生物亲和性和高生物活性的新型生物制品，它具有零维、高表面能、高运动速度和生物靶向效应，能快速透过细胞，其活性和功能得以大大的提高和扩展。因此在临床使用中用量显著降低，注射次数可以减少。本发明采用超声雾化纳米化、甚低温超声粉碎纳米化等技术手段，不仅效率高，产品得率高，而且可保证纳米生物材料的活性和品质。
具体实施例方式
现结合一按本发明的技术制备纳米金属硫蛋白的实施例作进一步说明。
1.纳米诱导—在活体兔子皮下注射纳米金属诱导剂，第1天30mg/只，第2天和第4天50mg/只，第7天60mg/只，诱导兔体产生金属硫蛋白，第8天屠宰后取其肝脏。
纳米诱导剂的溶质可采用纳米级的盐类如镉盐、锌盐等，本采用ZnCl2或ZnSO4，现已有商品化的纳米氯化锌和纳米硫酸锌出售。纳米溶剂采用纳米水，纳米水是纯水经过电子整水器拆开水分子团的缔合键，因此水分子团的缔合度甚低，完全在纳米级的尺寸范围内，纳米水具有更高的通透性、溶解力和乳化性等活性。
2.捣碎匀浆—将兔子肝脏清洗后，加等体积的Tris-HCl 无水乙醇 氯仿混合溶液在捣碎机上捣碎匀浆。
Tris-HCl 无水乙醇 氯仿混合溶液的配制方法是，取0.01mol的Tris(缓血酸铵)重量，用纳米纯水稀释成1L溶液，再用HCl调节溶液的PH值至PH＝8.6，定容为1L，即成Tris-HCl缓冲液，再按Tris-HClP/无水乙醇/氯仿＝1.00/1.30/0.08的比例配制成Tris-HCl 无水乙醇 氯仿混合溶液。
3.一次分离—在匀浆料中加入2-4倍体积的上述Tris-HCl 无水乙醇 氯仿混合溶液，充分搅拌后，在离心机上高速分离后取上清液，加入2-4倍料液的-20℃无水乙醇，静置12小时以上，以除去沉淀物和杂蛋白。
4.二次分离—取上道工序的上清液，高速离心分离后，弃上清液，取沉淀部分加入0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液后，再次高速分离后，取上清液，进一步除去杂质。
5.层析分离—取上道工序的上清液，上Sephadex G-50色谱柱，再上DEAE-Sepharase Fast Flow层析柱进行离子交换层析分离，并以Tris缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。
6.超滤脱盐—取上道工序收集液，上经碳酸铵平衡的Sephadex G-25色谱柱，同样以Tris缓冲液洗脱，脱盐过程中严格控制流速，经超滤脱盐后收集洗脱液。
7.纳米制备—取上道工序收集液进低温超声雾化纳米化装置进行超声雾化获得纳米金属硫蛋白产品，或将上道工序收集液进行甚低温超声粉碎纳米化装置进行超声粉碎，即得纳米金属硫蛋白产品。
所述超声雾化纳米化装置是利用超声谐振，使MT微粒间相互撞击，分散成更细的微粒，MT微粒中的微量水份，又进一步促进超声“空化”效果，激化MT微粒，使成更细的纳米化微粒，所述甚低温超声粉碎纳米化装置是利用物质材料在甚低温状态下，变为极易破碎的“玻璃体”的原理，对MT材料进行超声粉碎，使成纳米级微粒。
权利要求
1.一种纳米金属硫蛋白，由金属硫蛋白经纳米技术处理获得，所述金属硫蛋白是在对动物体进行诱导剂诱导后在其脏器中提取出的一种低分子量、富含半胱氨酸、且具有高度可诱导性的金属与硫蛋白结合物，在每摩尔金属硫蛋白中含有60-61个氨基酸结合，7-12个金属离子，相对分子量为6000-7000u，含有18-20个巯基，其中半胱氨酸占23-33％，其特征在于金属硫蛋白在诱导时采用由纳米溶质与纳米溶剂构成的纳米诱导剂进行诱导，并对提取的金属硫蛋白以超声雾化纳米化或/和甚低温超声粉碎纳米化技术处理所获得的纳米级微粒。
2.一种纳米金属硫蛋白的制备方法，其特征在于其制备流程为纳米诱导、捣碎匀浆、分离、超滤脱盐、超声雾化纳米化或/和甚低温超声粉碎纳米化，所述工艺过程均在低温状态下进行。
3.根据权利要求2所述的纳米金属硫蛋白的制备方法，其特征在于所述纳米诱导是通过将纳米金属诱导剂注射入动物体，使动物体产生金属与硫蛋白的结合物。
4.根据权利要求2或3所述的纳米金属硫蛋白的制备方法，其特征在于所述纳米诱导是通过将纳米金属诱导剂注射入动物子体内，对动物子进行5-8天分2-4次皮下注射，诱导动物脏器产生金属硫蛋白，在诱导结束后一天，摘取动物的脏器。
5.根据权利要求4所述的纳米金属硫蛋白的制备方法，其特征在于所述纳米金属诱导剂是以经纳技术制备的纳米金属盐类作溶质，纯水经电子或超声纳米化处理所获得的纳米溶剂配制而成。
6.根据权利要求5所述的纳米金属硫蛋白的制备方法，其特征在于所述纳米金属诱导剂的溶质采用纳米级的锌盐，如ZnCl2或ZnSO4。
全文摘要
一种纳米金属硫蛋白，系经纳米诱导剂诱导、纳米技术处理获得的纳米级的金属硫蛋白。其制备方法为纳米诱导、捣碎匀浆、分离、超滤脱盐、超声雾化纳米化或/和甚低温超声粉碎纳米化，所述工艺过程均在低温状态下进行。纳米诱导是通过将纳米金属诱导剂注射入动物体，使动物体产生金属与硫蛋白的结合物。所述超声雾化纳米化是利用超声雾化纳米化装置使金属硫蛋白的微粒纳米化，所述甚低温超声粉碎纳米化是利用甚低温超声粉碎纳米化装置使金属硫蛋白的微粒纳米化。采用本发明的工艺所获得的纳米金属硫蛋白，其活性和功能得以大大的提高和扩展，具有高生物敏感性、高生物亲和性和高生物活性。
文档编号C07K14/825GK1524881SQ03115579
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月28日 优先权日2003年2月28日
发明者陶芒, 崔济忠, 陶 芒 申请人:上海清沁生物科技有限公司
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，具体指一种采用纳米技术制备的、具有高生物敏感性、高生物亲和性和高生物活性的纳米金属硫蛋白及其制备方法。
背景技术：
金属硫蛋白(Metallothionein，简称MT)，是一种广泛存在于动物、植物和微生物体内的生物基团，结构相当稳定，富含功能巯基，具有生物活性的蛋白质，能参与微量元素的代谢和调控，对有害的重金属元素，如铅、镉、汞等具有解毒功能，是目前人们发现的清除自由基、抗衰老、抗辐射能力最强的生物制品，已被联合国教科文组织列为21世纪生物制品的推荐项目。
金属硫蛋白的制备方法一般为先对动物子皮下注射金属诱导剂，如CdCl2诱导其在体内产生金属硫蛋白，取其脏器或肾脏或脑组织切碎匀浆，用Tris-HCl—乙醇—氯仿混合液萃取后分离，冷冻干燥制得。其流程可概括为金属诱导→切碎匀浆→离心分离→上柱分离→超滤脱盐→冷冻干燥→金属硫蛋白制剂。
但由于目前采用的生产技术只能制得粒径在微米级的制品，从而限制了其性能的发挥。
发明内容
本发明的目的在于提出一种采用纳米诱导剂诱导和采用纳米技术处理的工艺方法制备金属硫蛋白，使金属硫蛋白产品的粒径达到纳米级(粒径为0.1-100nm)的水平，即成为纳米金属硫蛋白(Nano-Metallothionein，简称N-MT)，以提高和扩展其性能。
本发明的一种纳米金属硫蛋白，由金属硫蛋白经纳米技术处理获得，所述金属硫蛋白是在对动物体进行诱导剂诱导后在其脏器中提取出的一种低分子量、富含半胱氨酸、且具有高度可诱导性的金属与硫蛋白结合物，在每摩尔金属硫蛋白中含有60-61个氨基酸结合，7-12个金属离子，相对分子量为6000-7000u，含有18-20个巯基，其中半胱氨酸占23-33％，其特征在于金属硫蛋白在诱导时采用由纳米溶质与纳米溶剂构成的纳米诱导剂进行诱导，并对提取的金属硫蛋白以超声雾化纳米化或/和甚低温超声粉碎纳米化技术处理所获得的纳米级微粒。
本发明的一种纳米金属硫蛋白的制备方法，其流程为纳米诱导、捣碎匀浆、分离、超滤脱盐、超声雾化纳米化或/和甚低温超声粉碎纳米化，所述工艺过程均在低温状态下进行。现分述如下●纳米诱导—通过将纳米金属诱导剂注射入动物体，使动物体产生金属与硫蛋白的结合物。如对动物进行5-8天分2-4次皮下注射，诱导动物的脏器产生金属硫蛋白，在诱导结束后一天，摘取动物的脏器；纳米金属诱导剂是以经纳技术制备的纳米金属盐类作溶质，纯水经电子或超声纳米化处理所获得的纳米溶剂配制而成。纳米金属诱导剂是以经纳技术制备的纳米金属盐类作溶质，纯水经电子或超声纳米化处理所获得的纳米溶剂配制而成。
●捣碎匀浆—将动物脏器清洗、捣碎后、进行匀浆处理；●分离—匀浆后进行第一次离心分离，除去沉淀和杂蛋白，取上清液；再次分离，清除杂质，弃上清液；上色谱柱层析分离，收集洗脱液；●超滤脱盐；●纳米制备a)取上道工序的收集液，进行低温超声雾化纳米化，收集产物即为纳米金属硫蛋白；b)或取上道工序的收集液，进行甚低温超声粉碎纳米化，收集产物即为纳米金属硫蛋白；c)或取上道工序的收集液，进行低温超声雾化纳米化和甚低温超声粉碎纳米化，收集产物即为纳米金属硫蛋白。
综上所述，其中捣碎匀浆、分离、超滤脱盐基本上与现行生化工艺相似，而纳米诱导和纳米制备工艺则为本发明所特有。
本发明的优点在于，采用本发明的工艺所获得的纳米金属硫蛋白，由于其微粒粒径已达到纳米级，从而其穿透性、扩张性、表面能、趋向性、附集性均产生质的飞跃，成为一种具有高生物敏感性、高生物亲和性和高生物活性的新型生物制品，它具有零维、高表面能、高运动速度和生物靶向效应，能快速透过细胞，其活性和功能得以大大的提高和扩展。因此在临床使用中用量显著降低，注射次数可以减少。本发明采用超声雾化纳米化、甚低温超声粉碎纳米化等技术手段，不仅效率高，产品得率高，而且可保证纳米生物材料的活性和品质。
具体实施例方式
现结合一按本发明的技术制备纳米金属硫蛋白的实施例作进一步说明。
1.纳米诱导—在活体兔子皮下注射纳米金属诱导剂，第1天30mg/只，第2天和第4天50mg/只，第7天60mg/只，诱导兔体产生金属硫蛋白，第8天屠宰后取其肝脏。
纳米诱导剂的溶质可采用纳米级的盐类如镉盐、锌盐等，本采用ZnCl2或ZnSO4，现已有商品化的纳米氯化锌和纳米硫酸锌出售。纳米溶剂采用纳米水，纳米水是纯水经过电子整水器拆开水分子团的缔合键，因此水分子团的缔合度甚低，完全在纳米级的尺寸范围内，纳米水具有更高的通透性、溶解力和乳化性等活性。
2.捣碎匀浆—将兔子肝脏清洗后，加等体积的Tris-HCl 无水乙醇 氯仿混合溶液在捣碎机上捣碎匀浆。
Tris-HCl 无水乙醇 氯仿混合溶液的配制方法是，取0.01mol的Tris(缓血酸铵)重量，用纳米纯水稀释成1L溶液，再用HCl调节溶液的PH值至PH＝8.6，定容为1L，即成Tris-HCl缓冲液，再按Tris-HClP/无水乙醇/氯仿＝1.00/1.30/0.08的比例配制成Tris-HCl 无水乙醇 氯仿混合溶液。
3.一次分离—在匀浆料中加入2-4倍体积的上述Tris-HCl 无水乙醇 氯仿混合溶液，充分搅拌后，在离心机上高速分离后取上清液，加入2-4倍料液的-20℃无水乙醇，静置12小时以上，以除去沉淀物和杂蛋白。
4.二次分离—取上道工序的上清液，高速离心分离后，弃上清液，取沉淀部分加入0.01mol/L的Tris-HCl缓冲液后，再次高速分离后，取上清液，进一步除去杂质。
5.层析分离—取上道工序的上清液，上Sephadex G-50色谱柱，再上DEAE-Sepharase Fast Flow层析柱进行离子交换层析分离，并以Tris缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。
6.超滤脱盐—取上道工序收集液，上经碳酸铵平衡的Sephadex G-25色谱柱，同样以Tris缓冲液洗脱，脱盐过程中严格控制流速，经超滤脱盐后收集洗脱液。
7.纳米制备—取上道工序收集液进低温超声雾化纳米化装置进行超声雾化获得纳米金属硫蛋白产品，或将上道工序收集液进行甚低温超声粉碎纳米化装置进行超声粉碎，即得纳米金属硫蛋白产品。
所述超声雾化纳米化装置是利用超声谐振，使MT微粒间相互撞击，分散成更细的微粒，MT微粒中的微量水份，又进一步促进超声“空化”效果，激化MT微粒，使成更细的纳米化微粒，所述甚低温超声粉碎纳米化装置是利用物质材料在甚低温状态下，变为极易破碎的“玻璃体”的原理，对MT材料进行超声粉碎，使成纳米级微粒。
权利要求
1.一种纳米金属硫蛋白，由金属硫蛋白经纳米技术处理获得，所述金属硫蛋白是在对动物体进行诱导剂诱导后在其脏器中提取出的一种低分子量、富含半胱氨酸、且具有高度可诱导性的金属与硫蛋白结合物，在每摩尔金属硫蛋白中含有60-61个氨基酸结合，7-12个金属离子，相对分子量为6000-7000u，含有18-20个巯基，其中半胱氨酸占23-33％，其特征在于金属硫蛋白在诱导时采用由纳米溶质与纳米溶剂构成的纳米诱导剂进行诱导，并对提取的金属硫蛋白以超声雾化纳米化或/和甚低温超声粉碎纳米化技术处理所获得的纳米级微粒。
2.一种纳米金属硫蛋白的制备方法，其特征在于其制备流程为纳米诱导、捣碎匀浆、分离、超滤脱盐、超声雾化纳米化或/和甚低温超声粉碎纳米化，所述工艺过程均在低温状态下进行。
3.根据权利要求2所述的纳米金属硫蛋白的制备方法，其特征在于所述纳米诱导是通过将纳米金属诱导剂注射入动物体，使动物体产生金属与硫蛋白的结合物。
4.根据权利要求2或3所述的纳米金属硫蛋白的制备方法，其特征在于所述纳米诱导是通过将纳米金属诱导剂注射入动物子体内，对动物子进行5-8天分2-4次皮下注射，诱导动物脏器产生金属硫蛋白，在诱导结束后一天，摘取动物的脏器。
5.根据权利要求4所述的纳米金属硫蛋白的制备方法，其特征在于所述纳米金属诱导剂是以经纳技术制备的纳米金属盐类作溶质，纯水经电子或超声纳米化处理所获得的纳米溶剂配制而成。
6.根据权利要求5所述的纳米金属硫蛋白的制备方法，其特征在于所述纳米金属诱导剂的溶质采用纳米级的锌盐，如ZnCl2或ZnSO4。
全文摘要
一种纳米金属硫蛋白，系经纳米诱导剂诱导、纳米技术处理获得的纳米级的金属硫蛋白。其制备方法为纳米诱导、捣碎匀浆、分离、超滤脱盐、超声雾化纳米化或/和甚低温超声粉碎纳米化，所述工艺过程均在低温状态下进行。纳米诱导是通过将纳米金属诱导剂注射入动物体，使动物体产生金属与硫蛋白的结合物。所述超声雾化纳米化是利用超声雾化纳米化装置使金属硫蛋白的微粒纳米化，所述甚低温超声粉碎纳米化是利用甚低温超声粉碎纳米化装置使金属硫蛋白的微粒纳米化。采用本发明的工艺所获得的纳米金属硫蛋白，其活性和功能得以大大的提高和扩展，具有高生物敏感性、高生物亲和性和高生物活性。
文档编号C07K14/825GK1524881SQ03115579
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月28日 优先权日2003年2月28日
发明者陶芒, 崔济忠, 陶 芒 申请人:上海清沁生物科技有限公司
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