专利名称：可用作制备紫杉烷的中间体用化合物的对映体混合物离析用酶促方法
技术领域：
本发明涉及可以用作制备紫杉烷，尤其是制备带有含杂环或环烷基的C-13侧链的紫杉烷的中间体化合物的对映体混合物离析用酶催方法。
紫杉烷类(Taxanes)是一些在药物领域找到实用性的二萜烯化合物。例如，在C-13侧链上含杂环或环烷基团的紫杉醇(Taxol)类似物可以用作抗癌剂。这样的紫杉醇类似物可以通过半合成路线，尤其可以通过把β-内酰胺或开链中间体耦合到紫杉烷核上形成C-13侧链的方法制备。由于这些类似物的主体化学可以影响其药物活性，所以在已有技术中设法采用有效的立体有择的制备所说的中间体β-内酰胺和开链化合物以及最终产物紫杉烷的方法。
本发明提供可以用作制备一种带有含杂环或环烷基的C-13侧链的紫杉烷的中间体化合物的对映体混合物，尤其是外消旋混合物的有效离析法，以及立体有择的制备这些化合物的有效方法。
具体讲，本发明提供一种离析含对映体Ⅰa和Ⅰb的混合物Ⅰ的方法，其中在Ⅰa和Ⅰb中的R1均处于R2的顺位上或者Ⅰa和Ⅰb中的R1均处于R2的反位上
式中R1是羟基，卤素或-O-C(O)-R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基;
R2是杂环基或环烷基;以及R3是氢，R4，-C(O)-OR4或-C(O)R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;
所说的方法包括使所说的混合物Ⅰ与能够使所说的化合物Ⅰa或Ⅰb中一种化合物催化立体有择的转化成为非对映体形的酶或微生物接触，并且进行所说的转化的步骤。
本发明还提供一种离析含对映体Ⅳa和Ⅳb的混合物Ⅳ的工艺方法
和其中Ta是
而且Tb是 Ta是 和Tb是 其中R1在Ⅳa和Ⅳb中均相对于基团W处于赤位或者在Ⅳa和Ⅳb中均相对于基团W处于苏位;
W是-NHR3或-N3R1是羟基，卤素，或-O-C(O)R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基;
R2是杂环基或环烷基;
R3是氢，R4，-C(O)OR4，或-C(O)R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;
R6是氢，或R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;
所说的方法包括使所说的混合物Ⅳ，与能够使所说的化合物之一Ⅳa或Ⅳb催化立体有择的转化成为非对映体形的酶或微生物接触并且进行所说转化的步骤。
上面提到的立体有择转化的例示方案，包括立体有择水解、立体有择酯化、立体有择酯转移和立体有择脱卤，尤其是立体有择的水解或酯化。
式Ⅰ或Ⅳ化合物上的羟基之类的基团可以选择性地加以保护，以便用于本发明的离析方法中，然后可以任意选择性地使这样的基团脱保护。
本发明的方法进一步说明如下。
顺式对映体下列顺式对映体可以用本发明的酶催法分离 即其中R1均处于Ⅰa和Ⅰb中R2之顺位上的对映体Ⅰa和Ⅰb。
优选按本发明上述方式离析顺式对映体的混合物。
反式对映体下列的反式对映体对可以用本发明的酶催法分离
即对映体Ⅰa和Ⅰb，其中R1在Ⅰa和Ⅰb中均处于R2的反位。
赤式对映体下列赤式对映体对可以用本发明的酶促法分离 即对映体Ⅳa和Ⅳb，其中R1在Ⅳa和Ⅳb中均处于基团W的赤位上。
苏式对映体下列苏式对映体对可以用本发明的酶催法分离 即对映体Ⅳa和Ⅳb，其中R1在Ⅳa和Ⅳb中均处于基团W的苏位上。
离析混合物Ⅰ的优选方案优选用立体有择地水解、酯化或脱卤离析含β-内酰胺Ⅰa和Ⅰb对映体混合物的混合物Ⅰ。一种具体优选的用于离析含对映体Ⅰa(1)和Ⅰb(1)的混合物Ⅰ
形成含化合物Ⅱa(1)和Ⅱb(1)的混合物Ⅱ的方法 其中R2是杂环基或环烷基;而且R3是氢，R4，-O-C(O)-OR4或-C(O)-R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基;
所说的方法包括下列步骤(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)中任一步骤(ⅰ)当R1是-O-C(O)-R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R1a和R1b中一个与R1相同，另一个是羟基时，在水和/或有机醇存在下使所说的混合物Ⅰ与能将混合物Ⅰ催化立体有择水解形成所说的混合物Ⅱ的酶或微生物接触的步骤;或者
(ⅱ)当R1是羟基，而且R1a和R1b中一个是羟基而另一个R4-C(O)-O-时，其中R4独立选自上面对R4定义的那些基团时;在化合物Ⅲ存在下R4-C(O)-L (Ⅲ)(式中R4与上面对R1a或R1b定义的相同，而且L是离去基团)，使所说的混合物Ⅰ与能够将混合物Ⅰ催化立体有择酯化形成所说混合物(Ⅱ)的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅲ)当R1是卤原子时，而且R1a或R1b中一个是卤素而另一个是羟基时，使所说的混合物Ⅰ，在氢氧离子给予体存在下，与能使混合物Ⅰ催化立体有择脱卤形成所说混合物Ⅱ的酶或微生物接触的步骤。
上述方法可以用来离析本发明的其它对映体混合物，但是优选离析上面的顺式对映体Ⅰa(1)和Ⅰb(1)。
离析混合物Ⅳ的优选方法混合物Ⅳ优选用立体有择的水解、酯化、脱卤或酯交换作用离析。离析包含对映体Ⅳa(1)和Ⅳb(1)的混合物Ⅳ
形成含化合物Ⅴa(1)和Ⅴb(1)的混合物Ⅴ的具体优选方法 式中R2是杂环或环烷基，R3是氢，R4，-C(O)-OR4或-C(O)-R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基杂环基，而且R6是氢或R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;所说方法包括下列步骤(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)中之一(ⅰ)当R1是-O-C(O)-R4，R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R1a和R1b之一个与R1相同，另一个是羟基时，在水和/或有机醇存在下，使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择水解混合物Ⅳ成为所说的混合物Ⅴ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅱ)当R1是羟基，而且R1a和R1b中之一是羟基，另一个是R4-C(O)-O-，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团时;在化合物Ⅲ存在下
(式中R4如上面对R1a或R1b中的定义，而且L是离去基团)，使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择酯化混合物Ⅳ成为所说混合物Ⅴ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅲ)当R1是卤原子时，而且R1a或R1b中一个是卤素，另一个是羟基时，在氢氧离子给予体存在下，使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择的混合物Ⅳ脱卤形成所说混合物Ⅴ的酶或微生物接触的步骤。
离析包含对映体Ⅳa(1)和Ⅳb(1)的混合物Ⅳ 形成含化合物Ⅵa(1)和Ⅵb(1)的混合物Ⅵ的进一步具体优选的方法
式中R1是羟基，卤素、或-O-C(O)-R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基;
R2是杂环基或环烷基;而且R3是氢，R4，-C(O)-OR4，或-C(O)-R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;
所说方法包括下列步骤(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)中之一(ⅰ)当R6是氢，而且R6a或R6b之一是氢，另一个是R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团时，在式Ⅶ有机醇存在下
(其中R4如上面对R6a或R6b的定义)使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择酯化混合物Ⅳ形成为所说混合物Ⅳ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅱ)当R6是R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R6a和R6b之一与R6相同，另一个是氢时，在水存在下，使所说的混合物Ⅳ与能将混合物Ⅳ催化立体有择水解形成所说混合物Ⅵ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅲ)当R6是R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R6a和R6b中之一与R6相同，另一个是R7，而R7是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基，条件是R7不同于R6时，在式Ⅷ有机醇存在下，
(式中R7如上述定义同)使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择酯转移混合物Ⅳ成所说混合物Ⅵ的酶或微生物接触的步骤;
上述方法可以用在离析本发明的其它对映体混合物上，但是优选离析上述对映体Ⅳa(1)和Ⅳb(1)。
这样制出的化合物对，如Ⅱa(1)和Ⅱb(1)，是非对映体式的，然后可以被分离成旋光性化合物，优选分离成旋光纯化合物。制出一种旋光纯度达99%以上，特别优选是99.5%的化合物。
本发明还提供一种基本上无其它异构体的混合物Ⅰ或Ⅳ中的化合物，此化合物可以用本发明方法制成。
定义使用的术语“立体有择的转化”，指一种对映体相对于另一对映体优先反应，即不对称的对映体选择性反应。术语“立体有择地水解”、“立体有择地酯化”、“立体有择的脱卤”和“立体有择的酯转移”，同样分别指一种对映体相对于另一种对映体优先水解、酯化、脱卤和酯转移。
就对映体化合中所用的术语“混合物”是指含等量(外消旋)或不等量对映体的混合物。
所用的术语“离析”指部分，以及优选完全离析。
所用术语“非对映体形”指源于对映体对的一种化合物结构，其中至少一个基团被改造，使所说的化合物不再是原来对映体对中另一化合物的镜像。
所用术语“酶催工艺方法”或“酶催方法”，指使用酶或微生物的本发明的工艺方法或方法。
单独地或者作为部分另外基团而使用的术语“烷基”是指直链或支链的、在直链中含1～15碳原子，优选含1～6个碳原子的、任意取代的烃基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、异己基、庚基、4，4-二甲戊基、辛基、2，2，4-三甲戊基、壬基、癸基、十一碳烷基、十二碳烷基、以及其各种支链异构体等等。取代基包括选自下列的一个或多个基团卤素(尤其是氯)、三卤甲基、烷氧基(如两个烷氧基取代基形成乙缩醛时)、芳基(如未取代的芳基、烷芳基卤代芳基)、环烷基(如未取代的环烷基或烷基环烷基)、羟基或被护羟基、羧基、烷氧羰基、烷氨基、烷羰氨基、氨基、芳羰氨基、硝基、氰基、硫羟基或烷硫基。
单独或作为部分其它基团使用的术语“链烯基”，是指上面对烷基所述的，至少还含一个碳-碳双键的、任意取代的基团。取代基实例包括一个或多个如上所述的烷基和/或一个或多个上面作为烷基取代基所述的基团。
单独或作为部分其它基团使用的术语“炔基”，是指上面对于烷基所述的、至少还含一个碳-碳叁键的任意取代的基团，具体取代基包括上述一个或多个烷基，和/或上面作为烷基取代基所述的一个或多个基团。
单独或作为部分其它基团所用的术语“环烷基”，是指包含1～3个环以及3～12个环碳原子，优选含3～8个环碳原子的、任意取代的饱和环状烃基团，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、环十二碳烷基和金刚烷基(adamantyl)。具体取代基包括一个或多个上述烷基，和/或一个或多个上面作为烷基取代基所述的基团。
单独或作为部分其它基团使用的术语“环烯基”，指上面针对环烷基所述的任意取代的基团，在其环系中还包含至少一个碳-碳双键。具体取代基包括一个或多个上述的烷基，和/或一个或多个上面作为烷基取代基所述的基团。
单独或作为部分其它基团所用的术语“芳基”，是指在环部分中包含6～12个碳原子的任意取代的碳环芳基，优选单环或双环基团，如苯基、联苯基、萘基，取代的苯基、取代的联苯基或取代的萘基。具体取代基(优选三或更少)包括一个或多个下列基团烷基(如未取代的烷基、卤代烷基、或环烷基烷基)、卤素、烷氧基(如未取代的烷氧基或卤代烷氧基)、羟基、芳氧基(如苯氧基)、R4-羰氧基(R4定义如上)，烯丙基、环烷基、烷氨基、二烷氨基、酰氨基(如烷羰氨基或芳羰氨基)、氨基、硝基、氰基、链烯基、硫羟基、R4-羰基(R4定义如上)或亚甲基二氧基(其中亚甲基可以被一个或二个低级烷基、一个或二个芳基链烯基和/或一个或二个烷硫基取代)。具体优选的芳基是苯基、取代的苯基，尤其是被一个或多个羟基、烷基和/或烷氧基取代的苯基。
单独或者作为部分其它基团所用的术语“卤素”或“卤”，指氯、溴、氟和碘。
单独或者作为部分其它基团所用的术语“杂环”或“杂环的”是指任意取代的、完全饱和或不饱和的、单环或双环的、芳族或非芳族的、至少在一个环上有至少一个杂原子而且每个环优选有5或6个原子的烃基。所说的杂环基团，优选环中有1个或2个氧原子、1个或2个硫原子，和/或1-4个氮原子而且可以通过碳或杂原子可以被连到该分子其它部分上。具体取代基包括一个或多个下列基团卤素、烷氧基、羟基、芳基(如苯基或卤代苯基)、链烷酰氧基、芳羰氧基(如苄酰氧基)、烷基(如芳烷基)、烷氨基、链烷酰氨基、芳羰氨基、氨基、硝基、氰基和硫羟基。具体杂环基团包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡啶基、咪唑基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂 基、吲哚基、异吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并噁二唑基和苯并呋咱基。
使用的术语“羟基保护基”，指能保护游离羟基(“被护羟基”)的基团，而且采用该保护反应后可以将其除去而不影响该分子的其余部分。羟基的各种保护基及其合成，可以在T.W.Greene，John Wiley和Sons或Fiser和Fiser著<有机合成中的保护基>(1981年)中查到。具体的羟基保护基包括甲氧甲基、1-乙氧乙基、苄氧甲基、(β-三甲基甲硅烷基乙氧)甲基、四氢吡喃基、2，2，2-三氯乙氧羰基，叔丁(二苯基)甲硅烷基、三烷基甲硅烷基、三氯甲氧羰基和2，2，2-三氯乙氧甲基。
原料本离析法用的原料，可以按本文实施例中所述，或者按1992年1月15日提交的07/822015号美国专利申请中所述相似的方法得到。
原料Ⅰ或Ⅳ中可以含例如化合物Ⅰa和Ⅰb或者Ⅳa和Ⅳb化合物的非对映异构体，但是最好在实施本发明的酶催离析法之前分离这样的化合物。
优选的化合物式Ⅰ的顺式化合物，具有优选用作制备带C-13侧链紫杉烷的中间体化合物中存在的那种立体异构体构型。具有与相当于化合物Ⅰa的(其中R1是乙酰氧基，R2是呋喃基，而且R3是3R，4S构型中的氢)绝对立体构型相同的混合物Ⅰ和Ⅱ的化合物，是特别优选的。
式Ⅳ的赤型化合物，具有优选用作制备带C-13侧链的紫杉烷中间体化合物中的那种立体异构构型。优选这样一些混合物Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的化合物，它们具有与相当于(其中R1是羟基，R2是呋喃基，W是-NHR3而且R3是氢，以及R6是2R，3S构型中氢的)化合物Ⅳa(1)的同样的绝对立体构型。
在混合物Ⅳ中，优选Ta＝ 而且Tb＝ 优选离析式Ⅰ的β-内酰胺。
在本发明的化合物中，R1优选链烷酰氧基如未取代的链烷酰氧基(如乙酰氧基)或羟基，R2优选呋喃基或噻吩基，而且R3优选氢、苯基、取代的苯基、苯羰基、取代的苯羰基、烷羰基、链烯羰基、或烷氧羰基(如叔丁氧羰基)。R6优选氢或甲基等C1-C6烷基。
酶和微生物本发明方法中所用的酶或衍生物，可以是具有本文所述催化立体有择转化能力的任何酶或微生物。各种酶，如酯酶、脂肪酶和蛋白酶等，无论其来源和纯度如何均适于本发明中使用。所说的酶可以是例如动物、植物或其混合物形，微生物的细胞、碎细胞、细胞提取液或合成物的形态。
就所用的微生物而言，本发明的方法可以用具有本文所述催化立体有择转化能力的任何微生物细胞材料实施。该细胞可以用原始的湿细胞或者干燥(如冷冻干燥、喷雾干燥或加热干燥)的细胞，也可以用处理过的细胞材料，如碎细胞或细胞提取液。
所说的酶或微生物材料，可以在游离态下或在载体上(如聚合的树脂上)经物理吸附或截面等方式固定化形态下使用。
适于用作催化酶来源的微生物的具体属，包括毛霉属、埃希氏杆菌属(Escherichia)葡萄球菌属、土壤杆菌属、不动细菌属、根霉菌属、曲霉属、诺卡氏菌属、链霉菌属、木霉属、假丝酵母菌属、红酵母属、球拟酵母属、麦形杆菌属、杆菌属、产硷杆菌属、假单孢菌属、红球菌属、短杆菌属、地霉属、肠杆菌属、色杆菌属、分节孢子杆菌属(Arthrobacter)、微杆菌属、分支杆菌属、酵母菌属、青霉属、甲烷杆菌属、葡萄孢属、毛壳菌属、蛇孢壳菌属、分支孢子菌属等等。也可以设想使用遗传工程得到的宿主细胞。
适于本发明工艺方法使用的具体微生物包括Chromobacterium Viscosum、绿脓杆菌(Pseudomonas aeuriginosa，如ATCC 25619)、萤光假单孢菌、恶臭假单孢菌(如ATCC 31303)、卵状假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪产碱杆菌、灰色链霉菌、洋葱假单胞菌、Candida rogosa(如ATCC 14830)、白地霉(如ATCC 32345)、Streptomyces clavuligerus、Nocadia erthropolis、星状诺卡氏菌、草分支杆菌、放射形土壤杆菌、黑曲霉、米根霉等等，实施本发明方法时，除单一菌株外，可以使用二或多种微生物菌株。
本文使用的术语“ATCC”指美国典型培养物保藏中心的保藏号，该中心地址12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，该中心保藏所说的微生物。
本发明的离析方法可以在所用的衍生物生长后或者与之同时进行，在后一情况下指现场发酵和离析。微生物的生长可以采用本领域普通技术人员熟知的，例如采用含碳源、氮源和痕量元素等营养物的适当培养介质达到。
适于本发明使用的市售酶实例包括脂肪酶，如Amano PS-30洋葱假单胞菌、Amano GC-20白地霉、Amano APF(黑曲霉)、Amano AK(假单孢菌株)、萤光假单孢菌脂肪酶(Biocatalyst Ltd.)、Amano脂肪酶P-30(Candida cylindracea)、Amano N雪白根霉、Amano R(青霉菌株)、Amano FAP米根霉、Amano AP-12(黑曲霉)、Amano MAP(Mucor meihei)、Amano GC-4(白地霉)、Sigma L-0382和L-3126(猪胰腺酶)、(Sapracor)的脂肪酶。酯酶30000(Gist-Brocarde)，KID脂肪酶(Gist-Brocarde)，脂肪酶R(根霉菌株，Amano)，Sigma L-3001(麦病菌)，Sigma L-1754(Candida cylindracea)，Sigma L-0763(Chromobacterium viscosum)和Amano K-30(黑曲霉)。由动物组织得到的酶实例包括由猪肝得到的酯酶、α-胰凝乳蛋白酶以及由猪胰脂肪酶之类胰腺得到的胰酶(Sigma)。进行此发现方法时，除单种酶之外，可以用两种或多种酶。
在下列反应路线中进一步说明本发明的优选方案。虽然为说明目的这些反应路线说明某些顺式对映体混合物的离析，但是应当理解到所述的具体方案也适于离析本发明的其它对映体混合物。
反应路线Ⅰ酯化法离析对映体混合物 产物 R6a或R6b之一＝OH;另一个＝R4
反应路线Ⅱ酯转移法离析对映体混合物 产物 R6a或R6b之一＝R6;另一个＝R7混合物Ⅰ和Ⅳ可以按上反应路线Ⅰ所示的立体有择酯化，而且混合物Ⅳ可以按上反应路线Ⅱ所说明的立体有择地酯转移。
(A)酰化利用酰化剂(Ⅲ)
式中R4可以是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基，可以将混合物Ⅰ选择性酯化成混合物Ⅱ，将混合物Ⅳ选择性酯化成混合物Ⅴ。式Ⅲ中的R4基团，优选烷基团，如C1-C6烷基团，尤其是甲基。L是可以被置换形成酯基的离去基团。L基团实例，包括卤素原子，羟基、烷氧基或链烯氧基。L基团优选链烯氧基，最优选C1-6链烯氧基，如CH2＝CH-O-和CH2＝C(CH3)-O-。具有酯化作用的任何式Ⅲ酰化剂均可以使用，最优选乙酸异丙烯酯和乙酸乙烯酯。
(B)用醇酯化用式Ⅶ的有机醇
式中R4可以是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基，优选烷基，具体优选C1-6烷基;可以选择性酯化混合物Ⅳ为混合物Ⅵ。
(C)用醇酯转移用式Ⅷ的醇
式中R7可以是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基，但是R7不同于R6，可以将混合物Ⅳ选择性酯转移形成混合物Ⅵ。最好使R7与R6尽可能不同，以便于以后从带R6-O-C(O)-基团的化合物中分出带R7-O-C(O)-基团的化合物。因此，优选使用这样一些式Ⅷ的醇，其中的R7在分子量方面不同于R6基团，或者赋予被酯转移的酯以不同的物理或化学性质。
酯化(酰化)操作(A)以及酯化和酯转移操作(B)和(C)，优选在有机溶剂中进行。适于本发明使用的具体溶剂，包括1，1，2-三氯-1，2，2-三氟乙烷、甲苯、环己烷、苯、己烷、庚烷、异辛烷、辛烷、甲乙酮、甲基异丁基酮等等。最好在反应混合物中加入少量水。存在水时，水在反应混合物中的浓度，按溶剂重量计优选约为0.01～1%，或者使其浓度小或等于该有机溶剂饱和时的浓度。按溶剂重量计，最优选的水存在量约为0.05～0.5%，所说的反应溶液优选在每ml溶剂中约含5～250mg对映体原料化合物。
为进行这些过程，向反应介质中加入化合物Ⅲ、Ⅶ或Ⅷ。化合物Ⅲ与混合物Ⅰ或Ⅳ中化合物间摩尔比，优选约1∶1～4∶1;化合物Ⅶ与混合物Ⅳ中化合物间摩尔比，优选约1∶1～4∶1;化合物Ⅷ与混合物Ⅳ中化合物间摩尔比优选约1∶1～4∶1。
在这些操作方法中使用的酶或微生物，优选脂肪酶、酯酶或能产生这些酶的微生物。在这些方法中具体优选的酶或微生物是由假单孢菌株产生的脂肪酶PS-30，由假单孢菌得到的脂肪酶P-30，由青霉菌株产生的脂肪酶R，以及由Rhizopus niveus产生的脂肪酶N、由黑曲霉产生的脂肪酶APF、由Geotrichum candidum产生的脂肪酶GC-20、由假单孢菌株产生的脂肪酶AK、由念珠菌株产生的脂肪酶AY-30以及萤光假单孢菌脂肪酯等脂肪酶。
酶可以在例如游离态或固定态下使用。本发明的一种优选方案是将酶吸附在适当载体上，例如硅藻土(多孔硅藻土Hyflo Supercel)、微孔聚丙烯(Enka Accurel 聚丙烯粉)或非离子型聚合吸附剂，如由Rohm和Haas公司产的Amberlite XAD-2(聚苯乙烯)或XAD-7(聚丙烯酸酯)上。用载体固定酶时，载体可以控制在有机溶剂中使用时酶的粒度和阻止酶粒聚集。例如，可以在硅藻土Hyflo Supercel存在下用冷丙酮沉淀酶的水溶液，然后真空干燥之;或者在用非离子型吸附剂的情况下，在摇动器上用吸附剂培养酶溶液，除去过量的溶液，并在真空下干燥酶-吸附剂树脂，用这样的方法可以完成固定操作。优选将酶加到反应溶液中，使浓度达到每ml溶剂含约5～200mg酶。虽然希望使用尽可能最少量的酶，但是所需的酶量将依所用酶的比活性而变化。
这些方法也可以用含有能够催化立体有择转化作用的酶的微生物细胞来进行。用微生物进行离析时，习惯上利用向所需的反应介质中加入所说细胞和对映体混合物原料的方法进行这些操作。细胞可以用原样细胞或干燥(如冷冻干燥、喷雾干燥或加热干燥)的细胞，或者固定的细胞，或者用丙酮、甲苯之类有机溶剂处理过的细胞。细胞也可以用处理过的细胞材料，如碎细胞或细胞提取液。也可以使用前述的固定在硅藻土(Celite )或聚丙烯(Accurel )上的细胞提取液。
优选在4～60℃左右，最优选在约30～50℃温度下培养反应介质。反应时间可以根据所用的酶量及其比活性而适当变化。增加反应温度和/或提高加至反应溶液中的酶量，可以缩短反应时间。
反应路线Ⅲ水解离析对映体混合物 产物
正如从上反应路线Ⅲ所能看出的那样，利用水和/或有机醇可以使混合物Ⅰ和Ⅳ分别立体有择地水解形成混合物Ⅱ和Ⅴ，而且混合物Ⅳ可以用水立体有择地水解形成混合物Ⅵ。初始对映体化合物中的R4(形成部分R1)和R6。优选烷基，最优选C1-6烷基，如甲基。
作为有机醇，可以用式Ⅸ的化合物
式中R8是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基团，优选甲基等烷基。使用有机醇Ⅸ，可能导致形成副产物酯R4-C(O)-OR8。用水作水解剂可能导致形成副产物酸R4-C(O)-OH。当这些酸性副产物生成时为了维持稳定的pH，可以加入碱金属氢氧化物类的碱。用有机醇Ⅸ时，其加入量最好使化合物Ⅸ与混合物Ⅰ或Ⅳ中化合物间摩尔比达到约1∶1～4∶1。
这些方法优选用能催化立体有择水解作用的水溶性酶。脂肪酶和酯酶以及胰酶和α-胰凝乳蛋白酶特别适于这些方法中使用。这些酶的粗品或纯品，无论呈游离态还是在载体上(如在XAD-7、XAD-2树脂或Accurel 树脂上)的固定态下均可以使用。在这些方法中特别优选由洋葱假单孢菌株得到的脂肪酶PS-30(Amano Int′l)、由假单孢菌株得到的脂肪酶P-30(Amano)、脂肪酶GC-20白地霉(Amano Int′l)、脂肪酶N(Rhizopus niveus)(Amano Int′l)、脂肪酶APF(黑曲霉)(Amano Int′l)、脂肪酶AY-30(念珠菌株)(Amano)、脂肪酶AK(假单孢菌)(Amano Int′l)、萤光假单孢菌脂肪酶(Biocatalyst Ltd)、酯酶30000(Gist-Brocarde)、脂肪酶OF(Sepracor)、KID脂肪酶(Gist-Brocarde)、脂肪酶R(根霉菌，Amano Int.)和猪胰腺脂肪酶(Sigma Chem)。
上述水解优选在水介质，例如缓冲的水(如磷酸盐缓冲液)介质中，或者在含可溶混或不可溶混的有机溶剂的水介质中进行。例如，此反应在包括与水不可溶混的有机相和水相的二相溶剂体系中进行。采用两相溶剂体系可以提高这样的方法在基体材料不溶于水中情况下的效率。
两相溶剂体系中有机相用溶剂，可以是与水不可溶混的任何有机溶剂，如甲苯、环己烷、二甲苯、三氯三氟乙烷等等。水相用水方便(优选去离子水)或者适当的水缓冲液，尤其是磷酸盐缓冲溶液，所说的两相溶剂体系优选含约10～90容积%有机相和约90～10容积%水相。
优选对映体混合物量为每毫升反应溶液中约含0.1～100mg，而且在每mg待水解的原料中约含0.1～100mg一种或多种酶。
该反应混合物优选调节到并保持在约pH7，最好用碱金属的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐的水溶液调节pH。
反应时间可以根据酶、温度和酶浓度选取。优选的反应温度约4～60℃。
反应路线Ⅳ脱卤法离析对映体混合物 产物 R1a或R1b之一＝X;另一个＝OH R1a或R1b之一＝X;另一个＝OH正如可以从上反应路线Ⅳ所看出的那些，混合物Ⅰ和Ⅳ可以分别选择性地脱卤形成混合物Ⅱ和Ⅴ，其中X指卤素原子。
能进行这些反应的任何化合物，均可以用作氢氧离子给予体。这种化合物的实例，可以选自水、碱金属或硷土金属的氢氧化物(如氢氧化钠或氢氧化钾)以及氢氧化铵，如季铵的氢氧化物(如式(R9)4NOH的化合物，其中R9是氢或烷基)，特别是氢氧化钾和水。所加入的氢氧离子给予体量，最好使氢氧离子给予体与混合物Ⅰ或Ⅳ对映体原料之间的摩尔比处于约1∶1～4∶1。
优选使用含水和有机溶剂(如甲苯或己烷)的反应介质。对映体原料的优选用量为每毫升溶剂约1～100mg。
脱卤反应中使用的酶或微生物，最好选自假单孢菌属、木霉属、分支杆菌属、不动细菌属、产硷杆菌属、诺卡氏菌属、红球菌属、甲烷细菌属、变形杆菌属或由它们产生的酶;其用量优选为每毫克待脱卤的原料约用0.1～10mg酶。
最好采用约4～50℃间的温度。
分离立体有择转化的产物，可以用萃取、蒸馏、结晶、柱色谱等操作法加以离析和纯化。
用本发明方法形成的产品混合物分离的优选方法是液-液萃取法。
实用性紫杉烷类，是含紫杉烷碳骨架的二萜烯化合物 此骨架在其环系中可以含烯不饱和键。具有特别意义的紫杉烷类，是具有上述碳骨架的这样一些化合物，其中第11和12位通过烯键结合，而且在第13位上的侧链。具有药理活性的紫杉烷类，如紫杉醇类似物可以作为抗癌剂治疗患癌症(如卵巢癌、黑素癌、乳房癌、结肠癌或肺癌)以及白血病的病人。
按本发明方法得到的经离析的化合物，特别适于作为在所说的紫杉烷骨架上形成上面提到的C-13侧链的中间体使用。引入这样的侧链以及其自身，可以赋予紫杉烷产物以改善的或更好的药理活性，或者可以形成更易于转化成具有比原始化合物改善的或更好的药理活性的紫杉烷的紫杉烷产物。
根据本发明的方法离析的化合物在用于形成侧链之前可以加以改变。例如，经离析的含叠氮基N3作为基团W的化合物可以用还原剂处理形成可以被取代的氨基。
侧链形成用的具体方法以及可以用这样的方法形成紫杉烷产物的方法，包括534708号欧洲专利申请以及第08/080704(1993.6.28申请)、08/029819(1993.3.11申请)、07/996455(1992.12.24申请)、08/062687(1993.5.20申请)07/981151(1992.11.24申请)和07/995443(1992.12.23申请)号的美国专利申请中所述的方法。上述文件均通过参照并入本文之中。
反应物或产物的盐或溶剂化物，可以适当或在本发明方法中需要时加以使用或制备。
本发明的方法通过下列实施例作进一步说明;这些实施例仅仅用于说明而不是以任何方式限制权利要求的范围。
实施例1离析(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮用基质的合成(A)N，N′-[(2′-呋喃基)甲基]-2-呋喃甲亚胺制备 向3升备有温度计和机械搅拌器的二颈圆底烧瓶中加入2-糠醛(糠醛，311ml，3.75mol，Aldrich)和2-丙醇(IPA，0.75升，试剂级)。搅拌下一次加入1.5升浓NH4OH(水溶液，～30%)(22.2mol)，在前二小时观察到放热(～35℃)。过滤(Whatman Nol)分离形成的米色粉末，水(1.5升)洗后30℃下真空干燥过夜，得出255.3克(产率76.1%)米色粉状标题的糠醛胺，熔点(mp)116-117℃，其Rf值为0.5(乙酸乙酯(EtOAc)/己烷1∶1，UV显示)。
(B)(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮制备(ⅰ)Staudinger反应
其中“AC”指乙酰基(CH3-C(O)-)“(±)”是指就氮杂环丁烷环上第3和4位上顺式对映体的外消旋物。
向备有温度计、压力平衡滴液漏斗和机械搅拌器的2升三颈圆底烧瓶中加入上步(A)的糠醛胺标题产物(80.48克，0.300mol)和乙酸乙酯(1.0升，试剂级)。在氩气氛下4℃冷却此混合物，同时一次加入三乙胺(50.2ml，0.360mol，Aldrich)。用滴液漏斗加入乙酰氧乙酰氯(37.0ml，0.341mol，Aldrich)和乙酸乙酯(0.50升，试剂级)，在1小时期间滴加此溶液。再经2小时后停止搅拌，反应容器密封(Parafilm“M” )后移至冷室(4℃)中放15小时。搅拌下使此非均相反应混合物温热到22℃(约1小时)，移入4.0升分液漏斗中用NH4Cl水溶液(饱和)(500ml)洗涤。两相均用玻璃微纤维滤纸(Whatman)过滤除去细小的黑色悬浮物。相分离时除去粒状物质。滤饼用乙酸乙酯(50ml)漂洗，将滤液返回到分液漏斗中除去水相(pH6.3)。然后用另一份NH4Cl水溶液(饱和)(250ml，pH5.9)、NaHCO3饱和水溶液(400ml，pH8.6)和NaCl饱和水溶液(400ml，pH7.0)洗涤有机相，有机相用玻璃微纤维滤纸(Whatman)过滤并分为两等份(每份750ml)。这些溶液直接用于下一步骤。
(ⅱ)脱保护 向各含有10%披钯活性炭(2×6.00克，Aldrich)的两个2.0升Parr烧瓶中，在氩气流下加入上步骤的有机相(2×750ml，(ⅰ)中步骤(B)的)。环境温度下用氢(4大气压)处理此混合物。经硅藻土Celite 层过滤除去催化剂，滤饼用乙酸乙酯(100ml)洗涤。将滤液转入4.0升分液漏斗中，用1N HCl(500ml，250ml，pH0.76)洗涤两次。合并水洗液，用乙酸乙酯(500ml)再萃取。合并有机相，用NaHCO3饱和水液(400ml，pH8.34)和Nacl饱和水液(400ml，pH7.5)洗涤。有机相经MgSO4(约100克)干燥后，用经活化的脱色木炭(30克，BDH)处理。15分钟后，该混合物用Celite 层过滤，真空浓缩至160ml，冷却过液(4℃)，用滤纸(Whatman No.1)过滤分出固体。滤饼用乙醚和己烷(各100ml)洗涤，真空干燥后得出35.98克(由上面糠醛胺的产率为61.4%)标题产物(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮，为白色针状物，mp118-119℃。经HPLC定量分析证明在母液中含8.10克标题产物。因此，由上面糠醛胺出发的有效产率为75.3%。
实施例2(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮的立体有择水解本例中使用的基质是以实施例1标题产物制备的外消旋物 本例立体有择水解的产物是化合物Ⅱa和Ⅱb(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮(Ⅱa) 手性乙酸酯(3R)(-)-顺式-3-羟基-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮(Ⅱb)
所说的立体有择水解进行如下制备了一种含10克基质和100克由假单孢菌得到的脂肪酶PS-30(Amano国际公司)的于1升25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的反应混合物。于30℃和150转/分(RPM)搅拌下进行反应。反应期间反应混合物的pH用5N NaOH和pH计(pH Stat)保持在7.0。用高压液相色谱(HPLC)监测水解反应。定期取样(1ml)，用乙酸乙酯(10ml)萃取。分出乙酸乙酯层蒸干，用HPLC分析(说明如下)基质和产物浓度以及产物的旋光纯度，所得的结果示于下表1中。
表1反应时间 转化率 产率 产物的旋光(小时) (%产物IIb) (%产物IIa) 纯度IIa(%)4 18 82 --8 34 66 --12 46 54 --16 51 49 >99.4
工艺手性HPLC试验在上述反应期间，定期取1ml样品，在50ml带螺旋盖试管中用10ml乙酸乙酯萃取。除去乙酸乙酯层(5ml)，在缓缓的氮气流中蒸发。残余物溶解在2ml移动相(己烷∶无水乙醇 95∶5)中，使移动相通过0.2μm Lydex过滤器，并将约1ml滤液移入HPLC分析用波形瓶中。
HPLC条件Hewleft Packard 1090色谱图柱Chiralcal AD移动相己烷∶无水乙醇，95∶5柱温度环境温度流速1ml/分检测器210nm外消旋乙酸酯中两种对映体的滞留时间分别为23.2和28.9分钟。外消旋醇中两种对映体的滞留时间分别为63.9和74.8分。
实施例3用固定的脂肪酶PS-30酶立体有择水解(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮所用的基质和得到的产物是上实施例2中的。
酶的固定此固定操作采用了三种不同载体XAD-7(Amberlite XAD-7非离子聚合吸附剂，20～60目的聚丙烯酸树脂)、XAD-2(Amberlite XAD-非离子聚合吸附剂，20～60目聚苯乙烯树脂)和Accurel PP(聚丙烯树脂200～400微米)。
将粗品Amano PS-30脂肪酶(10克)溶解在25ml蒸馏水中，在10000 RPM下离心10分钟以便获得上清液。在25ml小瓶中用甲醇洗涤载体(1.3克)五次，将其加入烧瓶中的酶溶液内，于室温下在转动摇床小缓缓振荡。用脂肪酶试验法(用Sigma橄榄油乳液作基质)借助于滤液中残余的蛋白质定期检验酶在载体上的吸附。用XAD-7、XAD-2和Accurel树脂分别获得的吸附率为68%、71%和98%左右。完全固定后(20～24小时)，级微孔滤器过滤载体-酶浆液，载体用约300ml蒸馏水洗涤，然后在真空烘箱中于室温下干燥含固定的脂肪酶的载体。
固定酶的用途用固定的酶作实施例2中所述的酶催水解反应。制备一种反应混合物，其中含30ml 25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)和300mg实施例2中所述的基质以及300mg上面制备的固定的脂肪酶PS-30。
按实施例2进行反应，所得到的结果示于下表2中。
表2固定的 反应时间 转化率 产率 产品IIa的旋载体 (小时) (%产品IIb) (%产品IIa) 光纯度(%)XAD-2 3 53 47 99.0XAD-7 3 54 46 99.3Accurel PP 3 51 49 99.5
实施例4(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮的立体有择水解所用的基质和得到的产物为上实施例2中的。本实施例中使用了由不同来源的脂肪酶进行一些反应。
在每种反应中，该反应混合物存在于20ml 25mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)，含1克粗品脂肪酶和200mg基质中。25℃于pH固定为7.0的条件下进行该反应，得到的结果列于下表3中。
表3酶 来源 反应时间(小时)脂肪酶 PS-30 Pseudo- Amano Int. 16monas SP.
脂肪酶 AY-30 Amano Int. 8假丝酵母菌属 SP脂肪酶 AK Pseudo- Amano Int. 16monas SP.
假单孢菌属 Biocatalyst Ltd. 16fluorescensPorcine pancreatic Sigma 19脂肪酶酯酶30,000 Gist-Brocarde 24酯肪酶OF Sepracor 8KID酯肪酶 Gist-Brocarde 48脂肪酶R.根霉菌属SP. Amano Int 24
转化率 产率 产品IIa的旋(%产物IIb) (%产物IIa) 光纯度(%)52 48 >99.555 45 99.053 47 99.355 45 98.852 48 99.851 49 9556 44 99.552 48 9556 44 99.0实施例5(±)-顺式-3-羟基-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮的立体有择酰化(酯化)本实施例所用的基质是用化学水解(用Na2CO3)相应的外消旋酯制得的外消旋物 本例主体有择酰化的产物是化合物Ⅱa和Ⅱb
Ⅱa( )-顺式-3-羟基-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮 Ⅱb(-)-顺式-3-羟基-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮 本例中使用了不同来源的脂肪酶进行一些反应，以便达到立体有择的酰化。每个反应中，存在于25ml甲苯中的该反应混合物均含1克粗脂肪酶和100mg基质，800mg乙酸异丙烯酯和0.05%水。在振荡器上于30℃以100 RPM进行该反应。用HPLC分析产物和基质，得到的结果示于下表4中。
表4转化率 产率 产品IIa的(%产物 (%产物 旋光纯度酶 来源 IIb) IIa) (%)脂肪酶 PS-30 Amano Int. 52 48 99.5脂肪酶 AY-30 Amano Int. 55 45 99.0脂肪酶 R Amano Int. 51 49 96.8假单孢菌属 Biocatalyst Int. 54 46 98.8fluorescens脂肪酶 OF Sepracor 52 48 99.0猪胰腺脂肪酶 Sigma 54 46 98.0实施例6立体有择水解各种酶的评价所用的基质和得到的产物是上实施例2中的。对每个立体有择水解反应，均制备了一种处于20ml 25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的反应混合物，其中含200mg基质和1克酶(酶见表5)。30℃于150 RPM搅拌下进行该反应。反应期间，用1N NaOH和pH计使反应混合物pH保持在7.0。该水解反应用HPLC监测。定期取1ml样品，用4ml乙酸乙酯萃取。分出乙酸乙酯层，蒸干，用HPLC分析基质和产物的浓度以及该产物的旋光纯度，得到的结果示于下表5之中。
表5反应时 产率 产品IIa的间(小 (%产品 旋光纯度酶 来源 时) IIa) (%)脂肪酶 PS-30 Amano Int. 16 48 >99.5脂肪酶 AY-30 Amano Int. 8 46 >99脂肪酶 AK Amano Int. 16 47 >99假单孢菌属 Biocatalysts 16 45 >99fluorescens Ltd.
脂肪酶猪胰腺脂肪酶 Sigma 19 47 98.8酯酶 30,000 Gist/Brocarde 24 35 99脂肪酶 OF Sepracor 8 44 99KID 脂肪酶 Gist/Brocarde 48 38 95脂肪酶 R Amano Int. 24 44 99实施例7用固定的脂肪酶PS-30离析(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮的动力学所用的基质和得到的产物与上实施例2中的相同。
制备了一种于8.5升25mM磷酸钾缓冲液pH7.0中的反应混合物，其中含85克基质和85克源于假单孢菌的脂肪酶PS-30(Amano International Co.)。将脂肪酶PS-30固定在Accural聚丙烯上，用于此反应混合物中。反应在30℃和150RPM搅拌下进行。反应期间，用5N NaOH和pH计维持反应混合物pH值为7.0。水解反应用HPLC监测。定期取出1ml样品用4ml乙酸乙酯萃取。分出乙酸乙酯层蒸干，用HPLC分析基质和产物的浓度以及产物的旋光纯度，所得到的结果列于下表6中。
表6反应时间 A-乙酸酯 B-乙酸酯 A-醇(小时) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)0 6.2 5.2 01 2.1 5.2 2.92 0.65 5.2 4.13 0.19 5.1 4.34 0.1 5 4.95 痕量 4.95 4.96 痕量 4.9 4.9反应时间 B-醇 B-乙酸酯旋 A-醇旋光(小时) (mg/ml) 光纯度(%) 纯度(%)0 0 50 >991 0 72 >992 0 89.6 >993 痕量 98.5 >994 痕量 98.5 >995 0.13 >99 976 0.15 >99 97
“A-乙酸酯”具有下示结构 “B-乙酸酯”具有下示结构 “A-醇”具有下示结构 “B-醇”具有下示结构
(±)-顺式-3-羟基-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮的立体有择酯化本实施例中使用的基质和得到的产物与实施例5中的相同。制备了一种于10ml甲乙酮(MEK)中的反应混合物，其中含20克基质、1克酶(见表7)和0.4ml乙酸异丙烯酯作酰基给予体。该反应在30℃和150 RPM搅拌下进行。该酯化反应用HPLC(说明如下)监测，以便确定基质和产品的浓度以及产品的旋光纯度，得到的结果示于下表7中。
表7反应时间 手性乙酸酯酶 来源 (小时) 产率(%)脂肪酶 PS-30 Amano Int. 96 50.5脂肪酶 AY-30 Amano Int. 120 51脂肪酶 AK Amani Int. 120 49脂肪酶 OF Sepracor 96 49.5
乙酸酯 手性醇 醇的旋光的旋光 的产率 纯度酶 来源 纯度(%) (%) (%)脂肪酶 PS-30 Amano Int. 99.5 49.5 99脂肪酶 AY-30 Amano Int. 99 49 99脂肪酶 AK Amani Int. 99.5 51 99脂肪酶 OF Sepracor 99.4 50.5 99HPLC法上实施例中用HPLC分析了基质和产物。用了一种Nova Pak C18反相柱(3.9×150mm)，移动相是15%乙腈水溶液，流速为1ml/分。检测波长227nm。醇和乙酸酯的反应时间分别为2.7和14.9分钟。
用手性HPLC测定了手性乙酸酯的旋光纯度，使用的是Chiralpak AS柱。移动相由己烷∶乙醇(96∶4)组成，室温下流速为1ml/分。检测波长为210nm。外消旋酯中两种对映体的滞留时间分别为23.7和20.9分钟。外消旋醇中两种对映体的滞留时间分别为63.9和74.8分钟。
权利要求
1.一种离析含对映体Ia和Ib的混合物I的方法，其中在Ia和Ib中的R1均处于R2的顺位上或者Ia和Ib中的R1均处于R2的反位上 式中R1是羟基、卤素或-O-C(O)-R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基团，R2是杂环基或环烷基，以及R3是氢、R4、-C(O)-OR4或-C(O)-R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团；所说的方法包括使所说的混合物I与能使所说化合物Ia和Ib中一种化合物催化立体有择的转化成非对映体形的酶或微生物接触，并且进行所说的转化的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的立体有择转化选自立体有择水解和立体有择酯化。
3.根据权利要求1的方法，其中含对映体Ⅰa(1)和Ⅰb(1)的混合物Ⅰ。 被离析成含化合物Ⅱa(1)和Ⅱb(1)的混合物Ⅱ 所说的方法包括下列步骤(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)中任一步骤(ⅰ)当R1是-O-C(O)-R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R1a和R1b中一个与R1相同，另一个是羟基时，在水和/或有机醇存在下使所说的混合物Ⅰ与能将混合物Ⅰ催化立体有择水解形成所说的混合物Ⅱ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅱ)当R1是羟基，而且R1a和R1b中一个是羟基，另一个R4-C(O)-O-时，其中R4独立选自上面对R4定义的那些基团时;在化合物Ⅲ存在下(式中R4与上面对R1a或R1b定义的相同，而且L是离去基团)，使所说的混合物Ⅰ与能够将混合物Ⅰ催化立体有择酯化形成所说混合物(Ⅱ)的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅲ)当R1是卤原子时，而且R1a或R1b中一个是卤素而另一个是羟基时，使所说的混合物Ⅰ，在氢氧离子给予体存在下，与能使混合物Ⅰ催化立体有择脱卤形成所说混合物Ⅱ的酶或微生物接触的步骤。
4.根据权利要求3的方法，其中所用的混合物Ⅰ含Ⅰa(1)和Ⅰb(1)。 式中R1是链烷酰氧基或羟基;R2是呋喃基或噻吩基;以及R3是氢、苯基或取代的苯基。
5.根据权利要求4中的方法，其中使用脂肪酶。
6.根据权利要求1的方法，其中采用分离步骤进一步分离非对映体化合物。
7.根据权利要求6的方法，其中所说的分离步骤是萃取、蒸馏、结晶或柱色谱步骤。
8.根据权利要求1的方法，其中使用所说方法的产物进一步制备带C-13侧链的紫杉烷类。
9.一种离析含对映体Ⅳa和Ⅳb的混合物Ⅳ的方法，和其中Ta是 而且Tb是 Ta是 和Tb是 其中R1在Ⅳa和Ⅳb中均相对于基团W处于赤位上或在Ⅳa和Ⅳb中均相对于基团W处于苏位上;W是-NHR3或-N3R1是羟基，卤素，或-O-C(O)R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基;R2是杂环基或环烷基;R3是氢，R4，-C(O)OR4，或-C(O)R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;R6是氢，或R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;所说的方法包括使所说的混合物Ⅳ与能够使所说的化合物Ⅳa或Ⅳb中之一催化立体有择转化成非对映体形的酶或微生物接触并且进行所说转化的步骤。
10.根据权利要求9的方法，其中离析含对映体Ⅳa(1)和Ⅳb(1)的混合物Ⅳ 形成含化合物Ⅴa(1)和Ⅴb(1)的混合物Ⅴ 该方法包括下列步骤(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)中之一(ⅰ)当R1是-O-C(O)-R4，R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R1a和R1b之一与R1相同，另一个是羟基时，在水和/或有机醇存在下，使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择水解混合物Ⅳ成为所说的混合物Ⅴ的酶或微生物接触的步骤;或(ⅱ)当R1是羟基，而且R1a和R1b中之一是羟基，而另一个是R4-C(O)-O-，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团时;在化合物Ⅲ存在下(式中R4如上面对R1a或R1b中的定义，而且L是离去基团)，使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择酯化混合物Ⅳ成为所说混合物Ⅴ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅲ)当R1是卤素原子时，而且R1a或R1b中一个是卤素，另一个是羟基时，在氢氧离子给予体存在下，使所说的混合物Ⅳ能够催化立体有择的混合物Ⅳ脱卤形成所说的混合物Ⅴ的酶或微生物接触的步骤。
11.根据权利要求9的方法，其中离析含对映体Ⅳa(1)和Ⅳb(1)的混合物Ⅳ 形成含化合物Ⅳa(1)和Ⅳb(1)的混合物Ⅴ 所说方法包括下列步骤(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)中之一(ⅰ)当R6是氢，而且R6a或R6b之一是氢，另一个是R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团时，在式Ⅶ有机醇存在下(其中R4如上面对R6a或R6b的定义)使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择酯化混合物Ⅳ形成所说混合物Ⅳ的酶或微生物接触的步骤;或(ⅱ)当R6是R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R6a和R6b之一与R6相同，另一个是氢时，在水存在下，使所说的混合物Ⅳ与能将混合物Ⅳ催化立体有择水解形成所说混合物Ⅵ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅲ)当R6是R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R6a和R6b中之一与R6相同，另一个是R7，而R7是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基，但条件是R7不同于R6时，在式Ⅷ有机醇存在下，(式中R7如上述定义同)使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择酯转移混合物Ⅳ形成所说混合物Ⅵ的酶或微生物接触的步骤。
12.根据权利要求9的方法，其中进一步用分离步骤分离得到的非对映体化合物。
13.根据权利要求12的方法，其中所说的分离步骤是萃取、蒸馏、结晶或柱色谱步骤。
14.根据权利要求9的方法，其中用所说方法的产物进一步制备带C-13侧链的紫杉烷。
全文摘要
酶催离析对映体(如β-内酰胺化合物)混合物用方法，所说的化合物可以作为中间体制备带C-13侧链，该侧链上有杂环或环烷基的紫杉烷类，而这种紫杉烷可以用于药物领域。
文档编号C07D205/08GK1100144SQ9410859
公开日1995年3月15日 申请日期1994年7月14日 优先权日1993年7月14日
发明者R·N·帕特尔 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司
技术领域：
本发明涉及可以用作制备紫杉烷，尤其是制备带有含杂环或环烷基的C-13侧链的紫杉烷的中间体化合物的对映体混合物离析用酶催方法。
紫杉烷类(Taxanes)是一些在药物领域找到实用性的二萜烯化合物。例如，在C-13侧链上含杂环或环烷基团的紫杉醇(Taxol)类似物可以用作抗癌剂。这样的紫杉醇类似物可以通过半合成路线，尤其可以通过把β-内酰胺或开链中间体耦合到紫杉烷核上形成C-13侧链的方法制备。由于这些类似物的主体化学可以影响其药物活性，所以在已有技术中设法采用有效的立体有择的制备所说的中间体β-内酰胺和开链化合物以及最终产物紫杉烷的方法。
本发明提供可以用作制备一种带有含杂环或环烷基的C-13侧链的紫杉烷的中间体化合物的对映体混合物，尤其是外消旋混合物的有效离析法，以及立体有择的制备这些化合物的有效方法。
具体讲，本发明提供一种离析含对映体Ⅰa和Ⅰb的混合物Ⅰ的方法，其中在Ⅰa和Ⅰb中的R1均处于R2的顺位上或者Ⅰa和Ⅰb中的R1均处于R2的反位上
式中R1是羟基，卤素或-O-C(O)-R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基;
R2是杂环基或环烷基;以及R3是氢，R4，-C(O)-OR4或-C(O)R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;
所说的方法包括使所说的混合物Ⅰ与能够使所说的化合物Ⅰa或Ⅰb中一种化合物催化立体有择的转化成为非对映体形的酶或微生物接触，并且进行所说的转化的步骤。
本发明还提供一种离析含对映体Ⅳa和Ⅳb的混合物Ⅳ的工艺方法
和其中Ta是
而且Tb是 Ta是 和Tb是 其中R1在Ⅳa和Ⅳb中均相对于基团W处于赤位或者在Ⅳa和Ⅳb中均相对于基团W处于苏位;
W是-NHR3或-N3R1是羟基，卤素，或-O-C(O)R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基;
R2是杂环基或环烷基;
R3是氢，R4，-C(O)OR4，或-C(O)R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;
R6是氢，或R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;
所说的方法包括使所说的混合物Ⅳ，与能够使所说的化合物之一Ⅳa或Ⅳb催化立体有择的转化成为非对映体形的酶或微生物接触并且进行所说转化的步骤。
上面提到的立体有择转化的例示方案，包括立体有择水解、立体有择酯化、立体有择酯转移和立体有择脱卤，尤其是立体有择的水解或酯化。
式Ⅰ或Ⅳ化合物上的羟基之类的基团可以选择性地加以保护，以便用于本发明的离析方法中，然后可以任意选择性地使这样的基团脱保护。
本发明的方法进一步说明如下。
顺式对映体下列顺式对映体可以用本发明的酶催法分离 即其中R1均处于Ⅰa和Ⅰb中R2之顺位上的对映体Ⅰa和Ⅰb。
优选按本发明上述方式离析顺式对映体的混合物。
反式对映体下列的反式对映体对可以用本发明的酶催法分离
即对映体Ⅰa和Ⅰb，其中R1在Ⅰa和Ⅰb中均处于R2的反位。
赤式对映体下列赤式对映体对可以用本发明的酶促法分离 即对映体Ⅳa和Ⅳb，其中R1在Ⅳa和Ⅳb中均处于基团W的赤位上。
苏式对映体下列苏式对映体对可以用本发明的酶催法分离 即对映体Ⅳa和Ⅳb，其中R1在Ⅳa和Ⅳb中均处于基团W的苏位上。
离析混合物Ⅰ的优选方案优选用立体有择地水解、酯化或脱卤离析含β-内酰胺Ⅰa和Ⅰb对映体混合物的混合物Ⅰ。一种具体优选的用于离析含对映体Ⅰa(1)和Ⅰb(1)的混合物Ⅰ
形成含化合物Ⅱa(1)和Ⅱb(1)的混合物Ⅱ的方法 其中R2是杂环基或环烷基;而且R3是氢，R4，-O-C(O)-OR4或-C(O)-R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基;
所说的方法包括下列步骤(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)中任一步骤(ⅰ)当R1是-O-C(O)-R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R1a和R1b中一个与R1相同，另一个是羟基时，在水和/或有机醇存在下使所说的混合物Ⅰ与能将混合物Ⅰ催化立体有择水解形成所说的混合物Ⅱ的酶或微生物接触的步骤;或者
(ⅱ)当R1是羟基，而且R1a和R1b中一个是羟基而另一个R4-C(O)-O-时，其中R4独立选自上面对R4定义的那些基团时;在化合物Ⅲ存在下R4-C(O)-L (Ⅲ)(式中R4与上面对R1a或R1b定义的相同，而且L是离去基团)，使所说的混合物Ⅰ与能够将混合物Ⅰ催化立体有择酯化形成所说混合物(Ⅱ)的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅲ)当R1是卤原子时，而且R1a或R1b中一个是卤素而另一个是羟基时，使所说的混合物Ⅰ，在氢氧离子给予体存在下，与能使混合物Ⅰ催化立体有择脱卤形成所说混合物Ⅱ的酶或微生物接触的步骤。
上述方法可以用来离析本发明的其它对映体混合物，但是优选离析上面的顺式对映体Ⅰa(1)和Ⅰb(1)。
离析混合物Ⅳ的优选方法混合物Ⅳ优选用立体有择的水解、酯化、脱卤或酯交换作用离析。离析包含对映体Ⅳa(1)和Ⅳb(1)的混合物Ⅳ
形成含化合物Ⅴa(1)和Ⅴb(1)的混合物Ⅴ的具体优选方法 式中R2是杂环或环烷基，R3是氢，R4，-C(O)-OR4或-C(O)-R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基杂环基，而且R6是氢或R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;所说方法包括下列步骤(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)中之一(ⅰ)当R1是-O-C(O)-R4，R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R1a和R1b之一个与R1相同，另一个是羟基时，在水和/或有机醇存在下，使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择水解混合物Ⅳ成为所说的混合物Ⅴ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅱ)当R1是羟基，而且R1a和R1b中之一是羟基，另一个是R4-C(O)-O-，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团时;在化合物Ⅲ存在下
(式中R4如上面对R1a或R1b中的定义，而且L是离去基团)，使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择酯化混合物Ⅳ成为所说混合物Ⅴ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅲ)当R1是卤原子时，而且R1a或R1b中一个是卤素，另一个是羟基时，在氢氧离子给予体存在下，使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择的混合物Ⅳ脱卤形成所说混合物Ⅴ的酶或微生物接触的步骤。
离析包含对映体Ⅳa(1)和Ⅳb(1)的混合物Ⅳ 形成含化合物Ⅵa(1)和Ⅵb(1)的混合物Ⅵ的进一步具体优选的方法
式中R1是羟基，卤素、或-O-C(O)-R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基;
R2是杂环基或环烷基;而且R3是氢，R4，-C(O)-OR4，或-C(O)-R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;
所说方法包括下列步骤(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)中之一(ⅰ)当R6是氢，而且R6a或R6b之一是氢，另一个是R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团时，在式Ⅶ有机醇存在下
(其中R4如上面对R6a或R6b的定义)使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择酯化混合物Ⅳ形成为所说混合物Ⅳ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅱ)当R6是R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R6a和R6b之一与R6相同，另一个是氢时，在水存在下，使所说的混合物Ⅳ与能将混合物Ⅳ催化立体有择水解形成所说混合物Ⅵ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅲ)当R6是R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R6a和R6b中之一与R6相同，另一个是R7，而R7是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基，条件是R7不同于R6时，在式Ⅷ有机醇存在下，
(式中R7如上述定义同)使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择酯转移混合物Ⅳ成所说混合物Ⅵ的酶或微生物接触的步骤;
上述方法可以用在离析本发明的其它对映体混合物上，但是优选离析上述对映体Ⅳa(1)和Ⅳb(1)。
这样制出的化合物对，如Ⅱa(1)和Ⅱb(1)，是非对映体式的，然后可以被分离成旋光性化合物，优选分离成旋光纯化合物。制出一种旋光纯度达99%以上，特别优选是99.5%的化合物。
本发明还提供一种基本上无其它异构体的混合物Ⅰ或Ⅳ中的化合物，此化合物可以用本发明方法制成。
定义使用的术语“立体有择的转化”，指一种对映体相对于另一对映体优先反应，即不对称的对映体选择性反应。术语“立体有择地水解”、“立体有择地酯化”、“立体有择的脱卤”和“立体有择的酯转移”，同样分别指一种对映体相对于另一种对映体优先水解、酯化、脱卤和酯转移。
就对映体化合中所用的术语“混合物”是指含等量(外消旋)或不等量对映体的混合物。
所用的术语“离析”指部分，以及优选完全离析。
所用术语“非对映体形”指源于对映体对的一种化合物结构，其中至少一个基团被改造，使所说的化合物不再是原来对映体对中另一化合物的镜像。
所用术语“酶催工艺方法”或“酶催方法”，指使用酶或微生物的本发明的工艺方法或方法。
单独地或者作为部分另外基团而使用的术语“烷基”是指直链或支链的、在直链中含1～15碳原子，优选含1～6个碳原子的、任意取代的烃基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、异己基、庚基、4，4-二甲戊基、辛基、2，2，4-三甲戊基、壬基、癸基、十一碳烷基、十二碳烷基、以及其各种支链异构体等等。取代基包括选自下列的一个或多个基团卤素(尤其是氯)、三卤甲基、烷氧基(如两个烷氧基取代基形成乙缩醛时)、芳基(如未取代的芳基、烷芳基卤代芳基)、环烷基(如未取代的环烷基或烷基环烷基)、羟基或被护羟基、羧基、烷氧羰基、烷氨基、烷羰氨基、氨基、芳羰氨基、硝基、氰基、硫羟基或烷硫基。
单独或作为部分其它基团使用的术语“链烯基”，是指上面对烷基所述的，至少还含一个碳-碳双键的、任意取代的基团。取代基实例包括一个或多个如上所述的烷基和/或一个或多个上面作为烷基取代基所述的基团。
单独或作为部分其它基团使用的术语“炔基”，是指上面对于烷基所述的、至少还含一个碳-碳叁键的任意取代的基团，具体取代基包括上述一个或多个烷基，和/或上面作为烷基取代基所述的一个或多个基团。
单独或作为部分其它基团所用的术语“环烷基”，是指包含1～3个环以及3～12个环碳原子，优选含3～8个环碳原子的、任意取代的饱和环状烃基团，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、环十二碳烷基和金刚烷基(adamantyl)。具体取代基包括一个或多个上述烷基，和/或一个或多个上面作为烷基取代基所述的基团。
单独或作为部分其它基团使用的术语“环烯基”，指上面针对环烷基所述的任意取代的基团，在其环系中还包含至少一个碳-碳双键。具体取代基包括一个或多个上述的烷基，和/或一个或多个上面作为烷基取代基所述的基团。
单独或作为部分其它基团所用的术语“芳基”，是指在环部分中包含6～12个碳原子的任意取代的碳环芳基，优选单环或双环基团，如苯基、联苯基、萘基，取代的苯基、取代的联苯基或取代的萘基。具体取代基(优选三或更少)包括一个或多个下列基团烷基(如未取代的烷基、卤代烷基、或环烷基烷基)、卤素、烷氧基(如未取代的烷氧基或卤代烷氧基)、羟基、芳氧基(如苯氧基)、R4-羰氧基(R4定义如上)，烯丙基、环烷基、烷氨基、二烷氨基、酰氨基(如烷羰氨基或芳羰氨基)、氨基、硝基、氰基、链烯基、硫羟基、R4-羰基(R4定义如上)或亚甲基二氧基(其中亚甲基可以被一个或二个低级烷基、一个或二个芳基链烯基和/或一个或二个烷硫基取代)。具体优选的芳基是苯基、取代的苯基，尤其是被一个或多个羟基、烷基和/或烷氧基取代的苯基。
单独或者作为部分其它基团所用的术语“卤素”或“卤”，指氯、溴、氟和碘。
单独或者作为部分其它基团所用的术语“杂环”或“杂环的”是指任意取代的、完全饱和或不饱和的、单环或双环的、芳族或非芳族的、至少在一个环上有至少一个杂原子而且每个环优选有5或6个原子的烃基。所说的杂环基团，优选环中有1个或2个氧原子、1个或2个硫原子，和/或1-4个氮原子而且可以通过碳或杂原子可以被连到该分子其它部分上。具体取代基包括一个或多个下列基团卤素、烷氧基、羟基、芳基(如苯基或卤代苯基)、链烷酰氧基、芳羰氧基(如苄酰氧基)、烷基(如芳烷基)、烷氨基、链烷酰氨基、芳羰氨基、氨基、硝基、氰基和硫羟基。具体杂环基团包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡啶基、咪唑基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂 基、吲哚基、异吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并噁二唑基和苯并呋咱基。
使用的术语“羟基保护基”，指能保护游离羟基(“被护羟基”)的基团，而且采用该保护反应后可以将其除去而不影响该分子的其余部分。羟基的各种保护基及其合成，可以在T.W.Greene，John Wiley和Sons或Fiser和Fiser著<有机合成中的保护基>(1981年)中查到。具体的羟基保护基包括甲氧甲基、1-乙氧乙基、苄氧甲基、(β-三甲基甲硅烷基乙氧)甲基、四氢吡喃基、2，2，2-三氯乙氧羰基，叔丁(二苯基)甲硅烷基、三烷基甲硅烷基、三氯甲氧羰基和2，2，2-三氯乙氧甲基。
原料本离析法用的原料，可以按本文实施例中所述，或者按1992年1月15日提交的07/822015号美国专利申请中所述相似的方法得到。
原料Ⅰ或Ⅳ中可以含例如化合物Ⅰa和Ⅰb或者Ⅳa和Ⅳb化合物的非对映异构体，但是最好在实施本发明的酶催离析法之前分离这样的化合物。
优选的化合物式Ⅰ的顺式化合物，具有优选用作制备带C-13侧链紫杉烷的中间体化合物中存在的那种立体异构体构型。具有与相当于化合物Ⅰa的(其中R1是乙酰氧基，R2是呋喃基，而且R3是3R，4S构型中的氢)绝对立体构型相同的混合物Ⅰ和Ⅱ的化合物，是特别优选的。
式Ⅳ的赤型化合物，具有优选用作制备带C-13侧链的紫杉烷中间体化合物中的那种立体异构构型。优选这样一些混合物Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的化合物，它们具有与相当于(其中R1是羟基，R2是呋喃基，W是-NHR3而且R3是氢，以及R6是2R，3S构型中氢的)化合物Ⅳa(1)的同样的绝对立体构型。
在混合物Ⅳ中，优选Ta＝ 而且Tb＝ 优选离析式Ⅰ的β-内酰胺。
在本发明的化合物中，R1优选链烷酰氧基如未取代的链烷酰氧基(如乙酰氧基)或羟基，R2优选呋喃基或噻吩基，而且R3优选氢、苯基、取代的苯基、苯羰基、取代的苯羰基、烷羰基、链烯羰基、或烷氧羰基(如叔丁氧羰基)。R6优选氢或甲基等C1-C6烷基。
酶和微生物本发明方法中所用的酶或衍生物，可以是具有本文所述催化立体有择转化能力的任何酶或微生物。各种酶，如酯酶、脂肪酶和蛋白酶等，无论其来源和纯度如何均适于本发明中使用。所说的酶可以是例如动物、植物或其混合物形，微生物的细胞、碎细胞、细胞提取液或合成物的形态。
就所用的微生物而言，本发明的方法可以用具有本文所述催化立体有择转化能力的任何微生物细胞材料实施。该细胞可以用原始的湿细胞或者干燥(如冷冻干燥、喷雾干燥或加热干燥)的细胞，也可以用处理过的细胞材料，如碎细胞或细胞提取液。
所说的酶或微生物材料，可以在游离态下或在载体上(如聚合的树脂上)经物理吸附或截面等方式固定化形态下使用。
适于用作催化酶来源的微生物的具体属，包括毛霉属、埃希氏杆菌属(Escherichia)葡萄球菌属、土壤杆菌属、不动细菌属、根霉菌属、曲霉属、诺卡氏菌属、链霉菌属、木霉属、假丝酵母菌属、红酵母属、球拟酵母属、麦形杆菌属、杆菌属、产硷杆菌属、假单孢菌属、红球菌属、短杆菌属、地霉属、肠杆菌属、色杆菌属、分节孢子杆菌属(Arthrobacter)、微杆菌属、分支杆菌属、酵母菌属、青霉属、甲烷杆菌属、葡萄孢属、毛壳菌属、蛇孢壳菌属、分支孢子菌属等等。也可以设想使用遗传工程得到的宿主细胞。
适于本发明工艺方法使用的具体微生物包括Chromobacterium Viscosum、绿脓杆菌(Pseudomonas aeuriginosa，如ATCC 25619)、萤光假单孢菌、恶臭假单孢菌(如ATCC 31303)、卵状假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪产碱杆菌、灰色链霉菌、洋葱假单胞菌、Candida rogosa(如ATCC 14830)、白地霉(如ATCC 32345)、Streptomyces clavuligerus、Nocadia erthropolis、星状诺卡氏菌、草分支杆菌、放射形土壤杆菌、黑曲霉、米根霉等等，实施本发明方法时，除单一菌株外，可以使用二或多种微生物菌株。
本文使用的术语“ATCC”指美国典型培养物保藏中心的保藏号，该中心地址12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，该中心保藏所说的微生物。
本发明的离析方法可以在所用的衍生物生长后或者与之同时进行，在后一情况下指现场发酵和离析。微生物的生长可以采用本领域普通技术人员熟知的，例如采用含碳源、氮源和痕量元素等营养物的适当培养介质达到。
适于本发明使用的市售酶实例包括脂肪酶，如Amano PS-30洋葱假单胞菌、Amano GC-20白地霉、Amano APF(黑曲霉)、Amano AK(假单孢菌株)、萤光假单孢菌脂肪酶(Biocatalyst Ltd.)、Amano脂肪酶P-30(Candida cylindracea)、Amano N雪白根霉、Amano R(青霉菌株)、Amano FAP米根霉、Amano AP-12(黑曲霉)、Amano MAP(Mucor meihei)、Amano GC-4(白地霉)、Sigma L-0382和L-3126(猪胰腺酶)、(Sapracor)的脂肪酶。酯酶30000(Gist-Brocarde)，KID脂肪酶(Gist-Brocarde)，脂肪酶R(根霉菌株，Amano)，Sigma L-3001(麦病菌)，Sigma L-1754(Candida cylindracea)，Sigma L-0763(Chromobacterium viscosum)和Amano K-30(黑曲霉)。由动物组织得到的酶实例包括由猪肝得到的酯酶、α-胰凝乳蛋白酶以及由猪胰脂肪酶之类胰腺得到的胰酶(Sigma)。进行此发现方法时，除单种酶之外，可以用两种或多种酶。
在下列反应路线中进一步说明本发明的优选方案。虽然为说明目的这些反应路线说明某些顺式对映体混合物的离析，但是应当理解到所述的具体方案也适于离析本发明的其它对映体混合物。
反应路线Ⅰ酯化法离析对映体混合物 产物 R6a或R6b之一＝OH;另一个＝R4
反应路线Ⅱ酯转移法离析对映体混合物 产物 R6a或R6b之一＝R6;另一个＝R7混合物Ⅰ和Ⅳ可以按上反应路线Ⅰ所示的立体有择酯化，而且混合物Ⅳ可以按上反应路线Ⅱ所说明的立体有择地酯转移。
(A)酰化利用酰化剂(Ⅲ)
式中R4可以是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基，可以将混合物Ⅰ选择性酯化成混合物Ⅱ，将混合物Ⅳ选择性酯化成混合物Ⅴ。式Ⅲ中的R4基团，优选烷基团，如C1-C6烷基团，尤其是甲基。L是可以被置换形成酯基的离去基团。L基团实例，包括卤素原子，羟基、烷氧基或链烯氧基。L基团优选链烯氧基，最优选C1-6链烯氧基，如CH2＝CH-O-和CH2＝C(CH3)-O-。具有酯化作用的任何式Ⅲ酰化剂均可以使用，最优选乙酸异丙烯酯和乙酸乙烯酯。
(B)用醇酯化用式Ⅶ的有机醇
式中R4可以是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基，优选烷基，具体优选C1-6烷基;可以选择性酯化混合物Ⅳ为混合物Ⅵ。
(C)用醇酯转移用式Ⅷ的醇
式中R7可以是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基，但是R7不同于R6，可以将混合物Ⅳ选择性酯转移形成混合物Ⅵ。最好使R7与R6尽可能不同，以便于以后从带R6-O-C(O)-基团的化合物中分出带R7-O-C(O)-基团的化合物。因此，优选使用这样一些式Ⅷ的醇，其中的R7在分子量方面不同于R6基团，或者赋予被酯转移的酯以不同的物理或化学性质。
酯化(酰化)操作(A)以及酯化和酯转移操作(B)和(C)，优选在有机溶剂中进行。适于本发明使用的具体溶剂，包括1，1，2-三氯-1，2，2-三氟乙烷、甲苯、环己烷、苯、己烷、庚烷、异辛烷、辛烷、甲乙酮、甲基异丁基酮等等。最好在反应混合物中加入少量水。存在水时，水在反应混合物中的浓度，按溶剂重量计优选约为0.01～1%，或者使其浓度小或等于该有机溶剂饱和时的浓度。按溶剂重量计，最优选的水存在量约为0.05～0.5%，所说的反应溶液优选在每ml溶剂中约含5～250mg对映体原料化合物。
为进行这些过程，向反应介质中加入化合物Ⅲ、Ⅶ或Ⅷ。化合物Ⅲ与混合物Ⅰ或Ⅳ中化合物间摩尔比，优选约1∶1～4∶1;化合物Ⅶ与混合物Ⅳ中化合物间摩尔比，优选约1∶1～4∶1;化合物Ⅷ与混合物Ⅳ中化合物间摩尔比优选约1∶1～4∶1。
在这些操作方法中使用的酶或微生物，优选脂肪酶、酯酶或能产生这些酶的微生物。在这些方法中具体优选的酶或微生物是由假单孢菌株产生的脂肪酶PS-30，由假单孢菌得到的脂肪酶P-30，由青霉菌株产生的脂肪酶R，以及由Rhizopus niveus产生的脂肪酶N、由黑曲霉产生的脂肪酶APF、由Geotrichum candidum产生的脂肪酶GC-20、由假单孢菌株产生的脂肪酶AK、由念珠菌株产生的脂肪酶AY-30以及萤光假单孢菌脂肪酯等脂肪酶。
酶可以在例如游离态或固定态下使用。本发明的一种优选方案是将酶吸附在适当载体上，例如硅藻土(多孔硅藻土Hyflo Supercel)、微孔聚丙烯(Enka Accurel 聚丙烯粉)或非离子型聚合吸附剂，如由Rohm和Haas公司产的Amberlite XAD-2(聚苯乙烯)或XAD-7(聚丙烯酸酯)上。用载体固定酶时，载体可以控制在有机溶剂中使用时酶的粒度和阻止酶粒聚集。例如，可以在硅藻土Hyflo Supercel存在下用冷丙酮沉淀酶的水溶液，然后真空干燥之;或者在用非离子型吸附剂的情况下，在摇动器上用吸附剂培养酶溶液，除去过量的溶液，并在真空下干燥酶-吸附剂树脂，用这样的方法可以完成固定操作。优选将酶加到反应溶液中，使浓度达到每ml溶剂含约5～200mg酶。虽然希望使用尽可能最少量的酶，但是所需的酶量将依所用酶的比活性而变化。
这些方法也可以用含有能够催化立体有择转化作用的酶的微生物细胞来进行。用微生物进行离析时，习惯上利用向所需的反应介质中加入所说细胞和对映体混合物原料的方法进行这些操作。细胞可以用原样细胞或干燥(如冷冻干燥、喷雾干燥或加热干燥)的细胞，或者固定的细胞，或者用丙酮、甲苯之类有机溶剂处理过的细胞。细胞也可以用处理过的细胞材料，如碎细胞或细胞提取液。也可以使用前述的固定在硅藻土(Celite )或聚丙烯(Accurel )上的细胞提取液。
优选在4～60℃左右，最优选在约30～50℃温度下培养反应介质。反应时间可以根据所用的酶量及其比活性而适当变化。增加反应温度和/或提高加至反应溶液中的酶量，可以缩短反应时间。
反应路线Ⅲ水解离析对映体混合物 产物
正如从上反应路线Ⅲ所能看出的那样，利用水和/或有机醇可以使混合物Ⅰ和Ⅳ分别立体有择地水解形成混合物Ⅱ和Ⅴ，而且混合物Ⅳ可以用水立体有择地水解形成混合物Ⅵ。初始对映体化合物中的R4(形成部分R1)和R6。优选烷基，最优选C1-6烷基，如甲基。
作为有机醇，可以用式Ⅸ的化合物
式中R8是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基团，优选甲基等烷基。使用有机醇Ⅸ，可能导致形成副产物酯R4-C(O)-OR8。用水作水解剂可能导致形成副产物酸R4-C(O)-OH。当这些酸性副产物生成时为了维持稳定的pH，可以加入碱金属氢氧化物类的碱。用有机醇Ⅸ时，其加入量最好使化合物Ⅸ与混合物Ⅰ或Ⅳ中化合物间摩尔比达到约1∶1～4∶1。
这些方法优选用能催化立体有择水解作用的水溶性酶。脂肪酶和酯酶以及胰酶和α-胰凝乳蛋白酶特别适于这些方法中使用。这些酶的粗品或纯品，无论呈游离态还是在载体上(如在XAD-7、XAD-2树脂或Accurel 树脂上)的固定态下均可以使用。在这些方法中特别优选由洋葱假单孢菌株得到的脂肪酶PS-30(Amano Int′l)、由假单孢菌株得到的脂肪酶P-30(Amano)、脂肪酶GC-20白地霉(Amano Int′l)、脂肪酶N(Rhizopus niveus)(Amano Int′l)、脂肪酶APF(黑曲霉)(Amano Int′l)、脂肪酶AY-30(念珠菌株)(Amano)、脂肪酶AK(假单孢菌)(Amano Int′l)、萤光假单孢菌脂肪酶(Biocatalyst Ltd)、酯酶30000(Gist-Brocarde)、脂肪酶OF(Sepracor)、KID脂肪酶(Gist-Brocarde)、脂肪酶R(根霉菌，Amano Int.)和猪胰腺脂肪酶(Sigma Chem)。
上述水解优选在水介质，例如缓冲的水(如磷酸盐缓冲液)介质中，或者在含可溶混或不可溶混的有机溶剂的水介质中进行。例如，此反应在包括与水不可溶混的有机相和水相的二相溶剂体系中进行。采用两相溶剂体系可以提高这样的方法在基体材料不溶于水中情况下的效率。
两相溶剂体系中有机相用溶剂，可以是与水不可溶混的任何有机溶剂，如甲苯、环己烷、二甲苯、三氯三氟乙烷等等。水相用水方便(优选去离子水)或者适当的水缓冲液，尤其是磷酸盐缓冲溶液，所说的两相溶剂体系优选含约10～90容积%有机相和约90～10容积%水相。
优选对映体混合物量为每毫升反应溶液中约含0.1～100mg，而且在每mg待水解的原料中约含0.1～100mg一种或多种酶。
该反应混合物优选调节到并保持在约pH7，最好用碱金属的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐的水溶液调节pH。
反应时间可以根据酶、温度和酶浓度选取。优选的反应温度约4～60℃。
反应路线Ⅳ脱卤法离析对映体混合物 产物 R1a或R1b之一＝X;另一个＝OH R1a或R1b之一＝X;另一个＝OH正如可以从上反应路线Ⅳ所看出的那些，混合物Ⅰ和Ⅳ可以分别选择性地脱卤形成混合物Ⅱ和Ⅴ，其中X指卤素原子。
能进行这些反应的任何化合物，均可以用作氢氧离子给予体。这种化合物的实例，可以选自水、碱金属或硷土金属的氢氧化物(如氢氧化钠或氢氧化钾)以及氢氧化铵，如季铵的氢氧化物(如式(R9)4NOH的化合物，其中R9是氢或烷基)，特别是氢氧化钾和水。所加入的氢氧离子给予体量，最好使氢氧离子给予体与混合物Ⅰ或Ⅳ对映体原料之间的摩尔比处于约1∶1～4∶1。
优选使用含水和有机溶剂(如甲苯或己烷)的反应介质。对映体原料的优选用量为每毫升溶剂约1～100mg。
脱卤反应中使用的酶或微生物，最好选自假单孢菌属、木霉属、分支杆菌属、不动细菌属、产硷杆菌属、诺卡氏菌属、红球菌属、甲烷细菌属、变形杆菌属或由它们产生的酶;其用量优选为每毫克待脱卤的原料约用0.1～10mg酶。
最好采用约4～50℃间的温度。
分离立体有择转化的产物，可以用萃取、蒸馏、结晶、柱色谱等操作法加以离析和纯化。
用本发明方法形成的产品混合物分离的优选方法是液-液萃取法。
实用性紫杉烷类，是含紫杉烷碳骨架的二萜烯化合物 此骨架在其环系中可以含烯不饱和键。具有特别意义的紫杉烷类，是具有上述碳骨架的这样一些化合物，其中第11和12位通过烯键结合，而且在第13位上的侧链。具有药理活性的紫杉烷类，如紫杉醇类似物可以作为抗癌剂治疗患癌症(如卵巢癌、黑素癌、乳房癌、结肠癌或肺癌)以及白血病的病人。
按本发明方法得到的经离析的化合物，特别适于作为在所说的紫杉烷骨架上形成上面提到的C-13侧链的中间体使用。引入这样的侧链以及其自身，可以赋予紫杉烷产物以改善的或更好的药理活性，或者可以形成更易于转化成具有比原始化合物改善的或更好的药理活性的紫杉烷的紫杉烷产物。
根据本发明的方法离析的化合物在用于形成侧链之前可以加以改变。例如，经离析的含叠氮基N3作为基团W的化合物可以用还原剂处理形成可以被取代的氨基。
侧链形成用的具体方法以及可以用这样的方法形成紫杉烷产物的方法，包括534708号欧洲专利申请以及第08/080704(1993.6.28申请)、08/029819(1993.3.11申请)、07/996455(1992.12.24申请)、08/062687(1993.5.20申请)07/981151(1992.11.24申请)和07/995443(1992.12.23申请)号的美国专利申请中所述的方法。上述文件均通过参照并入本文之中。
反应物或产物的盐或溶剂化物，可以适当或在本发明方法中需要时加以使用或制备。
本发明的方法通过下列实施例作进一步说明;这些实施例仅仅用于说明而不是以任何方式限制权利要求的范围。
实施例1离析(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮用基质的合成(A)N，N′-[(2′-呋喃基)甲基]-2-呋喃甲亚胺制备 向3升备有温度计和机械搅拌器的二颈圆底烧瓶中加入2-糠醛(糠醛，311ml，3.75mol，Aldrich)和2-丙醇(IPA，0.75升，试剂级)。搅拌下一次加入1.5升浓NH4OH(水溶液，～30%)(22.2mol)，在前二小时观察到放热(～35℃)。过滤(Whatman Nol)分离形成的米色粉末，水(1.5升)洗后30℃下真空干燥过夜，得出255.3克(产率76.1%)米色粉状标题的糠醛胺，熔点(mp)116-117℃，其Rf值为0.5(乙酸乙酯(EtOAc)/己烷1∶1，UV显示)。
(B)(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮制备(ⅰ)Staudinger反应
其中“AC”指乙酰基(CH3-C(O)-)“(±)”是指就氮杂环丁烷环上第3和4位上顺式对映体的外消旋物。
向备有温度计、压力平衡滴液漏斗和机械搅拌器的2升三颈圆底烧瓶中加入上步(A)的糠醛胺标题产物(80.48克，0.300mol)和乙酸乙酯(1.0升，试剂级)。在氩气氛下4℃冷却此混合物，同时一次加入三乙胺(50.2ml，0.360mol，Aldrich)。用滴液漏斗加入乙酰氧乙酰氯(37.0ml，0.341mol，Aldrich)和乙酸乙酯(0.50升，试剂级)，在1小时期间滴加此溶液。再经2小时后停止搅拌，反应容器密封(Parafilm“M” )后移至冷室(4℃)中放15小时。搅拌下使此非均相反应混合物温热到22℃(约1小时)，移入4.0升分液漏斗中用NH4Cl水溶液(饱和)(500ml)洗涤。两相均用玻璃微纤维滤纸(Whatman)过滤除去细小的黑色悬浮物。相分离时除去粒状物质。滤饼用乙酸乙酯(50ml)漂洗，将滤液返回到分液漏斗中除去水相(pH6.3)。然后用另一份NH4Cl水溶液(饱和)(250ml，pH5.9)、NaHCO3饱和水溶液(400ml，pH8.6)和NaCl饱和水溶液(400ml，pH7.0)洗涤有机相，有机相用玻璃微纤维滤纸(Whatman)过滤并分为两等份(每份750ml)。这些溶液直接用于下一步骤。
(ⅱ)脱保护 向各含有10%披钯活性炭(2×6.00克，Aldrich)的两个2.0升Parr烧瓶中，在氩气流下加入上步骤的有机相(2×750ml，(ⅰ)中步骤(B)的)。环境温度下用氢(4大气压)处理此混合物。经硅藻土Celite 层过滤除去催化剂，滤饼用乙酸乙酯(100ml)洗涤。将滤液转入4.0升分液漏斗中，用1N HCl(500ml，250ml，pH0.76)洗涤两次。合并水洗液，用乙酸乙酯(500ml)再萃取。合并有机相，用NaHCO3饱和水液(400ml，pH8.34)和Nacl饱和水液(400ml，pH7.5)洗涤。有机相经MgSO4(约100克)干燥后，用经活化的脱色木炭(30克，BDH)处理。15分钟后，该混合物用Celite 层过滤，真空浓缩至160ml，冷却过液(4℃)，用滤纸(Whatman No.1)过滤分出固体。滤饼用乙醚和己烷(各100ml)洗涤，真空干燥后得出35.98克(由上面糠醛胺的产率为61.4%)标题产物(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮，为白色针状物，mp118-119℃。经HPLC定量分析证明在母液中含8.10克标题产物。因此，由上面糠醛胺出发的有效产率为75.3%。
实施例2(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮的立体有择水解本例中使用的基质是以实施例1标题产物制备的外消旋物 本例立体有择水解的产物是化合物Ⅱa和Ⅱb(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮(Ⅱa) 手性乙酸酯(3R)(-)-顺式-3-羟基-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮(Ⅱb)
所说的立体有择水解进行如下制备了一种含10克基质和100克由假单孢菌得到的脂肪酶PS-30(Amano国际公司)的于1升25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的反应混合物。于30℃和150转/分(RPM)搅拌下进行反应。反应期间反应混合物的pH用5N NaOH和pH计(pH Stat)保持在7.0。用高压液相色谱(HPLC)监测水解反应。定期取样(1ml)，用乙酸乙酯(10ml)萃取。分出乙酸乙酯层蒸干，用HPLC分析(说明如下)基质和产物浓度以及产物的旋光纯度，所得的结果示于下表1中。
表1反应时间 转化率 产率 产物的旋光(小时) (%产物IIb) (%产物IIa) 纯度IIa(%)4 18 82 --8 34 66 --12 46 54 --16 51 49 >99.4
工艺手性HPLC试验在上述反应期间，定期取1ml样品，在50ml带螺旋盖试管中用10ml乙酸乙酯萃取。除去乙酸乙酯层(5ml)，在缓缓的氮气流中蒸发。残余物溶解在2ml移动相(己烷∶无水乙醇 95∶5)中，使移动相通过0.2μm Lydex过滤器，并将约1ml滤液移入HPLC分析用波形瓶中。
HPLC条件Hewleft Packard 1090色谱图柱Chiralcal AD移动相己烷∶无水乙醇，95∶5柱温度环境温度流速1ml/分检测器210nm外消旋乙酸酯中两种对映体的滞留时间分别为23.2和28.9分钟。外消旋醇中两种对映体的滞留时间分别为63.9和74.8分。
实施例3用固定的脂肪酶PS-30酶立体有择水解(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮所用的基质和得到的产物是上实施例2中的。
酶的固定此固定操作采用了三种不同载体XAD-7(Amberlite XAD-7非离子聚合吸附剂，20～60目的聚丙烯酸树脂)、XAD-2(Amberlite XAD-非离子聚合吸附剂，20～60目聚苯乙烯树脂)和Accurel PP(聚丙烯树脂200～400微米)。
将粗品Amano PS-30脂肪酶(10克)溶解在25ml蒸馏水中，在10000 RPM下离心10分钟以便获得上清液。在25ml小瓶中用甲醇洗涤载体(1.3克)五次，将其加入烧瓶中的酶溶液内，于室温下在转动摇床小缓缓振荡。用脂肪酶试验法(用Sigma橄榄油乳液作基质)借助于滤液中残余的蛋白质定期检验酶在载体上的吸附。用XAD-7、XAD-2和Accurel树脂分别获得的吸附率为68%、71%和98%左右。完全固定后(20～24小时)，级微孔滤器过滤载体-酶浆液，载体用约300ml蒸馏水洗涤，然后在真空烘箱中于室温下干燥含固定的脂肪酶的载体。
固定酶的用途用固定的酶作实施例2中所述的酶催水解反应。制备一种反应混合物，其中含30ml 25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)和300mg实施例2中所述的基质以及300mg上面制备的固定的脂肪酶PS-30。
按实施例2进行反应，所得到的结果示于下表2中。
表2固定的 反应时间 转化率 产率 产品IIa的旋载体 (小时) (%产品IIb) (%产品IIa) 光纯度(%)XAD-2 3 53 47 99.0XAD-7 3 54 46 99.3Accurel PP 3 51 49 99.5
实施例4(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮的立体有择水解所用的基质和得到的产物为上实施例2中的。本实施例中使用了由不同来源的脂肪酶进行一些反应。
在每种反应中，该反应混合物存在于20ml 25mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)，含1克粗品脂肪酶和200mg基质中。25℃于pH固定为7.0的条件下进行该反应，得到的结果列于下表3中。
表3酶 来源 反应时间(小时)脂肪酶 PS-30 Pseudo- Amano Int. 16monas SP.
脂肪酶 AY-30 Amano Int. 8假丝酵母菌属 SP脂肪酶 AK Pseudo- Amano Int. 16monas SP.
假单孢菌属 Biocatalyst Ltd. 16fluorescensPorcine pancreatic Sigma 19脂肪酶酯酶30,000 Gist-Brocarde 24酯肪酶OF Sepracor 8KID酯肪酶 Gist-Brocarde 48脂肪酶R.根霉菌属SP. Amano Int 24
转化率 产率 产品IIa的旋(%产物IIb) (%产物IIa) 光纯度(%)52 48 >99.555 45 99.053 47 99.355 45 98.852 48 99.851 49 9556 44 99.552 48 9556 44 99.0实施例5(±)-顺式-3-羟基-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮的立体有择酰化(酯化)本实施例所用的基质是用化学水解(用Na2CO3)相应的外消旋酯制得的外消旋物 本例主体有择酰化的产物是化合物Ⅱa和Ⅱb
Ⅱa( )-顺式-3-羟基-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮 Ⅱb(-)-顺式-3-羟基-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮 本例中使用了不同来源的脂肪酶进行一些反应，以便达到立体有择的酰化。每个反应中，存在于25ml甲苯中的该反应混合物均含1克粗脂肪酶和100mg基质，800mg乙酸异丙烯酯和0.05%水。在振荡器上于30℃以100 RPM进行该反应。用HPLC分析产物和基质，得到的结果示于下表4中。
表4转化率 产率 产品IIa的(%产物 (%产物 旋光纯度酶 来源 IIb) IIa) (%)脂肪酶 PS-30 Amano Int. 52 48 99.5脂肪酶 AY-30 Amano Int. 55 45 99.0脂肪酶 R Amano Int. 51 49 96.8假单孢菌属 Biocatalyst Int. 54 46 98.8fluorescens脂肪酶 OF Sepracor 52 48 99.0猪胰腺脂肪酶 Sigma 54 46 98.0实施例6立体有择水解各种酶的评价所用的基质和得到的产物是上实施例2中的。对每个立体有择水解反应，均制备了一种处于20ml 25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的反应混合物，其中含200mg基质和1克酶(酶见表5)。30℃于150 RPM搅拌下进行该反应。反应期间，用1N NaOH和pH计使反应混合物pH保持在7.0。该水解反应用HPLC监测。定期取1ml样品，用4ml乙酸乙酯萃取。分出乙酸乙酯层，蒸干，用HPLC分析基质和产物的浓度以及该产物的旋光纯度，得到的结果示于下表5之中。
表5反应时 产率 产品IIa的间(小 (%产品 旋光纯度酶 来源 时) IIa) (%)脂肪酶 PS-30 Amano Int. 16 48 >99.5脂肪酶 AY-30 Amano Int. 8 46 >99脂肪酶 AK Amano Int. 16 47 >99假单孢菌属 Biocatalysts 16 45 >99fluorescens Ltd.
脂肪酶猪胰腺脂肪酶 Sigma 19 47 98.8酯酶 30,000 Gist/Brocarde 24 35 99脂肪酶 OF Sepracor 8 44 99KID 脂肪酶 Gist/Brocarde 48 38 95脂肪酶 R Amano Int. 24 44 99实施例7用固定的脂肪酶PS-30离析(±)-顺式-3-乙酰氧-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮的动力学所用的基质和得到的产物与上实施例2中的相同。
制备了一种于8.5升25mM磷酸钾缓冲液pH7.0中的反应混合物，其中含85克基质和85克源于假单孢菌的脂肪酶PS-30(Amano International Co.)。将脂肪酶PS-30固定在Accural聚丙烯上，用于此反应混合物中。反应在30℃和150RPM搅拌下进行。反应期间，用5N NaOH和pH计维持反应混合物pH值为7.0。水解反应用HPLC监测。定期取出1ml样品用4ml乙酸乙酯萃取。分出乙酸乙酯层蒸干，用HPLC分析基质和产物的浓度以及产物的旋光纯度，所得到的结果列于下表6中。
表6反应时间 A-乙酸酯 B-乙酸酯 A-醇(小时) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)0 6.2 5.2 01 2.1 5.2 2.92 0.65 5.2 4.13 0.19 5.1 4.34 0.1 5 4.95 痕量 4.95 4.96 痕量 4.9 4.9反应时间 B-醇 B-乙酸酯旋 A-醇旋光(小时) (mg/ml) 光纯度(%) 纯度(%)0 0 50 >991 0 72 >992 0 89.6 >993 痕量 98.5 >994 痕量 98.5 >995 0.13 >99 976 0.15 >99 97
“A-乙酸酯”具有下示结构 “B-乙酸酯”具有下示结构 “A-醇”具有下示结构 “B-醇”具有下示结构
(±)-顺式-3-羟基-4-(2′-呋喃基)氮杂环丁-2-酮的立体有择酯化本实施例中使用的基质和得到的产物与实施例5中的相同。制备了一种于10ml甲乙酮(MEK)中的反应混合物，其中含20克基质、1克酶(见表7)和0.4ml乙酸异丙烯酯作酰基给予体。该反应在30℃和150 RPM搅拌下进行。该酯化反应用HPLC(说明如下)监测，以便确定基质和产品的浓度以及产品的旋光纯度，得到的结果示于下表7中。
表7反应时间 手性乙酸酯酶 来源 (小时) 产率(%)脂肪酶 PS-30 Amano Int. 96 50.5脂肪酶 AY-30 Amano Int. 120 51脂肪酶 AK Amani Int. 120 49脂肪酶 OF Sepracor 96 49.5
乙酸酯 手性醇 醇的旋光的旋光 的产率 纯度酶 来源 纯度(%) (%) (%)脂肪酶 PS-30 Amano Int. 99.5 49.5 99脂肪酶 AY-30 Amano Int. 99 49 99脂肪酶 AK Amani Int. 99.5 51 99脂肪酶 OF Sepracor 99.4 50.5 99HPLC法上实施例中用HPLC分析了基质和产物。用了一种Nova Pak C18反相柱(3.9×150mm)，移动相是15%乙腈水溶液，流速为1ml/分。检测波长227nm。醇和乙酸酯的反应时间分别为2.7和14.9分钟。
用手性HPLC测定了手性乙酸酯的旋光纯度，使用的是Chiralpak AS柱。移动相由己烷∶乙醇(96∶4)组成，室温下流速为1ml/分。检测波长为210nm。外消旋酯中两种对映体的滞留时间分别为23.7和20.9分钟。外消旋醇中两种对映体的滞留时间分别为63.9和74.8分钟。
权利要求
1.一种离析含对映体Ia和Ib的混合物I的方法，其中在Ia和Ib中的R1均处于R2的顺位上或者Ia和Ib中的R1均处于R2的反位上 式中R1是羟基、卤素或-O-C(O)-R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基团，R2是杂环基或环烷基，以及R3是氢、R4、-C(O)-OR4或-C(O)-R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团；所说的方法包括使所说的混合物I与能使所说化合物Ia和Ib中一种化合物催化立体有择的转化成非对映体形的酶或微生物接触，并且进行所说的转化的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中所说的立体有择转化选自立体有择水解和立体有择酯化。
3.根据权利要求1的方法，其中含对映体Ⅰa(1)和Ⅰb(1)的混合物Ⅰ。 被离析成含化合物Ⅱa(1)和Ⅱb(1)的混合物Ⅱ 所说的方法包括下列步骤(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)中任一步骤(ⅰ)当R1是-O-C(O)-R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R1a和R1b中一个与R1相同，另一个是羟基时，在水和/或有机醇存在下使所说的混合物Ⅰ与能将混合物Ⅰ催化立体有择水解形成所说的混合物Ⅱ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅱ)当R1是羟基，而且R1a和R1b中一个是羟基，另一个R4-C(O)-O-时，其中R4独立选自上面对R4定义的那些基团时;在化合物Ⅲ存在下(式中R4与上面对R1a或R1b定义的相同，而且L是离去基团)，使所说的混合物Ⅰ与能够将混合物Ⅰ催化立体有择酯化形成所说混合物(Ⅱ)的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅲ)当R1是卤原子时，而且R1a或R1b中一个是卤素而另一个是羟基时，使所说的混合物Ⅰ，在氢氧离子给予体存在下，与能使混合物Ⅰ催化立体有择脱卤形成所说混合物Ⅱ的酶或微生物接触的步骤。
4.根据权利要求3的方法，其中所用的混合物Ⅰ含Ⅰa(1)和Ⅰb(1)。 式中R1是链烷酰氧基或羟基;R2是呋喃基或噻吩基;以及R3是氢、苯基或取代的苯基。
5.根据权利要求4中的方法，其中使用脂肪酶。
6.根据权利要求1的方法，其中采用分离步骤进一步分离非对映体化合物。
7.根据权利要求6的方法，其中所说的分离步骤是萃取、蒸馏、结晶或柱色谱步骤。
8.根据权利要求1的方法，其中使用所说方法的产物进一步制备带C-13侧链的紫杉烷类。
9.一种离析含对映体Ⅳa和Ⅳb的混合物Ⅳ的方法，和其中Ta是 而且Tb是 Ta是 和Tb是 其中R1在Ⅳa和Ⅳb中均相对于基团W处于赤位上或在Ⅳa和Ⅳb中均相对于基团W处于苏位上;W是-NHR3或-N3R1是羟基，卤素，或-O-C(O)R4，而R4是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基;R2是杂环基或环烷基;R3是氢，R4，-C(O)OR4，或-C(O)R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;R6是氢，或R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团;所说的方法包括使所说的混合物Ⅳ与能够使所说的化合物Ⅳa或Ⅳb中之一催化立体有择转化成非对映体形的酶或微生物接触并且进行所说转化的步骤。
10.根据权利要求9的方法，其中离析含对映体Ⅳa(1)和Ⅳb(1)的混合物Ⅳ 形成含化合物Ⅴa(1)和Ⅴb(1)的混合物Ⅴ 该方法包括下列步骤(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)中之一(ⅰ)当R1是-O-C(O)-R4，R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R1a和R1b之一与R1相同，另一个是羟基时，在水和/或有机醇存在下，使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择水解混合物Ⅳ成为所说的混合物Ⅴ的酶或微生物接触的步骤;或(ⅱ)当R1是羟基，而且R1a和R1b中之一是羟基，而另一个是R4-C(O)-O-，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团时;在化合物Ⅲ存在下(式中R4如上面对R1a或R1b中的定义，而且L是离去基团)，使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择酯化混合物Ⅳ成为所说混合物Ⅴ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅲ)当R1是卤素原子时，而且R1a或R1b中一个是卤素，另一个是羟基时，在氢氧离子给予体存在下，使所说的混合物Ⅳ能够催化立体有择的混合物Ⅳ脱卤形成所说的混合物Ⅴ的酶或微生物接触的步骤。
11.根据权利要求9的方法，其中离析含对映体Ⅳa(1)和Ⅳb(1)的混合物Ⅳ 形成含化合物Ⅳa(1)和Ⅳb(1)的混合物Ⅴ 所说方法包括下列步骤(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)中之一(ⅰ)当R6是氢，而且R6a或R6b之一是氢，另一个是R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团时，在式Ⅶ有机醇存在下(其中R4如上面对R6a或R6b的定义)使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择酯化混合物Ⅳ形成所说混合物Ⅳ的酶或微生物接触的步骤;或(ⅱ)当R6是R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R6a和R6b之一与R6相同，另一个是氢时，在水存在下，使所说的混合物Ⅳ与能将混合物Ⅳ催化立体有择水解形成所说混合物Ⅵ的酶或微生物接触的步骤;或者(ⅲ)当R6是R4，而R4独立选自上面对R4定义的那些基团，而且R6a和R6b中之一与R6相同，另一个是R7，而R7是烷基、链烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基或杂环基，但条件是R7不同于R6时，在式Ⅷ有机醇存在下，(式中R7如上述定义同)使所说的混合物Ⅳ与能够催化立体有择酯转移混合物Ⅳ形成所说混合物Ⅵ的酶或微生物接触的步骤。
12.根据权利要求9的方法，其中进一步用分离步骤分离得到的非对映体化合物。
13.根据权利要求12的方法，其中所说的分离步骤是萃取、蒸馏、结晶或柱色谱步骤。
14.根据权利要求9的方法，其中用所说方法的产物进一步制备带C-13侧链的紫杉烷。
全文摘要
酶催离析对映体(如β-内酰胺化合物)混合物用方法，所说的化合物可以作为中间体制备带C-13侧链，该侧链上有杂环或环烷基的紫杉烷类，而这种紫杉烷可以用于药物领域。
文档编号C07D205/08GK1100144SQ9410859
公开日1995年3月15日 申请日期1994年7月14日 优先权日1993年7月14日
发明者R·N·帕特尔 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司
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