专利名称：N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物的制作方法
技术领域：
本发明人研究了仅具有低毒性和更优良制癌作用的秋水仙碱衍生物，首先发现了下式(B)所示的脱乙酰基秋水仙碱衍生物显示出强的抑制癌细胞增殖的作用，并提出了那些化合物(参考EP-A-493，064)。
另一方面，也已经知道，下式(C)所示的秋水仙裂碱氨化物对癌细胞具有药理作用[Journal of the National Cancer Institute，13，731-739(1952)]。
本发明人广泛地研究了具有更低毒性和更优良的制癌作用的秋水仙碱衍生物和它们相关的化合物，结果发现，上式(Ⅰ)所示的、通过在上式(B)化合物的10位用甲氨基取代甲氧基得到的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物也具有降低的毒性并显示出强的抑制癌细胞增殖的作用，预期可用作制癌剂，从而完成了本发明。
在上式(Ⅰ)中R所代表的“从C3-7糖羧酸除去COOH后得到的残基”的实例有从C3-7单糖羧酸如甘油酸、核糖羧酸、葡糖醛酸、葡糖酸和葡庚糖酸除去羧基得到的一价残基(下文称为糖残基)，具体实例如下
存在在如此所述的糖残基中的多个羟基中的至少的一部分可以适当地用羟基保护基保护。保护基的实例有酰基如C1-10(优选C2-6)链烷酰基如乙酰基、丙酰基、丁酰基和新戊酰基，以及芳酰基如苯甲酰基;以及式
所示的缩醛和缩酮基，式中R1表示氢或烷基，R2表示C1-6(优选C1-4)烷基或苯基，例如，
作为优选的R，可提及的是下式所示的基团，
式中R3和R4各表示氢或羟基保护基(例如，上述的酰基)，或者R3和R4结合起来表示羟基保护基(例如，上述的缩醛或缩酮)。
此外，作为式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物的盐，可提及的有例如无机酸盐如盐酸盐和硫酸盐;以及有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、glytyllytinate、苯甲酸盐等。
本发明的上述式(Ⅰ)化合物可以，例如，通过用式(Ⅲ)所示的糖羧酸或其活性衍生物对式(Ⅱ)所示的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物进行酰胺化得到，
式中R如上所定义。
式(Ⅱ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物与式(Ⅲ)的糖羧酸或其活性衍生物的酰胺化反应可以用在肽化学中本身已知的酰胺化反应来进行。
例如，本发明的化合物可通过在碱存在下使式(Ⅱ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物与式(Ⅲ)的糖羧酸的酰卤反应制备。上述反应通常在大约0℃和大约30℃之间进行，优选在大约0℃至大约室温之间进行，酰卤的用量无严格限制，但就每摩尔N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物而言通常使用1-1.5mol、特别是1-1.2mol的酰卤是合适的。此外，作为碱，可以用例如叔胺如三乙胺和吡啶;碱金属碳酸盐(碳酸氢盐)如碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾;等等。就每摩尔N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物而言，碱的用量通常可以是1-1.5mol，优选1-1.2mol。
上述反应通常在惰性溶剂中进行的，作为可用的溶剂，可提及的有例如卤代烃如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷和三氯乙烷;脂族醚如乙醚和甲基溶纤剂;芳烃如苯和甲苯;等等。
此外，本发明化合物也可以通过在缩合剂如DCC(二环己基碳化二亚胺)存在下使N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物与上式(Ⅲ)的糖羧酸直接反应或通过N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物与上式(Ⅲ)的糖羧酸的酯(例如甲酯、乙酯、丁酯等)反应来制备。
在上述反应中，用作起始原料的式(Ⅱ)化合物是在过去的文献中没有公开的新化合物，并且，例如，可通过下述方法制备，即按照在J.L.Hartwell，M.V.Nadkarni和J.LeiterJ.Am.Chem.Soc.，74，3180(1952)中公开的方法使脱乙酰基秋水仙碱[参见J.Am.Chem.Soc.，75，5292(1952);EP-A-493，064]与甲胺反应，或者使秋水仙碱与甲胺反应，并水解所得的N-甲基秋水仙裂碱氨化物(脱乙酰基)[参考后面所述的参考实施例1]。
本发明的上述式(Ⅰ)化合物还可以通过脱乙酰基秋水仙碱衍生物与甲胺反应将甲氧基转变成甲氨基来制备，其中所述的脱乙酰基秋水仙碱衍生物参考下文所述的参考实施例2，它们被公开在上述EP-A-493，064中，用下式表示
式中R如上定义。
式(Ⅳ)化合物的甲氨基化反应可通过本身已知的方法进行[参见Patrick J.Davis，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，Mar.1981，P465-469;J.L.Hartwell等人，J.Am.Chem.Soc.，74，3180(1952)]，例如，通过使式(Ⅳ)化合物与甲胺在室温至溶剂的回流温度下进行反应，优选约40℃至约90℃温度。
虽然甲胺的用量并无严格限制，但就每摩尔式(Ⅳ)化合物而言，其用量通常为2至30摩尔，特别是10至20摩尔。上述甲氨基化反应通常在密闭容器中在含水介质存在下进行。
由此方法得到的本发明化合物可通过本身已知的方法分离和纯化，例如通过提取、层析、结晶或其结合等方法来分离和纯化。
在一些情况下，可以使其中R表示的糖残基中存在有羟基保护基的本发明化合物脱去保护基，例如通过水解除去保护基。
此外，需要时，可按照本身已知的成盐方法，例如，通过用合适的酸处理，将如此得到的式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物转化成上述盐。
按本发明得到的上述式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物在侧链上具有不对称碳原子，可以以D-、L-或DL-形式存在。
从下面对癌细胞的体外试验可明显看出，本发明所提供的上述式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物具有优良的制癌作用。
试验实施例1体外癌细胞增殖抑制试验将次培养移植在小鼠腹腔中的小鼠白血病细胞p388/S和耐阿霉素小鼠白血病细胞p388/ADR与其中的asites一起分别取出，洗涤后，分别悬浮在RPMI 1640培养基(各含10%胎牛血清和10μM2-巯基乙醇)中，得到2×105个细胞/ml悬浮液。将0.5vol.%各试验溶液(下述实施例1的化合物在二甲基亚砜中的溶液)分别加到数份每一种细胞悬浮液中;将混合物分别加到24孔培养平皿中，在5%CO2培养容器中培养2天。向每一细胞培养肉汤中加入等量的0.5%台盼篮溶液，通过在显微镜下对作为活细胞而没染色的细胞计数，测定实施例1化合物的50%增殖抑制浓度(IC50)。三次试验结果示于下述表1中。
表1化合物细胞毒性IC50(ng/ml)p388/S p388/ADR3.2 9.2实施例1 化合物 4.2 11.04.6 11.1试验实施例2急性毒性试验将数份试验溶液(将下述实施例1的化合物溶于0.2N盐酸中，然后用生理盐水将该溶液稀释至所规定的浓度得到的溶液)腹膜内给予各组CDF雄性小鼠，每组分别包括8只小鼠，观察体重、症状、死亡日期等10天。以62mg/kg作为最大量，按1.3的通常比率降低使用量，用Litchfield Wilcoxon方法计算其LD50值，结果，实施例1化合物的LD50值是41.0mg/kg(35.8-46.9mg/kg)。
对于急性毒性症状，毛发的分布在给药后那天或那天后变坏，并且在高剂量组也观察到了所引起的腹泻或便秘的情况。此外，在47mg/kg给药组的存活情况中，观察到一些情况，这些情况显示出象右腿水肿和身体的一侧麻痹一样行走。此外，就重量变化而言，在每种情况下，体重在给药后最多2-4天倾向于减轻，但其后又逐渐增加。
从上面的试验结果明显看出，本发明化合物对癌细胞具有很强的抑制作用，仅有较低的毒性，可望用作制癌剂。
当本发明的化合物用作药物如制癌剂时，所述化合物可被口服或非经胃肠道给药(例如，静脉注射、肌内注射、皮下注射等)。其有效剂量可在很宽范围内变化，取决于服用所述化合物的病人的症状、疾病的程度、体重和年龄、医生的判断等，但例如在注射情况下，通常可为约1至约5mg/kg/天，所述化合物可一天服用一次，或分成几次服用。
当将本发明的化合物作为药物使用时，可将有效量的化合物与可药用的载体或稀释剂(如赋形剂、溶剂、其它辅助剂等)一起配制成适于给药的给药单位形式，例如配制成下述剂型片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、肠内吸收剂、锭剂、糖浆、酏剂、液体制剂、悬浮液和乳液。
作为适用于上述制剂中的载体或稀释剂，可提及的有例如赋形剂如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇和羧甲基纤维素;润滑剂如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石;粘结剂如糊精、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶、玉米淀粉和明胶;崩解剂如土豆淀粉和羧甲基纤维素;稀释剂如注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、丙二醇和聚乙二醇;等等，此外，需要时，可以加入调味剂、着色剂、张力剂、稳定剂、防腐剂、使本发明化合物无痛的试剂等。
此外，需要时，也可以将另外的药理活性物质配入本发明的药物中。
下面用实施例更详细地描述本发明。
参考实施例1N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物的制备
使秋水仙碱(5.00g，12.5mmol)、40%甲胺水溶液(10ml，130mmol)和乙醇(10ml)的混合溶液在封闭管中于120℃和搅拌下反应20小时。蒸除溶剂，向残留物中加入水(10ml)，用氯仿提取混合物。分出氯仿层，用水洗涤后干燥。蒸发溶剂，通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇(20∶1)]分离和纯化残留物。由此得到了4.20gN-甲基秋水仙裂碱氨化物，为黄色晶体(收率84%)。
将N-甲基秋水仙裂碱氨化物(3.00g，7.5mmol)，水(50ml)和浓硫酸(15ml)的混合溶液在100℃搅拌5小时进行水解(脱乙酰基反应)。在冰冷却下用无水碳酸钠碱化反应溶液，用氯仿提取。分出氯仿层，用水洗后干燥。蒸发溶剂至干。通过硅胶柱层析[氯仿∶甲醇(20∶1)]分离和纯化残留物。由此得到2.20g黄色晶状的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物。
参考实施例2N-(0，0-异亚丙基甘油酰基)脱乙酰基秋水仙碱(Ⅳa)[别名脱乙酰基秋水仙碱-丙酮化甘油酰胺]
将丙酮化甘油酸钾(3.60g，20mmol)悬浮在30ml无水乙醚中，向悬浮液中滴加2.40g(20mmol)亚硫酰氯的乙醚(5ml)溶液。滴加完后，将混合物回流3小时。混合物冷却至室温后，抽滤出沉淀物，减压下浓缩滤液。向残留物中加入无水二氯甲烷溶解之。
同时，将2.96g(8.3mmol)脱乙酰基秋水仙碱和2.02g(20mmol)三乙胺溶于30ml二氯甲烷中。将混合物冷却至0℃，滴加上述的甘油酰氯的二氯甲烷溶液。在0℃搅拌3小时后，二氯甲烷溶液用碳酸氢钠水溶液洗涤。用硫酸镁干燥二氯甲烷层，然后减压浓缩。通过硅胶柱层析分离残留物，从苯-丙酮(5∶1)洗脱液得到1.11g标题化合物(Ⅳa-V∶L-异构体)。收率28%，m.p.251-253℃(分解)。
此外，从苯-丙酮(5∶2)洗脱液得到0.58g第二种标题化合物(Ⅳa-2∶D-异构体)收率14%。
实施例1N′-(0，0-异亚丙基甘油酰基)-N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物
将N-(0，0-异亚丙基甘油酰基)脱乙酰基秋水仙碱(Ⅳa)(2.74g，5.6mmol)和10ml40%甲胺水溶液置于封闭管中，加热至75-80℃的同时搅拌20小时。反应完毕，在蒸发器中浓缩反应混合物，残留物溶于氯仿中。氯仿层用饱和盐水洗涤，用硫酸镁干燥。减压下蒸除氯仿，通过硅胶柱层析分离纯化残留物，结果，从苯-丙酮(4∶1)洗脱液中得到1.93g(收率70%)的所需化合物。
IR1660cm-1(C＝O)NMRδ＝1.40，1.44(3H，s)，1.49，1.69(3H，s)，1.85-1.95(2H，m)，2.17-2.54(3H，m)，3.07(3H，d)，3.61(3H，s)，3.89(3H，s)，3.94(3H，s)，3.99-4.06(1H，m)，4.18-4.29(1H，m)，4.41-4.51(1H，m)，4.63-4.72(1H，m)，6.54(1H，s)7.05-7.44(3H，m)实施例2
将丙酮化甘油酸钾(3.60g，20mmol)悬浮在30ml无水乙醚中，向悬浮液中滴加2.40g(20mmol)亚硫酰氯的乙醚(5ml)溶液。滴加完后，将混合物回流3小时。混合物冷却至室温后，抽滤出形成的沉淀物，减压下浓缩滤液。向残留物中加入无水氯仿溶解之。
同时，将2.96g(8.3mmol)N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物和2.02g(20mmol)三乙胺溶于30ml氯仿中。将混合液冷却至0℃，滴加上述的丙酮化甘油酰氯溶液。将所得氯仿溶液在0℃搅拌3小时后，用碳酸氢钠水溶液洗涤。用硫酸镁干燥氯仿层，然后减压浓缩。通过硅胶柱层析分离纯化残留物，从苯-丙酮(4∶1)洗脱液得到1.81g所需化合物(Ⅰa)。收率45%。
实施例3注射剂的制备在常温下，将2.0gN′-(0，0-异亚丙基甘油酰基)-N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物在常温下溶于1升注射用蒸馏水中，用氯化钠使所述溶液等渗，将混合物装入安瓿中，密封。1ml该注射液含2mg有效成分。
权利要求
1.下式所示的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物及其盐，
式中R表示从C3-7糖羧酸除去COOH得到的残基，该残基中存在的羟基可适当地用羟基保护基保护。
2.根据权利要求1的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物，其中R为
其中这些基团中存在的羟基可用酰基、缩醛基或缩酮基保护起来。
3.N′-(0，0-异亚丙基甘油酰基)-N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物。
4.制备权利要求1所述的式(Ⅰ)所示的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物或其盐的方法，其中包括用式(Ⅲ)所示的糖羧酸或其活性衍生物对式(Ⅱ)所示的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物进行酰胺化，
式中R如权利要求1中所定义，并且如果需要，将所得化合物转化成盐。
5.制备权利要求1所述的式(Ⅰ)所示的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物或其盐的方法，其中包括使式(Ⅳ)所示的脱乙酰基秋水仙碱衍生物与甲胺反应，将10位的甲氧基被甲氨基化，并且需要时，将所得化合物转化成盐，
式中R如权利要求1中所定义。
6.一种药物，其中含有权利要求1所公开的式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物或其可药用盐。
7.一种抗肿瘤剂，其中含有权利要求1所公开的式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物或其可药用的盐。
8.一种药物制剂，其中包含有效量的权利要求1所公开的式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物或其可药用的盐或可药用的载体或稀释剂。
9.一种治疗肿瘤的方法，其中包括服用抗肿瘤有效量的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物或其可药用的盐。
全文摘要
上式所示的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物，式中R表示由C
文档编号C07H7/033GK1090266SQ9310537
公开日1994年8月3日 申请日期1993年5月7日 优先权日1993年1月20日
发明者秋山澄 申请人:有限会社尾源研究所
技术领域：
本发明人研究了仅具有低毒性和更优良制癌作用的秋水仙碱衍生物，首先发现了下式(B)所示的脱乙酰基秋水仙碱衍生物显示出强的抑制癌细胞增殖的作用，并提出了那些化合物(参考EP-A-493，064)。
另一方面，也已经知道，下式(C)所示的秋水仙裂碱氨化物对癌细胞具有药理作用[Journal of the National Cancer Institute，13，731-739(1952)]。
本发明人广泛地研究了具有更低毒性和更优良的制癌作用的秋水仙碱衍生物和它们相关的化合物，结果发现，上式(Ⅰ)所示的、通过在上式(B)化合物的10位用甲氨基取代甲氧基得到的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物也具有降低的毒性并显示出强的抑制癌细胞增殖的作用，预期可用作制癌剂，从而完成了本发明。
在上式(Ⅰ)中R所代表的“从C3-7糖羧酸除去COOH后得到的残基”的实例有从C3-7单糖羧酸如甘油酸、核糖羧酸、葡糖醛酸、葡糖酸和葡庚糖酸除去羧基得到的一价残基(下文称为糖残基)，具体实例如下
存在在如此所述的糖残基中的多个羟基中的至少的一部分可以适当地用羟基保护基保护。保护基的实例有酰基如C1-10(优选C2-6)链烷酰基如乙酰基、丙酰基、丁酰基和新戊酰基，以及芳酰基如苯甲酰基;以及式
所示的缩醛和缩酮基，式中R1表示氢或烷基，R2表示C1-6(优选C1-4)烷基或苯基，例如，
作为优选的R，可提及的是下式所示的基团，
式中R3和R4各表示氢或羟基保护基(例如，上述的酰基)，或者R3和R4结合起来表示羟基保护基(例如，上述的缩醛或缩酮)。
此外，作为式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物的盐，可提及的有例如无机酸盐如盐酸盐和硫酸盐;以及有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、glytyllytinate、苯甲酸盐等。
本发明的上述式(Ⅰ)化合物可以，例如，通过用式(Ⅲ)所示的糖羧酸或其活性衍生物对式(Ⅱ)所示的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物进行酰胺化得到，
式中R如上所定义。
式(Ⅱ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物与式(Ⅲ)的糖羧酸或其活性衍生物的酰胺化反应可以用在肽化学中本身已知的酰胺化反应来进行。
例如，本发明的化合物可通过在碱存在下使式(Ⅱ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物与式(Ⅲ)的糖羧酸的酰卤反应制备。上述反应通常在大约0℃和大约30℃之间进行，优选在大约0℃至大约室温之间进行，酰卤的用量无严格限制，但就每摩尔N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物而言通常使用1-1.5mol、特别是1-1.2mol的酰卤是合适的。此外，作为碱，可以用例如叔胺如三乙胺和吡啶;碱金属碳酸盐(碳酸氢盐)如碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾;等等。就每摩尔N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物而言，碱的用量通常可以是1-1.5mol，优选1-1.2mol。
上述反应通常在惰性溶剂中进行的，作为可用的溶剂，可提及的有例如卤代烃如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷和三氯乙烷;脂族醚如乙醚和甲基溶纤剂;芳烃如苯和甲苯;等等。
此外，本发明化合物也可以通过在缩合剂如DCC(二环己基碳化二亚胺)存在下使N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物与上式(Ⅲ)的糖羧酸直接反应或通过N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物与上式(Ⅲ)的糖羧酸的酯(例如甲酯、乙酯、丁酯等)反应来制备。
在上述反应中，用作起始原料的式(Ⅱ)化合物是在过去的文献中没有公开的新化合物，并且，例如，可通过下述方法制备，即按照在J.L.Hartwell，M.V.Nadkarni和J.LeiterJ.Am.Chem.Soc.，74，3180(1952)中公开的方法使脱乙酰基秋水仙碱[参见J.Am.Chem.Soc.，75，5292(1952);EP-A-493，064]与甲胺反应，或者使秋水仙碱与甲胺反应，并水解所得的N-甲基秋水仙裂碱氨化物(脱乙酰基)[参考后面所述的参考实施例1]。
本发明的上述式(Ⅰ)化合物还可以通过脱乙酰基秋水仙碱衍生物与甲胺反应将甲氧基转变成甲氨基来制备，其中所述的脱乙酰基秋水仙碱衍生物参考下文所述的参考实施例2，它们被公开在上述EP-A-493，064中，用下式表示
式中R如上定义。
式(Ⅳ)化合物的甲氨基化反应可通过本身已知的方法进行[参见Patrick J.Davis，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，Mar.1981，P465-469;J.L.Hartwell等人，J.Am.Chem.Soc.，74，3180(1952)]，例如，通过使式(Ⅳ)化合物与甲胺在室温至溶剂的回流温度下进行反应，优选约40℃至约90℃温度。
虽然甲胺的用量并无严格限制，但就每摩尔式(Ⅳ)化合物而言，其用量通常为2至30摩尔，特别是10至20摩尔。上述甲氨基化反应通常在密闭容器中在含水介质存在下进行。
由此方法得到的本发明化合物可通过本身已知的方法分离和纯化，例如通过提取、层析、结晶或其结合等方法来分离和纯化。
在一些情况下，可以使其中R表示的糖残基中存在有羟基保护基的本发明化合物脱去保护基，例如通过水解除去保护基。
此外，需要时，可按照本身已知的成盐方法，例如，通过用合适的酸处理，将如此得到的式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物转化成上述盐。
按本发明得到的上述式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物在侧链上具有不对称碳原子，可以以D-、L-或DL-形式存在。
从下面对癌细胞的体外试验可明显看出，本发明所提供的上述式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物具有优良的制癌作用。
试验实施例1体外癌细胞增殖抑制试验将次培养移植在小鼠腹腔中的小鼠白血病细胞p388/S和耐阿霉素小鼠白血病细胞p388/ADR与其中的asites一起分别取出，洗涤后，分别悬浮在RPMI 1640培养基(各含10%胎牛血清和10μM2-巯基乙醇)中，得到2×105个细胞/ml悬浮液。将0.5vol.%各试验溶液(下述实施例1的化合物在二甲基亚砜中的溶液)分别加到数份每一种细胞悬浮液中;将混合物分别加到24孔培养平皿中，在5%CO2培养容器中培养2天。向每一细胞培养肉汤中加入等量的0.5%台盼篮溶液，通过在显微镜下对作为活细胞而没染色的细胞计数，测定实施例1化合物的50%增殖抑制浓度(IC50)。三次试验结果示于下述表1中。
表1化合物细胞毒性IC50(ng/ml)p388/S p388/ADR3.2 9.2实施例1 化合物 4.2 11.04.6 11.1试验实施例2急性毒性试验将数份试验溶液(将下述实施例1的化合物溶于0.2N盐酸中，然后用生理盐水将该溶液稀释至所规定的浓度得到的溶液)腹膜内给予各组CDF雄性小鼠，每组分别包括8只小鼠，观察体重、症状、死亡日期等10天。以62mg/kg作为最大量，按1.3的通常比率降低使用量，用Litchfield Wilcoxon方法计算其LD50值，结果，实施例1化合物的LD50值是41.0mg/kg(35.8-46.9mg/kg)。
对于急性毒性症状，毛发的分布在给药后那天或那天后变坏，并且在高剂量组也观察到了所引起的腹泻或便秘的情况。此外，在47mg/kg给药组的存活情况中，观察到一些情况，这些情况显示出象右腿水肿和身体的一侧麻痹一样行走。此外，就重量变化而言，在每种情况下，体重在给药后最多2-4天倾向于减轻，但其后又逐渐增加。
从上面的试验结果明显看出，本发明化合物对癌细胞具有很强的抑制作用，仅有较低的毒性，可望用作制癌剂。
当本发明的化合物用作药物如制癌剂时，所述化合物可被口服或非经胃肠道给药(例如，静脉注射、肌内注射、皮下注射等)。其有效剂量可在很宽范围内变化，取决于服用所述化合物的病人的症状、疾病的程度、体重和年龄、医生的判断等，但例如在注射情况下，通常可为约1至约5mg/kg/天，所述化合物可一天服用一次，或分成几次服用。
当将本发明的化合物作为药物使用时，可将有效量的化合物与可药用的载体或稀释剂(如赋形剂、溶剂、其它辅助剂等)一起配制成适于给药的给药单位形式，例如配制成下述剂型片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、肠内吸收剂、锭剂、糖浆、酏剂、液体制剂、悬浮液和乳液。
作为适用于上述制剂中的载体或稀释剂，可提及的有例如赋形剂如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇和羧甲基纤维素;润滑剂如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石;粘结剂如糊精、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯胶、玉米淀粉和明胶;崩解剂如土豆淀粉和羧甲基纤维素;稀释剂如注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、丙二醇和聚乙二醇;等等，此外，需要时，可以加入调味剂、着色剂、张力剂、稳定剂、防腐剂、使本发明化合物无痛的试剂等。
此外，需要时，也可以将另外的药理活性物质配入本发明的药物中。
下面用实施例更详细地描述本发明。
参考实施例1N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物的制备
使秋水仙碱(5.00g，12.5mmol)、40%甲胺水溶液(10ml，130mmol)和乙醇(10ml)的混合溶液在封闭管中于120℃和搅拌下反应20小时。蒸除溶剂，向残留物中加入水(10ml)，用氯仿提取混合物。分出氯仿层，用水洗涤后干燥。蒸发溶剂，通过硅胶柱层析(氯仿∶甲醇(20∶1)]分离和纯化残留物。由此得到了4.20gN-甲基秋水仙裂碱氨化物，为黄色晶体(收率84%)。
将N-甲基秋水仙裂碱氨化物(3.00g，7.5mmol)，水(50ml)和浓硫酸(15ml)的混合溶液在100℃搅拌5小时进行水解(脱乙酰基反应)。在冰冷却下用无水碳酸钠碱化反应溶液，用氯仿提取。分出氯仿层，用水洗后干燥。蒸发溶剂至干。通过硅胶柱层析[氯仿∶甲醇(20∶1)]分离和纯化残留物。由此得到2.20g黄色晶状的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物。
参考实施例2N-(0，0-异亚丙基甘油酰基)脱乙酰基秋水仙碱(Ⅳa)[别名脱乙酰基秋水仙碱-丙酮化甘油酰胺]
将丙酮化甘油酸钾(3.60g，20mmol)悬浮在30ml无水乙醚中，向悬浮液中滴加2.40g(20mmol)亚硫酰氯的乙醚(5ml)溶液。滴加完后，将混合物回流3小时。混合物冷却至室温后，抽滤出沉淀物，减压下浓缩滤液。向残留物中加入无水二氯甲烷溶解之。
同时，将2.96g(8.3mmol)脱乙酰基秋水仙碱和2.02g(20mmol)三乙胺溶于30ml二氯甲烷中。将混合物冷却至0℃，滴加上述的甘油酰氯的二氯甲烷溶液。在0℃搅拌3小时后，二氯甲烷溶液用碳酸氢钠水溶液洗涤。用硫酸镁干燥二氯甲烷层，然后减压浓缩。通过硅胶柱层析分离残留物，从苯-丙酮(5∶1)洗脱液得到1.11g标题化合物(Ⅳa-V∶L-异构体)。收率28%，m.p.251-253℃(分解)。
此外，从苯-丙酮(5∶2)洗脱液得到0.58g第二种标题化合物(Ⅳa-2∶D-异构体)收率14%。
实施例1N′-(0，0-异亚丙基甘油酰基)-N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物
将N-(0，0-异亚丙基甘油酰基)脱乙酰基秋水仙碱(Ⅳa)(2.74g，5.6mmol)和10ml40%甲胺水溶液置于封闭管中，加热至75-80℃的同时搅拌20小时。反应完毕，在蒸发器中浓缩反应混合物，残留物溶于氯仿中。氯仿层用饱和盐水洗涤，用硫酸镁干燥。减压下蒸除氯仿，通过硅胶柱层析分离纯化残留物，结果，从苯-丙酮(4∶1)洗脱液中得到1.93g(收率70%)的所需化合物。
IR1660cm-1(C＝O)NMRδ＝1.40，1.44(3H，s)，1.49，1.69(3H，s)，1.85-1.95(2H，m)，2.17-2.54(3H，m)，3.07(3H，d)，3.61(3H，s)，3.89(3H，s)，3.94(3H，s)，3.99-4.06(1H，m)，4.18-4.29(1H，m)，4.41-4.51(1H，m)，4.63-4.72(1H，m)，6.54(1H，s)7.05-7.44(3H，m)实施例2
将丙酮化甘油酸钾(3.60g，20mmol)悬浮在30ml无水乙醚中，向悬浮液中滴加2.40g(20mmol)亚硫酰氯的乙醚(5ml)溶液。滴加完后，将混合物回流3小时。混合物冷却至室温后，抽滤出形成的沉淀物，减压下浓缩滤液。向残留物中加入无水氯仿溶解之。
同时，将2.96g(8.3mmol)N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物和2.02g(20mmol)三乙胺溶于30ml氯仿中。将混合液冷却至0℃，滴加上述的丙酮化甘油酰氯溶液。将所得氯仿溶液在0℃搅拌3小时后，用碳酸氢钠水溶液洗涤。用硫酸镁干燥氯仿层，然后减压浓缩。通过硅胶柱层析分离纯化残留物，从苯-丙酮(4∶1)洗脱液得到1.81g所需化合物(Ⅰa)。收率45%。
实施例3注射剂的制备在常温下，将2.0gN′-(0，0-异亚丙基甘油酰基)-N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物在常温下溶于1升注射用蒸馏水中，用氯化钠使所述溶液等渗，将混合物装入安瓿中，密封。1ml该注射液含2mg有效成分。
权利要求
1.下式所示的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物及其盐，
式中R表示从C3-7糖羧酸除去COOH得到的残基，该残基中存在的羟基可适当地用羟基保护基保护。
2.根据权利要求1的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物，其中R为
其中这些基团中存在的羟基可用酰基、缩醛基或缩酮基保护起来。
3.N′-(0，0-异亚丙基甘油酰基)-N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物。
4.制备权利要求1所述的式(Ⅰ)所示的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物或其盐的方法，其中包括用式(Ⅲ)所示的糖羧酸或其活性衍生物对式(Ⅱ)所示的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物进行酰胺化，
式中R如权利要求1中所定义，并且如果需要，将所得化合物转化成盐。
5.制备权利要求1所述的式(Ⅰ)所示的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物或其盐的方法，其中包括使式(Ⅳ)所示的脱乙酰基秋水仙碱衍生物与甲胺反应，将10位的甲氧基被甲氨基化，并且需要时，将所得化合物转化成盐，
式中R如权利要求1中所定义。
6.一种药物，其中含有权利要求1所公开的式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物或其可药用盐。
7.一种抗肿瘤剂，其中含有权利要求1所公开的式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物或其可药用的盐。
8.一种药物制剂，其中包含有效量的权利要求1所公开的式(Ⅰ)的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物或其可药用的盐或可药用的载体或稀释剂。
9.一种治疗肿瘤的方法，其中包括服用抗肿瘤有效量的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物或其可药用的盐。
全文摘要
上式所示的N-甲基脱乙酰基秋水仙裂碱氨化物衍生物，式中R表示由C
文档编号C07H7/033GK1090266SQ9310537
公开日1994年8月3日 申请日期1993年5月7日 优先权日1993年1月20日
发明者秋山澄 申请人:有限会社尾源研究所
再多了解一些
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