专利名称：从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺的制作方法
纤维结合蛋白(Fibronectin，Fn)，又名纤维连接蛋白，纤粘素等。文献中也使用以下名称CIG，anti-gelatin factor，microfibrillar protein，opsonic protein，fibroblast surface antigen(FSA)，soluble fibroblast antigen(SF-antigen)，galactoprotein a，cell surface protein(CSP)，cell attachment factor (CAF)，cell spreading factor，large external transformation-sensisive(LEFS)protein，Zeta(Z)等。
纤维结合蛋白是一种高分子量冷凝蛋白，分子量约45K，存在于人及动物的体液(血液、羊水、组织液)及细胞表面及间质中，具有诱导细胞分化、增殖、连接细胞和间质、参与血液凝固、伤口愈合和机体防御等多种功能，是机体的重要组分。
对近20年(1972～1992)国际国内专利文献及科学文献的查新表明，以往已有一些提取纤维结合蛋白的方法(Ruoslahti E等Methods in Enzymol 1982;82803及Isumera M等 J Biochem 1981;901)，国外已有二个专利(Ep38462-A，1986;WO63483，1988)。国内尚无与本发明类似的专利申请。
现有的提取纤维结合蛋白的方法在提取中，使用多种大量的蛋白酶抑制剂，同时，采用三步或三步以上的层析步骤，使所用试剂药品增加，成本上升，而且提取手续繁杂，纤维结合蛋白的产生率不高。现有的提取方法局限于血液，原料来源受到限制。
本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺。本发明不仅降低了成本，简化了提取步骤，增加了产品的产出率，而且提高了产品的纯度。本发明可广泛应用于人及多种动物的多种体液(包括血液、羊水和组织液)，开拓了更广泛更廉价的原料来源。
为了实现上述发明目的，本发明者采取的生产工艺是(1)获取体液;(2)加入苯甲磺酰氟，低温超速离心;(3)加样于预制好的溴化氰琼脂糖凝胶白明胶层析柱，缓冲液洗脱纤维结合蛋白;(4)提取的纤维结合蛋白过滤、测量、无菌冻干;(5)提取的纤维结合蛋白生物学功能检测。本发明者注意到，纤维结合蛋白在进化过程中表现出很强的稳定性，人及各种动物体液中纤维结合蛋白的结构近似，主要的生物学功能相同。这为本发明的纤维结合蛋白的获取提供了广泛的价廉的原料。本发明根据纤维结合蛋白的分子量、冷凝性质。以及纤维结合蛋白与纤维蛋白、白明胶、原胶元有强烈亲和能力的理化特性，设计了本发明的生产工艺。
首先采集人和多种动物，如牛或马或猪或其他动物的体液，如血液或羊水或组织液，立即加入1/10的3～10%的枸椽钠抗凝(血液)，同时用0.1～0.3mol/L的苯甲磺酰氟(市售)抑制蛋白酶活性，保持在0～4℃低温下，并低温超速离心，0±1℃，7，500～25，000 RPM，10～40分钟，取上清液。
上清液加样于缓冲液A(主要含0.5～1mol/L Ttris-HCL，0.1～0.2mol/L PMSF，0.5～5%NaCl(溶液)平衡的白明胶琼脂糖凝胶层析柱上，琼脂糖凝胶和白明胶为市售产品。层析柱预先以溴化氰活化，活化液中主要含四硼酸钠0.1～0.2mol/L，偶联缓冲液主要含乙醇胺0.5～2mol/L，叠氮钠0.1～1mol/L，以上试剂均为市售产品。以ZY-1型紫外分光光度计(280nm)监测，以含脲缓冲液B洗，含脲缓冲液B主要含Tris-HCl 0.5～1mol/L，PMSF 0.1～0.2mol/L，脲3-8mol/L。在两小时中，50ml容积的琼脂糖凝胶白明胶亲和层析柱可以加入350～500ml样品。再用含高浓度Na 的缓冲液B洗下纤维结合蛋白。整个亲和层析过程应在0～5℃进行。提取的纤维结合蛋白可达电泳纯，储存于3～8mol/L的脲缓冲液B中。纤维结合蛋白经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，用分光光度计测定，280nm处吸收，计算纤维结合蛋白产量，分装，无菌冷冻干燥。
提取的纤维结合蛋白以1～1.5%琼脂糖恒压5～8V/cm电泳，结果呈单一电泳带，证明此提取的纤维结合蛋白纯度达电泳纯，经SDS连续梯度电泳证明其分子量为45K。分别用抗人及抗马、抗牛的纤维结合蛋白血清进行免疫扩散试验，结果抗原抗体间呈现清晰的沉淀线，证明提取物为纤维结合蛋白。应用多种细胞活性实验，包括多种细胞培养、巨噬细胞吞噬活性检测、细胞动态形态计量等方法证明其生物学功能。
本发明生产工艺较现有技术方法简单易行、成本低廉、重复性好、提取率高。血浆纤维结合蛋白提取率为50mg/100ml。
许多研究发现，机体内纤维结合蛋白水平失常，可导致许多疾病发生，如肿瘤、肝脏病、关节病、糖尿病、神经系统疾病以及败血症，弥慢性血管内凝血、休克等。纤维结合蛋白还在伤口的愈合中起关键性作用。实验动物模型已证明，纤维结合蛋白在创伤治疗中有明显效果。如Nishida将少量纤维结合蛋白涂于大鼠实验性皮肤伤口表面，伤口愈合速度明显增快。用纤维结合蛋白眼药水滴眼治疗角膜渍疡，用药第二天表皮大量生长，三周后溃疡愈合，无疤痕遗留，也无其他副作用。此外，纤维结合蛋白的凝血作用、治疗弥慢性血管内凝血(DIC)、败血症的作用也非常明显。因此，纤维结合蛋白有巨大的开发利用价值和应用前景。
本发明提取的纤维结合蛋白可作为生物学医学的研究、教学、临床检验的诊断试剂，也可作为细胞培养的重要介质。本发明提取的纤维结合蛋白可用于治疗外伤、烧伤、败血症和肿瘤等疾病，还可用于美容护肤及口腔保健牙膏中等。目前国内尚无纤维蛋白批量生产和出售。
权利要求
1.一种从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺，包括获取体液，蛋白酶抑制及超速低温离心，琼脂糖凝胶白明胶亲和层析，提取的纤维结合蛋白过滤、计量、无菌冻干，及纤维结合蛋白的生物学功能检测，其特征在于(1)获取体液后，立即加入1/10的3-10%枸橼酸钠溶液抗凝，同时用0.1～0.3mol/L的苯甲磺酰氟抑制蛋白酶活性，并保持在0.4℃，然后在0±1℃，以7，500～25，000转/分的转速，超速离心10～40分钟，取上清液。(2)将白明胶偶联于溴化氰活化的琼脂糖凝胶上，活化液主要含0.1～0.2mol/L四硼酸钠，然后用主要含0.5～1mol/L Tris-HCl，0.1～0.2mol/L PMSF和0.5～5%NaCl溶液的缓冲液A平衡琼脂糖凝胶白明胶亲和层析柱。加样品于亲和层析柱。紫外分光光度计监测，用含3～8mol/L脲的缓冲液B洗脱纤维结合蛋白。整个亲和层析过程应在0～5℃进行。
2.根据权利要求1所述的一种从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺，其特征在于采集人和多种动物，如马或羊或猪或牛的体液，如血液或羊水或组织液作为原料。
全文摘要
本发明属生物学医学中提取纤维结合蛋白的生产工艺。本发明应用单独的苯甲磺酰氟抑制蛋白酶活性，并用琼脂糖凝胶白明胶亲和层析技术一步层析，从人及动物体液(血液、羊水、组织液)中提取可应用于生物学医学研究、实验、医学临床及化妆美容的大分子糖蛋白——纤维结合蛋白(Fibronectin，Fn)。本发明的生产工艺提取纤维结合蛋白，成本低廉，产品纯度高，生产工艺简单稳定，提取率高。
文档编号C07H15/14GK1088584SQ92113640
公开日1994年6月29日 申请日期1992年12月22日 优先权日1992年12月22日
发明者向明明, 杨恬 申请人:向明明
纤维结合蛋白(Fibronectin，Fn)，又名纤维连接蛋白，纤粘素等。文献中也使用以下名称CIG，anti-gelatin factor，microfibrillar protein，opsonic protein，fibroblast surface antigen(FSA)，soluble fibroblast antigen(SF-antigen)，galactoprotein a，cell surface protein(CSP)，cell attachment factor (CAF)，cell spreading factor，large external transformation-sensisive(LEFS)protein，Zeta(Z)等。
纤维结合蛋白是一种高分子量冷凝蛋白，分子量约45K，存在于人及动物的体液(血液、羊水、组织液)及细胞表面及间质中，具有诱导细胞分化、增殖、连接细胞和间质、参与血液凝固、伤口愈合和机体防御等多种功能，是机体的重要组分。
对近20年(1972～1992)国际国内专利文献及科学文献的查新表明，以往已有一些提取纤维结合蛋白的方法(Ruoslahti E等Methods in Enzymol 1982;82803及Isumera M等 J Biochem 1981;901)，国外已有二个专利(Ep38462-A，1986;WO63483，1988)。国内尚无与本发明类似的专利申请。
现有的提取纤维结合蛋白的方法在提取中，使用多种大量的蛋白酶抑制剂，同时，采用三步或三步以上的层析步骤，使所用试剂药品增加，成本上升，而且提取手续繁杂，纤维结合蛋白的产生率不高。现有的提取方法局限于血液，原料来源受到限制。
本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺。本发明不仅降低了成本，简化了提取步骤，增加了产品的产出率，而且提高了产品的纯度。本发明可广泛应用于人及多种动物的多种体液(包括血液、羊水和组织液)，开拓了更广泛更廉价的原料来源。
为了实现上述发明目的，本发明者采取的生产工艺是(1)获取体液;(2)加入苯甲磺酰氟，低温超速离心;(3)加样于预制好的溴化氰琼脂糖凝胶白明胶层析柱，缓冲液洗脱纤维结合蛋白;(4)提取的纤维结合蛋白过滤、测量、无菌冻干;(5)提取的纤维结合蛋白生物学功能检测。本发明者注意到，纤维结合蛋白在进化过程中表现出很强的稳定性，人及各种动物体液中纤维结合蛋白的结构近似，主要的生物学功能相同。这为本发明的纤维结合蛋白的获取提供了广泛的价廉的原料。本发明根据纤维结合蛋白的分子量、冷凝性质。以及纤维结合蛋白与纤维蛋白、白明胶、原胶元有强烈亲和能力的理化特性，设计了本发明的生产工艺。
首先采集人和多种动物，如牛或马或猪或其他动物的体液，如血液或羊水或组织液，立即加入1/10的3～10%的枸椽钠抗凝(血液)，同时用0.1～0.3mol/L的苯甲磺酰氟(市售)抑制蛋白酶活性，保持在0～4℃低温下，并低温超速离心，0±1℃，7，500～25，000 RPM，10～40分钟，取上清液。
上清液加样于缓冲液A(主要含0.5～1mol/L Ttris-HCL，0.1～0.2mol/L PMSF，0.5～5%NaCl(溶液)平衡的白明胶琼脂糖凝胶层析柱上，琼脂糖凝胶和白明胶为市售产品。层析柱预先以溴化氰活化，活化液中主要含四硼酸钠0.1～0.2mol/L，偶联缓冲液主要含乙醇胺0.5～2mol/L，叠氮钠0.1～1mol/L，以上试剂均为市售产品。以ZY-1型紫外分光光度计(280nm)监测，以含脲缓冲液B洗，含脲缓冲液B主要含Tris-HCl 0.5～1mol/L，PMSF 0.1～0.2mol/L，脲3-8mol/L。在两小时中，50ml容积的琼脂糖凝胶白明胶亲和层析柱可以加入350～500ml样品。再用含高浓度Na 的缓冲液B洗下纤维结合蛋白。整个亲和层析过程应在0～5℃进行。提取的纤维结合蛋白可达电泳纯，储存于3～8mol/L的脲缓冲液B中。纤维结合蛋白经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，用分光光度计测定，280nm处吸收，计算纤维结合蛋白产量，分装，无菌冷冻干燥。
提取的纤维结合蛋白以1～1.5%琼脂糖恒压5～8V/cm电泳，结果呈单一电泳带，证明此提取的纤维结合蛋白纯度达电泳纯，经SDS连续梯度电泳证明其分子量为45K。分别用抗人及抗马、抗牛的纤维结合蛋白血清进行免疫扩散试验，结果抗原抗体间呈现清晰的沉淀线，证明提取物为纤维结合蛋白。应用多种细胞活性实验，包括多种细胞培养、巨噬细胞吞噬活性检测、细胞动态形态计量等方法证明其生物学功能。
本发明生产工艺较现有技术方法简单易行、成本低廉、重复性好、提取率高。血浆纤维结合蛋白提取率为50mg/100ml。
许多研究发现，机体内纤维结合蛋白水平失常，可导致许多疾病发生，如肿瘤、肝脏病、关节病、糖尿病、神经系统疾病以及败血症，弥慢性血管内凝血、休克等。纤维结合蛋白还在伤口的愈合中起关键性作用。实验动物模型已证明，纤维结合蛋白在创伤治疗中有明显效果。如Nishida将少量纤维结合蛋白涂于大鼠实验性皮肤伤口表面，伤口愈合速度明显增快。用纤维结合蛋白眼药水滴眼治疗角膜渍疡，用药第二天表皮大量生长，三周后溃疡愈合，无疤痕遗留，也无其他副作用。此外，纤维结合蛋白的凝血作用、治疗弥慢性血管内凝血(DIC)、败血症的作用也非常明显。因此，纤维结合蛋白有巨大的开发利用价值和应用前景。
本发明提取的纤维结合蛋白可作为生物学医学的研究、教学、临床检验的诊断试剂，也可作为细胞培养的重要介质。本发明提取的纤维结合蛋白可用于治疗外伤、烧伤、败血症和肿瘤等疾病，还可用于美容护肤及口腔保健牙膏中等。目前国内尚无纤维蛋白批量生产和出售。
权利要求
1.一种从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺，包括获取体液，蛋白酶抑制及超速低温离心，琼脂糖凝胶白明胶亲和层析，提取的纤维结合蛋白过滤、计量、无菌冻干，及纤维结合蛋白的生物学功能检测，其特征在于(1)获取体液后，立即加入1/10的3-10%枸橼酸钠溶液抗凝，同时用0.1～0.3mol/L的苯甲磺酰氟抑制蛋白酶活性，并保持在0.4℃，然后在0±1℃，以7，500～25，000转/分的转速，超速离心10～40分钟，取上清液。(2)将白明胶偶联于溴化氰活化的琼脂糖凝胶上，活化液主要含0.1～0.2mol/L四硼酸钠，然后用主要含0.5～1mol/L Tris-HCl，0.1～0.2mol/L PMSF和0.5～5%NaCl溶液的缓冲液A平衡琼脂糖凝胶白明胶亲和层析柱。加样品于亲和层析柱。紫外分光光度计监测，用含3～8mol/L脲的缓冲液B洗脱纤维结合蛋白。整个亲和层析过程应在0～5℃进行。
2.根据权利要求1所述的一种从体液中提取纤维结合蛋白的生产工艺，其特征在于采集人和多种动物，如马或羊或猪或牛的体液，如血液或羊水或组织液作为原料。
全文摘要
本发明属生物学医学中提取纤维结合蛋白的生产工艺。本发明应用单独的苯甲磺酰氟抑制蛋白酶活性，并用琼脂糖凝胶白明胶亲和层析技术一步层析，从人及动物体液(血液、羊水、组织液)中提取可应用于生物学医学研究、实验、医学临床及化妆美容的大分子糖蛋白——纤维结合蛋白(Fibronectin，Fn)。本发明的生产工艺提取纤维结合蛋白，成本低廉，产品纯度高，生产工艺简单稳定，提取率高。
文档编号C07H15/14GK1088584SQ92113640
公开日1994年6月29日 申请日期1992年12月22日 优先权日1992年12月22日
发明者向明明, 杨恬 申请人:向明明
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