专利名称：药用级枸橼酸铁及其制备方法
技术领域：
本发明涉及制药领域，涉及药用级枸橼酸铁制剂及其制备和精制方法。本发明还涉及以该药用级枸橼酸铁为有效成分的药物组合物，该药物化合物可治疗由于肾衰引起的高磷酸血症。
文献记载的合成枸橼酸铁的方法是以柠檬酸和氢氧化铁为原料，将柠檬酸加入氢氧化铁液中，以低于60℃的温度加热，蒸发至浆状，涂布于玻璃板上，低温干燥至形成小薄片，剥离即得。但是多年沿用下来的这种方法应该说有很大的随意性，只要求最终产品中以枸橼酸铁为主，对于制备过程的各条件参数没有非常明确的要求，所以这种常规的枸橼酸铁产品只能称为是粗制枸橼酸铁，呈紫褐色薄鳞片状，质地疏松，其中含有较多残留的枸橼酸，在使用时会影响到枸橼酸铁的质量和作用功效，同时也造成大量原料(枸橼酸)的浪费。该方法多年来也一直未有任何进展。
为了对上述常规的枸橼酸铁进行精制或提纯，业内曾有用大量水冲洗以除去尽量多杂质的方法在使用，但是枸橼酸铁在水中仍有一定的溶解度，大量水冲除会造成枸橼酸铁的流失外，还会因其部分溶解而增加损失，加上大量消耗水，导致整个过程成本高而起到的效果甚微。目前作为食品级和试剂级的枸橼酸铁，都是用该方法或类似方法进行的精制，经测定其中的枸橼酸根含量都在102％以上。
由于多年来枸橼酸铁都是应用在化工领域，其中枸橼酸根的含量也就没有被作为一个指标严格提出来。美国专利5753706中首次提出了枸橼酸铁可降低人体对磷酸盐的肠内吸收，因而可用于治疗由于肾衰引起的高磷酸血症。本发明将其全文引入作为参考。本申请人已经发现，过高的枸橼酸根含量(高于102％)会引起肾衰病人的代谢紊乱。所以，该美国专利的实施中一个很关键的问题是必须有可用于制药领域的枸橼酸铁产品。
总之，由于缺少一种有效的精制方法，制约了药用级枸橼酸铁制剂的工业化生产，也影响了枸橼酸铁在医药领域中的应用。
本发明还相应提出一种合成制备枸橼酸铁的方法，通过操作条件的具体化，在提高收率的同时缩短了反应时间，使枸橼酸铁的制备过程更加适应工业化的操作要求。
基于枸橼酸铁在治疗由于肾衰引起的高磷酸血症中的药物用途，本发明还提供了相应的药物组合物和药物剂型。
枸橼酸铁一般成红褐色透明薄片和棕色粉末，其水溶液成酸性，不易溶于冷水，但当水水温升高则会缓慢溶解，长久搅拌更增加溶解。另一方面，枸橼酸铁不溶于乙醇等一些短碳链的极性有机溶剂。本发明的申请人基于枸橼酸铁的性质，提出了一种不同于常规过程的精制方法，该精制过程包括使用极性有机溶剂对已合成出的枸橼酸铁进行浸泡以除去残留的枸橼酸和杂质，且所述极性有机溶剂选自枸橼酸铁基本上不溶的溶剂。
大量的实验结果证明，用有机溶剂处理枸橼酸铁，是一种有效的精制方法，可使产物中所含有的枸橼酸根与铁的摩尔百分比在99-101％，成为药用级的枸橼酸铁。
很显然，所述极性有机溶剂应该是选自枸橼酸铁基本上不溶的溶剂。本发明优选使用2-6个碳的醇类、酮类、醚类和酯类等溶剂，尤选可使用溶剂示例是乙醇、丙醇、乙二醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚或甲乙醚等。精制中，每1公斤枸橼酸铁可用7000-8000毫升左右的溶剂进行浸泡，精制后的枸橼酸铁收率可达到99％以上。
根据本发明优选的精制过程，是用95％乙醇在室温或低于室温的温度下对枸橼酸铁萃取一次以上，收集沉淀物，即得满足要求的药用级枸橼酸铁。
所述萃取，可以将枸橼酸铁浸泡在溶剂中1-2小时，使残余的枸橼酸溶解，然后过滤出固体，可以采用真空抽滤，对于滤出的颗粒再次用溶剂洗脱，所得固体为均匀发亮的紫褐色颗粒。
本发明在摸索获得药用枸橼酸铁的精制方法的同时，还尝试了以更科学有效的方法合成枸橼酸铁，配合精制操作，使整个制备过程更加科学合理，更适于工业化生产的推广。申请人经过了大量的实验和分析，发现，由于枸橼酸铁是一种带有结晶水的无定型结构的化合物，铁以络合的形式存在，一般为三价，在光及热的影响下会被还原成亚铁盐，使整个结构被破坏，因而有记载的枸橼酸铁的合成都是在低温，具体地是低于60℃下进行。本申请的发明人在对不同温度下的反应速率和产率的摸索实验中发现，温度对二者有影响，尤其是高温更有利于反应速率的提高。当反应温度在70℃，反应速率和产率与90℃下没有很大的差异，而60℃下的反应收率在88％左右，70℃下或高于70℃时的反应收率则可达到95％，反应时间的缩短更有利于防止产物受光和热影响而破坏。所以，本发明进一步提出了以氢氧化铁和枸橼酸为原料合成枸橼酸铁的过程，其中，枸橼酸和氢氧化铁的当量比大于1.0，反应温度60-70℃，合成产物在60℃以下烘干。
合成反应中通常都是要求枸橼酸过量，以有助于反应的进行，但是本发明人发现，当枸橼酸与氢氧化铁的当量比大于1.05时，尽管反应初期对反应有所帮助，但是产物的粘性较大，影响产品疏松结构的形成，使精制过程中的洗脱杂质发生困难。所以，根据本发明优选的方法，合成枸橼酸铁时，氢氧化铁与枸橼酸的当量比在1∶1.0-1∶1.05，反应时间48-72小时。具体操作中，可根据生产量来决定反应温度，例如，小量合成可控制70℃左右以加快反应，大批量合成由于搅拌不易，可降低至60℃或略高于60℃，适当延长反应时间。
根据本发明的另一个方面，还提出了一种治疗由于肾衰引起的高磷酸血症的药物组合物，其包括治疗有效量的上述药用级枸橼酸铁和药剂学上可接受的辅剂。
在动物试验的基础上，可以初步确定人体的耐受量，并结合药效研究(包括临床的单次给药耐受性试验和连续给药耐受性试验)得出在本发明的组合物中所述治疗有效量的枸橼酸铁是一般以单次剂量500-3000毫克计。优选地，所述药物组合物中枸橼酸铁的单次剂量为1000-2500毫克，更优选2000毫克。
本发明的药物组合物可以是例如溶液剂，所述药剂学上可接受的辅剂包括溶剂、防腐剂、矫味剂或调味剂；糖浆剂，所述药剂学上可接受的辅剂包括蔗糖、防腐剂、矫味剂或调味剂；凝胶剂，所述药剂学上可接受的辅剂包括胶凝剂、防腐剂、矫味剂或调味剂；胶囊剂；颗粒剂；散剂或片剂。
上述辅剂中，防腐剂可以是尼泊金、季铵盐、苯甲酸钠、山梨酸等。矫味剂可以包括甜味剂、香精、矫浆剂、泡腾剂等。胶凝剂例如甘油或丙二醇与纤维素衍生物、卡波姆、海藻酸盐、西黄耆胶、明胶、淀粉等。
当制成胶囊、颗粒剂、散剂或片剂时，可用的辅料均为药剂学上常规的物质，本发明没有特别要求。
本发明的实施提供了可用于制药工业的药用级枸橼酸铁，并可有助于使枸橼酸铁尤其是药用级枸橼酸铁的制备规范化，从而实现工业化生产。本发明同时也为利用枸橼酸铁作为有效成分制备用于治疗由于肾衰引起的高磷酸血症的药物提供了基础。药理学研究及结果主要药效学实验口服枸橼酸铁对慢性肾衰模型大鼠无机磷吸收与代谢的影响。
中国药品生物制品检定所药理室进行了枸橼酸铁对肾衰大鼠的主要药效学观察试验。通过测定慢性肾衰大鼠模型血清及尿液中磷、肌酐、尿素氮的浓度和粪便中磷的含量，以观察口服枸橼酸铁对慢性肾衰大鼠磷酸盐吸收与排泄的影响，进而评价其对肾衰所致高磷血症的治疗作用。
实验动物250g～300g的Wistar的大鼠；阳性对照药碳酸钙，分析纯；仪器日立产7060自动生化仪，肌酐、尿素氮、无机磷测定试剂盒，酶标仪；特制饲料在基础粉状饲料中分别加入不同药物粉末，搅拌均匀制成颗粒。伪手术组和模型组所食饲料含磷0.739％，碳酸钙组所食饲料含磷0.722％含碳酸钙2.33％，枸橼酸铁高剂量组所食饲料含磷0.704％，含枸橼酸铁4.76％；枸橼酸铁中剂量组所食饲料含磷0.721％，含枸橼酸铁2.44％；枸橼酸铁低剂量组所食饲料含磷0.730％，含枸橼酸铁1.23％。
实验方法将大鼠随机分为6组，分别为伪手术组、模型组、碳酸钙组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，伪手术组10只，其余每组14只。除了伪手术组外，其余各组切除和结扎肾脏制造大鼠肾衰模型，术后观察两周，存活大鼠按照性别和体重重新随机分组，每组10只，动物饮用水为经灭菌的去离子水，收集术后第22、28、31、35、38天时的尿液和粪便，分别测定。同时取血，分离血清进行测定并记录进食量。放入代谢笼后开始给予大鼠上述特制饲料直至实验结束。
测定方法(1)血清生化指标的测定眼眶静脉取血，分离血清，用自动生化仪和试剂盒测定血清中肌酐、尿素氮、无机磷的含量；(2)尿液生化指标的测定用代谢笼收集大鼠24小时尿液，记录尿量，用自动生化仪和试剂盒测定血清中肌酐、尿素氮、无机磷的含量；(3)粪便无机磷含量测定用代谢笼收集大鼠24小时粪便，灰化，称重，称取一定重量置于离心管中，加入10％高氯酸，室温过夜，以提取无机磷，离心后取上清液，用自动生化仪和试剂盒进行测定，计算出无机磷的含量。
统计方法数值表示为均值±标准差；模型组与伪手术组之间以及四给药组与模型组之间进行组间t检验。
表1.各组大鼠血清肌苷含量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表2.各组大鼠血清尿素氮含量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表3.各组大鼠血清无机磷含量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表1～3显示，模型组和伪手术组相比，其血清肌苷和血清尿素氮水平于手术后16天有显著增高，而除个别时间外，四给药组与模型组相比均无显著差异(见表1～3)。
表4.各组大鼠尿肌酐含量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表5.各组大鼠尿尿素氮含量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表6.各组大鼠尿无机磷含量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表7.各组大鼠尿无机磷排出量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表4～7结果显示，模型组和伪手术组相比，其尿液中肌酐水平、尿素水平、无机磷水平和无机磷排出量于术后第28天时开始有显著降低。四给药组尿肌酐水平和尿素氮水平与模型组相比均无显著差异(表4、5)。四给药组尿无机磷水平与模型组相比部分有显著差异(表6)。四给药组尿无机磷排出量与模型组相比除第16天、第31天的低剂量组无显著差异，其余均显著降低(表7)。
表8.各组大鼠粪无机磷排出量(mg/24h)(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
模型组和伪手术组相比，其粪无机磷排出量无显著差异。四给药组粪无机磷排出量与模型组相比均有显著增多(表8)。各组大鼠进食量之间均无显著差异(表9)。各组大鼠无机磷摄入量之间均无显著差异(表10)。
表9.各组大鼠进食量(g/24h)(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表10.各组大鼠无机磷摄入量(mg/24h)(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
实验结论枸橼酸铁明显增加肾衰大鼠粪磷排出量，减少尿磷排出量，而血清肌肝和尿素氮水平无明显改变，血清无机磷含量与正常大鼠相比也无明显差异。尿液肌酐水平和尿素氮水平无明显改变。
药代动力学研究枸橼酸铁通过在胃中与磷酸盐结合产生与铝盐类似的磷酸盐沉淀。在肠内不被吸收。枸橼酸铁是水溶性的，可溶性铁是可吸收的。对无机铁吸收的一个调整机制似乎存在于小肠粘膜细胞中。铁通过小肠快速吸收，十二指肠是铁吸收的最初地点。大多数进入到粘膜细胞中的铁不能转运到血浆中，而是残留在细胞中，当细胞脱落时排泄进入腹腔。
申请人利用大鼠所完成的动物研究显示，正常大鼠摄入枸橼酸铁4g/kg四周以后，血铁浓度有轻度上升(对照组1.26mg/ml、枸橼酸铁组2.10mg/ml)。动物实验已经确定枸橼酸铁是有效的磷酸盐结合剂。1g枸橼酸铁可与食物中40mg的磷酸盐结合，由于结合机理是简单的化学反应，申请人认为在人体中的枸橼酸铁具有同样的结合力。
急毒实验研究在预试基础上，取昆明小鼠70只(19～21g，雌雄各半)，禁食15小时后，随机分为7组，每组10只。用4％淀粉糊将枸橼酸铁配制成7种浓度的均匀混悬液，设置7个剂量组，浓度由高到低依次为10.00、8.00、6.40、5.12、4.10、3.28和2.62g/kg。按20ml/kg分别给予小鼠灌胃，即刻观察并记录给药后动物的活动、进食、皮肤、粘膜、粪便和死亡情况，并于给药后两周内至少每天观察一次。对死亡动物进行尸体解剖，观察各组织器官的变化情况。用Bliss法计算半数致死量。结果见下列各表表1各剂量组动物死亡数
用Bliss发计算半数致死量，LD50＝4.2821g/kg，95％可信限为3.7019-4.8935g/kg(见表2)。
表2小鼠口服枸橼酸铁急性毒性LD50计算表(Bliss法)
回归方程Y(Probit)＝0.53937 7.0617Log(D)半数致死量LD50＝4.2821g/kgLD50(Feiller校正)95％可信限＝3.7019-4.8935g/kgLD5＝2.5046g/kgLD95＝7.3214g/kg
小鼠口服枸橼酸铁的LD50为4.28g/kg，动物在给药后即刻无明显变化，约1小时后出现活动减少，状态萎靡，呼吸困难等反应。约1.5小时后开始出现死亡，死亡均发生在用药后24小时之内。死亡动物经解剖，各脏器未见明显异常。
长毒实验研究在小鼠饮水中加入0.12-0.06％枸橼酸铁的96周长期毒性实验结果表明，与对照组相比，枸橼酸铁组小鼠未发现任何明显的生理和病理学改变。枸橼酸铁也无致癌潜力。
实施例1氢氧化铁事先微粉化，过300目筛(中国标准筛，孔径0.050mm)，称取1当量，与含一个结晶水的枸橼酸1.05当量混合，加入4倍重量的纯化水，使之在60-65℃水浴中反应，保持搅拌，以避免沉积。由于枸橼酸溶解于水要吸热，两种反应物的混合不会有即时的激烈反应。
反应过程中注意补充水分，以维持反应溶液的量。反应过程中记录溶液中生成物(枸橼酸铁)的浓度和比重，反应70小时左右，生成物的浓度变化驱于恒定，反应完成。反应液在4000rpm下离心分离，除去悬浮微粒。分离出的清液在60℃加热蒸发除去水分。
将浓缩成的稠膏状流动物置于不会起化学反应的平板上摊开成薄层，60℃下烘干。
整个浓缩过程也可用减压干燥法直接在反应容器中加速完成。
所得干燥品呈紫褐色薄鳞片状，质地酥松，极易剥落，在摇晃中几乎能自动脱离容器或平板。将该粗品颗粒过10目筛，同时测定出其中枸橼酸根含量在105.3％。
上述粗品颗粒用95％乙醇在室温下(25℃)或更低的温度下浸泡2小时(按每10克用80毫升乙醇计)，将其中残留枸橼酸溶出。用中号滤纸或滤网过滤，或真空抽滤，得到的颗粒再次用乙醇洗脱，同样分离得到均匀发亮的紫褐色颗粒，测定其中枸橼酸根含量在100.3％，收率99.56％。
上述制备过程中枸橼酸铁含量利用可见光仪快速测定(可读枸橼酸铁浓度范围在0.1％-1.0％)取反应液置于离心试管中，在4000rpm下离心5分钟，准确量取澄清液用纯化水适当稀释，于可见光仪中405nm下读数，将该读取的数值与枸橼酸铁标准品的浓度曲线(1.0％-0.001％)比较，可得知反应液的相对浓度。
反应终点时，反应液的比重为1.13，亦可作为参考。测量方法是用标定的毛细管吸取6-7cm的溶液，拭净毛细管外壁，称重计算比重。
精制后的枸橼酸铁中枸橼酸根的含量测定方法先测定其中铁的含量(氧化还原法)，以铁的含量按1∶1的摩尔比计算出枸橼酸根应有的含量。
然后用液相色谱法测定枸橼酸根含量，以枸橼酸钠做外标物，测出枸橼酸根含量。
色谱条件为色谱柱ODS柱；流动相0.5％磷酸水溶液，用氨试液调节pH＝2.6；流速1ml/min；检测器uv@208nm。
实施例2实施例1合成的枸橼酸铁粗品用乙酸乙酯浸泡，按照每10克70毫升加入，以实施例1的方法精制处理2次，收率99.77％，精制后的枸橼酸铁中枸橼酸根含量在100.6％。
实施例3采用实施例1或2得到的药用级枸橼酸铁配制成如下制剂
1)溶液剂枸橼酸铁 30克苯甲酸钠 0.2克甜味剂适量香精 适量甘油 制成100毫升溶液2)糖浆剂用蔗糖与枸橼酸铁配伍，使蔗糖与枸橼酸铁都溶解于水中制成糖浆，然后加入其它辅剂枸橼酸铁 30克山梨酸0.3克蔗糖 66克香精 适量纯水 制成100毫升糖浆3)凝胶剂将枸橼酸铁与能形成凝胶的辅料制成均匀、混悬的稠厚液体或半固体制剂枸橼酸铁 30克苯甲酸钠 0.2克甜味剂适量香精 适量海藻酸钠 适量纯水 制成100克凝胶4)胶囊剂将枸橼酸铁及辅料或不加辅料填充于空心胶囊或软质囊材中制成枸橼酸铁 500克微晶纤维素 适量滑石粉 适量空心胶囊1000粒6)颗粒剂将枸橼酸铁与适宜的辅料制成具有一定粒度的干燥颗粒状制剂枸橼酸铁500克蔗糖适量聚乙二醇适量制成1000包7)片剂与适宜的辅料均匀混合，通过制剂技术压制而成的圆片状或异型片状的固体制剂枸橼酸铁 500g淀粉 130g羧甲基淀粉钠 26g3％羟丙甲纤维素适量硬脂酸镁 3.2g制成1000片8)散剂将枸橼酸铁粉碎并通过120目网筛成为细粉状枸橼酸铁 500g直接分装成0.5g/袋，共计1000袋。
权利要求
1.药用级枸橼酸铁制剂，其特征在于所述枸橼酸铁中所含有的枸橼酸根与铁的摩尔百分比在99-101％。
2.权利要求1所述的枸橼酸铁制剂，是对常规枸橼酸铁用极性有机溶剂精制而成，所述极性有机溶剂选自枸橼酸铁基本上不溶的溶剂。
3.权利要求2所述的枸橼酸铁制剂，其中，所述枸橼酸铁基本上不溶的极性有机溶剂选自2-6个碳的醇类、酮类、醚类和酯类。
4.权利要求3所述的枸橼酸铁制剂，其中，所述的有机溶剂包括乙醇、丙醇、乙二醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚或甲乙醚。
5.权利要求1或4所述的枸橼酸铁制剂，是对常规枸橼酸铁以95％的乙醇精制而成。
6.权利要求1-5中任一项所述的枸橼酸铁制剂的制备方法，包括使用极性有机溶剂对已合成出的枸橼酸铁进行浸泡以除去残留的枸橼酸和杂质的精制过程，所述极性有机溶剂选自枸橼酸铁基本上不溶的溶剂。
7.权利要求6所述的制备方法，所述枸橼酸铁基本上不溶的极性有机溶剂选自2-6个碳的醇类、酮类、醚类和酯类。
8.权利要求7所述的制备方法，所述精制过程是用95％乙醇在室温下对枸橼酸铁萃取一次以上，收集沉淀物。
9.权利要求6、7或8所述的制备方法，其还包括以氢氧化铁和枸橼酸为原料合成枸橼酸铁的过程，其中，枸橼酸和氢氧化铁的当量比大于1.0，反应温度60-70℃，合成产物在60℃以下烘干。
10.权利要求9所述的制备方法，合成枸橼酸铁时，氢氧化铁与枸橼酸的当量比在1∶1.0-1∶1.05，反应时间48-72小时。
11.一种治疗由于肾衰引起的高磷酸血症的药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1-5任一项所述的枸橼酸铁和药剂学上可接受的辅剂。
12.权利要求11所述的药物组合物，其中，所述治疗有效量的枸橼酸铁为单次剂量为500-3000毫克。
13.权利要求12所述的药物组合物，其中，所述治疗有效量的枸橼酸铁为单次剂量为大于1000毫克，但不超过2500毫克。
14.权利要求11-13任一项所述的药物组合物，其药物剂型包括溶液剂、糖浆剂、凝胶剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂和片剂。
全文摘要
本发明提供一种药用级的枸橼酸铁，枸橼酸铁中所含有的枸橼酸根与铁的摩尔百分比在99－101％。本发明提供的药用级枸橼酸铁是对常规枸橼酸铁用极性有机溶剂精制而成，所述极性有机溶剂选自枸橼酸铁基本上不溶的溶剂。本发明还提供了以枸橼酸铁作为活性成分，可用于治疗由于肾衰引起的高磷酸血症的药物组合物。
文档编号C07C51/41GK1446790SQ03104908
公开日2003年10月8日 申请日期2003年2月28日 优先权日2002年9月9日
发明者许振兴 申请人:苏荣仁
技术领域：
本发明涉及制药领域，涉及药用级枸橼酸铁制剂及其制备和精制方法。本发明还涉及以该药用级枸橼酸铁为有效成分的药物组合物，该药物化合物可治疗由于肾衰引起的高磷酸血症。
文献记载的合成枸橼酸铁的方法是以柠檬酸和氢氧化铁为原料，将柠檬酸加入氢氧化铁液中，以低于60℃的温度加热，蒸发至浆状，涂布于玻璃板上，低温干燥至形成小薄片，剥离即得。但是多年沿用下来的这种方法应该说有很大的随意性，只要求最终产品中以枸橼酸铁为主，对于制备过程的各条件参数没有非常明确的要求，所以这种常规的枸橼酸铁产品只能称为是粗制枸橼酸铁，呈紫褐色薄鳞片状，质地疏松，其中含有较多残留的枸橼酸，在使用时会影响到枸橼酸铁的质量和作用功效，同时也造成大量原料(枸橼酸)的浪费。该方法多年来也一直未有任何进展。
为了对上述常规的枸橼酸铁进行精制或提纯，业内曾有用大量水冲洗以除去尽量多杂质的方法在使用，但是枸橼酸铁在水中仍有一定的溶解度，大量水冲除会造成枸橼酸铁的流失外，还会因其部分溶解而增加损失，加上大量消耗水，导致整个过程成本高而起到的效果甚微。目前作为食品级和试剂级的枸橼酸铁，都是用该方法或类似方法进行的精制，经测定其中的枸橼酸根含量都在102％以上。
由于多年来枸橼酸铁都是应用在化工领域，其中枸橼酸根的含量也就没有被作为一个指标严格提出来。美国专利5753706中首次提出了枸橼酸铁可降低人体对磷酸盐的肠内吸收，因而可用于治疗由于肾衰引起的高磷酸血症。本发明将其全文引入作为参考。本申请人已经发现，过高的枸橼酸根含量(高于102％)会引起肾衰病人的代谢紊乱。所以，该美国专利的实施中一个很关键的问题是必须有可用于制药领域的枸橼酸铁产品。
总之，由于缺少一种有效的精制方法，制约了药用级枸橼酸铁制剂的工业化生产，也影响了枸橼酸铁在医药领域中的应用。
本发明还相应提出一种合成制备枸橼酸铁的方法，通过操作条件的具体化，在提高收率的同时缩短了反应时间，使枸橼酸铁的制备过程更加适应工业化的操作要求。
基于枸橼酸铁在治疗由于肾衰引起的高磷酸血症中的药物用途，本发明还提供了相应的药物组合物和药物剂型。
枸橼酸铁一般成红褐色透明薄片和棕色粉末，其水溶液成酸性，不易溶于冷水，但当水水温升高则会缓慢溶解，长久搅拌更增加溶解。另一方面，枸橼酸铁不溶于乙醇等一些短碳链的极性有机溶剂。本发明的申请人基于枸橼酸铁的性质，提出了一种不同于常规过程的精制方法，该精制过程包括使用极性有机溶剂对已合成出的枸橼酸铁进行浸泡以除去残留的枸橼酸和杂质，且所述极性有机溶剂选自枸橼酸铁基本上不溶的溶剂。
大量的实验结果证明，用有机溶剂处理枸橼酸铁，是一种有效的精制方法，可使产物中所含有的枸橼酸根与铁的摩尔百分比在99-101％，成为药用级的枸橼酸铁。
很显然，所述极性有机溶剂应该是选自枸橼酸铁基本上不溶的溶剂。本发明优选使用2-6个碳的醇类、酮类、醚类和酯类等溶剂，尤选可使用溶剂示例是乙醇、丙醇、乙二醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚或甲乙醚等。精制中，每1公斤枸橼酸铁可用7000-8000毫升左右的溶剂进行浸泡，精制后的枸橼酸铁收率可达到99％以上。
根据本发明优选的精制过程，是用95％乙醇在室温或低于室温的温度下对枸橼酸铁萃取一次以上，收集沉淀物，即得满足要求的药用级枸橼酸铁。
所述萃取，可以将枸橼酸铁浸泡在溶剂中1-2小时，使残余的枸橼酸溶解，然后过滤出固体，可以采用真空抽滤，对于滤出的颗粒再次用溶剂洗脱，所得固体为均匀发亮的紫褐色颗粒。
本发明在摸索获得药用枸橼酸铁的精制方法的同时，还尝试了以更科学有效的方法合成枸橼酸铁，配合精制操作，使整个制备过程更加科学合理，更适于工业化生产的推广。申请人经过了大量的实验和分析，发现，由于枸橼酸铁是一种带有结晶水的无定型结构的化合物，铁以络合的形式存在，一般为三价，在光及热的影响下会被还原成亚铁盐，使整个结构被破坏，因而有记载的枸橼酸铁的合成都是在低温，具体地是低于60℃下进行。本申请的发明人在对不同温度下的反应速率和产率的摸索实验中发现，温度对二者有影响，尤其是高温更有利于反应速率的提高。当反应温度在70℃，反应速率和产率与90℃下没有很大的差异，而60℃下的反应收率在88％左右，70℃下或高于70℃时的反应收率则可达到95％，反应时间的缩短更有利于防止产物受光和热影响而破坏。所以，本发明进一步提出了以氢氧化铁和枸橼酸为原料合成枸橼酸铁的过程，其中，枸橼酸和氢氧化铁的当量比大于1.0，反应温度60-70℃，合成产物在60℃以下烘干。
合成反应中通常都是要求枸橼酸过量，以有助于反应的进行，但是本发明人发现，当枸橼酸与氢氧化铁的当量比大于1.05时，尽管反应初期对反应有所帮助，但是产物的粘性较大，影响产品疏松结构的形成，使精制过程中的洗脱杂质发生困难。所以，根据本发明优选的方法，合成枸橼酸铁时，氢氧化铁与枸橼酸的当量比在1∶1.0-1∶1.05，反应时间48-72小时。具体操作中，可根据生产量来决定反应温度，例如，小量合成可控制70℃左右以加快反应，大批量合成由于搅拌不易，可降低至60℃或略高于60℃，适当延长反应时间。
根据本发明的另一个方面，还提出了一种治疗由于肾衰引起的高磷酸血症的药物组合物，其包括治疗有效量的上述药用级枸橼酸铁和药剂学上可接受的辅剂。
在动物试验的基础上，可以初步确定人体的耐受量，并结合药效研究(包括临床的单次给药耐受性试验和连续给药耐受性试验)得出在本发明的组合物中所述治疗有效量的枸橼酸铁是一般以单次剂量500-3000毫克计。优选地，所述药物组合物中枸橼酸铁的单次剂量为1000-2500毫克，更优选2000毫克。
本发明的药物组合物可以是例如溶液剂，所述药剂学上可接受的辅剂包括溶剂、防腐剂、矫味剂或调味剂；糖浆剂，所述药剂学上可接受的辅剂包括蔗糖、防腐剂、矫味剂或调味剂；凝胶剂，所述药剂学上可接受的辅剂包括胶凝剂、防腐剂、矫味剂或调味剂；胶囊剂；颗粒剂；散剂或片剂。
上述辅剂中，防腐剂可以是尼泊金、季铵盐、苯甲酸钠、山梨酸等。矫味剂可以包括甜味剂、香精、矫浆剂、泡腾剂等。胶凝剂例如甘油或丙二醇与纤维素衍生物、卡波姆、海藻酸盐、西黄耆胶、明胶、淀粉等。
当制成胶囊、颗粒剂、散剂或片剂时，可用的辅料均为药剂学上常规的物质，本发明没有特别要求。
本发明的实施提供了可用于制药工业的药用级枸橼酸铁，并可有助于使枸橼酸铁尤其是药用级枸橼酸铁的制备规范化，从而实现工业化生产。本发明同时也为利用枸橼酸铁作为有效成分制备用于治疗由于肾衰引起的高磷酸血症的药物提供了基础。药理学研究及结果主要药效学实验口服枸橼酸铁对慢性肾衰模型大鼠无机磷吸收与代谢的影响。
中国药品生物制品检定所药理室进行了枸橼酸铁对肾衰大鼠的主要药效学观察试验。通过测定慢性肾衰大鼠模型血清及尿液中磷、肌酐、尿素氮的浓度和粪便中磷的含量，以观察口服枸橼酸铁对慢性肾衰大鼠磷酸盐吸收与排泄的影响，进而评价其对肾衰所致高磷血症的治疗作用。
实验动物250g～300g的Wistar的大鼠；阳性对照药碳酸钙，分析纯；仪器日立产7060自动生化仪，肌酐、尿素氮、无机磷测定试剂盒，酶标仪；特制饲料在基础粉状饲料中分别加入不同药物粉末，搅拌均匀制成颗粒。伪手术组和模型组所食饲料含磷0.739％，碳酸钙组所食饲料含磷0.722％含碳酸钙2.33％，枸橼酸铁高剂量组所食饲料含磷0.704％，含枸橼酸铁4.76％；枸橼酸铁中剂量组所食饲料含磷0.721％，含枸橼酸铁2.44％；枸橼酸铁低剂量组所食饲料含磷0.730％，含枸橼酸铁1.23％。
实验方法将大鼠随机分为6组，分别为伪手术组、模型组、碳酸钙组、高剂量组、中剂量组和低剂量组，伪手术组10只，其余每组14只。除了伪手术组外，其余各组切除和结扎肾脏制造大鼠肾衰模型，术后观察两周，存活大鼠按照性别和体重重新随机分组，每组10只，动物饮用水为经灭菌的去离子水，收集术后第22、28、31、35、38天时的尿液和粪便，分别测定。同时取血，分离血清进行测定并记录进食量。放入代谢笼后开始给予大鼠上述特制饲料直至实验结束。
测定方法(1)血清生化指标的测定眼眶静脉取血，分离血清，用自动生化仪和试剂盒测定血清中肌酐、尿素氮、无机磷的含量；(2)尿液生化指标的测定用代谢笼收集大鼠24小时尿液，记录尿量，用自动生化仪和试剂盒测定血清中肌酐、尿素氮、无机磷的含量；(3)粪便无机磷含量测定用代谢笼收集大鼠24小时粪便，灰化，称重，称取一定重量置于离心管中，加入10％高氯酸，室温过夜，以提取无机磷，离心后取上清液，用自动生化仪和试剂盒进行测定，计算出无机磷的含量。
统计方法数值表示为均值±标准差；模型组与伪手术组之间以及四给药组与模型组之间进行组间t检验。
表1.各组大鼠血清肌苷含量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表2.各组大鼠血清尿素氮含量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表3.各组大鼠血清无机磷含量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表1～3显示，模型组和伪手术组相比，其血清肌苷和血清尿素氮水平于手术后16天有显著增高，而除个别时间外，四给药组与模型组相比均无显著差异(见表1～3)。
表4.各组大鼠尿肌酐含量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表5.各组大鼠尿尿素氮含量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表6.各组大鼠尿无机磷含量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表7.各组大鼠尿无机磷排出量(μmol/L)测定结果(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表4～7结果显示，模型组和伪手术组相比，其尿液中肌酐水平、尿素水平、无机磷水平和无机磷排出量于术后第28天时开始有显著降低。四给药组尿肌酐水平和尿素氮水平与模型组相比均无显著差异(表4、5)。四给药组尿无机磷水平与模型组相比部分有显著差异(表6)。四给药组尿无机磷排出量与模型组相比除第16天、第31天的低剂量组无显著差异，其余均显著降低(表7)。
表8.各组大鼠粪无机磷排出量(mg/24h)(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
模型组和伪手术组相比，其粪无机磷排出量无显著差异。四给药组粪无机磷排出量与模型组相比均有显著增多(表8)。各组大鼠进食量之间均无显著差异(表9)。各组大鼠无机磷摄入量之间均无显著差异(表10)。
表9.各组大鼠进食量(g/24h)(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
表10.各组大鼠无机磷摄入量(mg/24h)(n＝10)
*p＜0.05，**p＜0.01。
实验结论枸橼酸铁明显增加肾衰大鼠粪磷排出量，减少尿磷排出量，而血清肌肝和尿素氮水平无明显改变，血清无机磷含量与正常大鼠相比也无明显差异。尿液肌酐水平和尿素氮水平无明显改变。
药代动力学研究枸橼酸铁通过在胃中与磷酸盐结合产生与铝盐类似的磷酸盐沉淀。在肠内不被吸收。枸橼酸铁是水溶性的，可溶性铁是可吸收的。对无机铁吸收的一个调整机制似乎存在于小肠粘膜细胞中。铁通过小肠快速吸收，十二指肠是铁吸收的最初地点。大多数进入到粘膜细胞中的铁不能转运到血浆中，而是残留在细胞中，当细胞脱落时排泄进入腹腔。
申请人利用大鼠所完成的动物研究显示，正常大鼠摄入枸橼酸铁4g/kg四周以后，血铁浓度有轻度上升(对照组1.26mg/ml、枸橼酸铁组2.10mg/ml)。动物实验已经确定枸橼酸铁是有效的磷酸盐结合剂。1g枸橼酸铁可与食物中40mg的磷酸盐结合，由于结合机理是简单的化学反应，申请人认为在人体中的枸橼酸铁具有同样的结合力。
急毒实验研究在预试基础上，取昆明小鼠70只(19～21g，雌雄各半)，禁食15小时后，随机分为7组，每组10只。用4％淀粉糊将枸橼酸铁配制成7种浓度的均匀混悬液，设置7个剂量组，浓度由高到低依次为10.00、8.00、6.40、5.12、4.10、3.28和2.62g/kg。按20ml/kg分别给予小鼠灌胃，即刻观察并记录给药后动物的活动、进食、皮肤、粘膜、粪便和死亡情况，并于给药后两周内至少每天观察一次。对死亡动物进行尸体解剖，观察各组织器官的变化情况。用Bliss法计算半数致死量。结果见下列各表表1各剂量组动物死亡数
用Bliss发计算半数致死量，LD50＝4.2821g/kg，95％可信限为3.7019-4.8935g/kg(见表2)。
表2小鼠口服枸橼酸铁急性毒性LD50计算表(Bliss法)
回归方程Y(Probit)＝0.53937 7.0617Log(D)半数致死量LD50＝4.2821g/kgLD50(Feiller校正)95％可信限＝3.7019-4.8935g/kgLD5＝2.5046g/kgLD95＝7.3214g/kg
小鼠口服枸橼酸铁的LD50为4.28g/kg，动物在给药后即刻无明显变化，约1小时后出现活动减少，状态萎靡，呼吸困难等反应。约1.5小时后开始出现死亡，死亡均发生在用药后24小时之内。死亡动物经解剖，各脏器未见明显异常。
长毒实验研究在小鼠饮水中加入0.12-0.06％枸橼酸铁的96周长期毒性实验结果表明，与对照组相比，枸橼酸铁组小鼠未发现任何明显的生理和病理学改变。枸橼酸铁也无致癌潜力。
实施例1氢氧化铁事先微粉化，过300目筛(中国标准筛，孔径0.050mm)，称取1当量，与含一个结晶水的枸橼酸1.05当量混合，加入4倍重量的纯化水，使之在60-65℃水浴中反应，保持搅拌，以避免沉积。由于枸橼酸溶解于水要吸热，两种反应物的混合不会有即时的激烈反应。
反应过程中注意补充水分，以维持反应溶液的量。反应过程中记录溶液中生成物(枸橼酸铁)的浓度和比重，反应70小时左右，生成物的浓度变化驱于恒定，反应完成。反应液在4000rpm下离心分离，除去悬浮微粒。分离出的清液在60℃加热蒸发除去水分。
将浓缩成的稠膏状流动物置于不会起化学反应的平板上摊开成薄层，60℃下烘干。
整个浓缩过程也可用减压干燥法直接在反应容器中加速完成。
所得干燥品呈紫褐色薄鳞片状，质地酥松，极易剥落，在摇晃中几乎能自动脱离容器或平板。将该粗品颗粒过10目筛，同时测定出其中枸橼酸根含量在105.3％。
上述粗品颗粒用95％乙醇在室温下(25℃)或更低的温度下浸泡2小时(按每10克用80毫升乙醇计)，将其中残留枸橼酸溶出。用中号滤纸或滤网过滤，或真空抽滤，得到的颗粒再次用乙醇洗脱，同样分离得到均匀发亮的紫褐色颗粒，测定其中枸橼酸根含量在100.3％，收率99.56％。
上述制备过程中枸橼酸铁含量利用可见光仪快速测定(可读枸橼酸铁浓度范围在0.1％-1.0％)取反应液置于离心试管中，在4000rpm下离心5分钟，准确量取澄清液用纯化水适当稀释，于可见光仪中405nm下读数，将该读取的数值与枸橼酸铁标准品的浓度曲线(1.0％-0.001％)比较，可得知反应液的相对浓度。
反应终点时，反应液的比重为1.13，亦可作为参考。测量方法是用标定的毛细管吸取6-7cm的溶液，拭净毛细管外壁，称重计算比重。
精制后的枸橼酸铁中枸橼酸根的含量测定方法先测定其中铁的含量(氧化还原法)，以铁的含量按1∶1的摩尔比计算出枸橼酸根应有的含量。
然后用液相色谱法测定枸橼酸根含量，以枸橼酸钠做外标物，测出枸橼酸根含量。
色谱条件为色谱柱ODS柱；流动相0.5％磷酸水溶液，用氨试液调节pH＝2.6；流速1ml/min；检测器uv@208nm。
实施例2实施例1合成的枸橼酸铁粗品用乙酸乙酯浸泡，按照每10克70毫升加入，以实施例1的方法精制处理2次，收率99.77％，精制后的枸橼酸铁中枸橼酸根含量在100.6％。
实施例3采用实施例1或2得到的药用级枸橼酸铁配制成如下制剂
1)溶液剂枸橼酸铁 30克苯甲酸钠 0.2克甜味剂适量香精 适量甘油 制成100毫升溶液2)糖浆剂用蔗糖与枸橼酸铁配伍，使蔗糖与枸橼酸铁都溶解于水中制成糖浆，然后加入其它辅剂枸橼酸铁 30克山梨酸0.3克蔗糖 66克香精 适量纯水 制成100毫升糖浆3)凝胶剂将枸橼酸铁与能形成凝胶的辅料制成均匀、混悬的稠厚液体或半固体制剂枸橼酸铁 30克苯甲酸钠 0.2克甜味剂适量香精 适量海藻酸钠 适量纯水 制成100克凝胶4)胶囊剂将枸橼酸铁及辅料或不加辅料填充于空心胶囊或软质囊材中制成枸橼酸铁 500克微晶纤维素 适量滑石粉 适量空心胶囊1000粒6)颗粒剂将枸橼酸铁与适宜的辅料制成具有一定粒度的干燥颗粒状制剂枸橼酸铁500克蔗糖适量聚乙二醇适量制成1000包7)片剂与适宜的辅料均匀混合，通过制剂技术压制而成的圆片状或异型片状的固体制剂枸橼酸铁 500g淀粉 130g羧甲基淀粉钠 26g3％羟丙甲纤维素适量硬脂酸镁 3.2g制成1000片8)散剂将枸橼酸铁粉碎并通过120目网筛成为细粉状枸橼酸铁 500g直接分装成0.5g/袋，共计1000袋。
权利要求
1.药用级枸橼酸铁制剂，其特征在于所述枸橼酸铁中所含有的枸橼酸根与铁的摩尔百分比在99-101％。
2.权利要求1所述的枸橼酸铁制剂，是对常规枸橼酸铁用极性有机溶剂精制而成，所述极性有机溶剂选自枸橼酸铁基本上不溶的溶剂。
3.权利要求2所述的枸橼酸铁制剂，其中，所述枸橼酸铁基本上不溶的极性有机溶剂选自2-6个碳的醇类、酮类、醚类和酯类。
4.权利要求3所述的枸橼酸铁制剂，其中，所述的有机溶剂包括乙醇、丙醇、乙二醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚或甲乙醚。
5.权利要求1或4所述的枸橼酸铁制剂，是对常规枸橼酸铁以95％的乙醇精制而成。
6.权利要求1-5中任一项所述的枸橼酸铁制剂的制备方法，包括使用极性有机溶剂对已合成出的枸橼酸铁进行浸泡以除去残留的枸橼酸和杂质的精制过程，所述极性有机溶剂选自枸橼酸铁基本上不溶的溶剂。
7.权利要求6所述的制备方法，所述枸橼酸铁基本上不溶的极性有机溶剂选自2-6个碳的醇类、酮类、醚类和酯类。
8.权利要求7所述的制备方法，所述精制过程是用95％乙醇在室温下对枸橼酸铁萃取一次以上，收集沉淀物。
9.权利要求6、7或8所述的制备方法，其还包括以氢氧化铁和枸橼酸为原料合成枸橼酸铁的过程，其中，枸橼酸和氢氧化铁的当量比大于1.0，反应温度60-70℃，合成产物在60℃以下烘干。
10.权利要求9所述的制备方法，合成枸橼酸铁时，氢氧化铁与枸橼酸的当量比在1∶1.0-1∶1.05，反应时间48-72小时。
11.一种治疗由于肾衰引起的高磷酸血症的药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1-5任一项所述的枸橼酸铁和药剂学上可接受的辅剂。
12.权利要求11所述的药物组合物，其中，所述治疗有效量的枸橼酸铁为单次剂量为500-3000毫克。
13.权利要求12所述的药物组合物，其中，所述治疗有效量的枸橼酸铁为单次剂量为大于1000毫克，但不超过2500毫克。
14.权利要求11-13任一项所述的药物组合物，其药物剂型包括溶液剂、糖浆剂、凝胶剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂和片剂。
全文摘要
本发明提供一种药用级的枸橼酸铁，枸橼酸铁中所含有的枸橼酸根与铁的摩尔百分比在99－101％。本发明提供的药用级枸橼酸铁是对常规枸橼酸铁用极性有机溶剂精制而成，所述极性有机溶剂选自枸橼酸铁基本上不溶的溶剂。本发明还提供了以枸橼酸铁作为活性成分，可用于治疗由于肾衰引起的高磷酸血症的药物组合物。
文档编号C07C51/41GK1446790SQ03104908
公开日2003年10月8日 申请日期2003年2月28日 优先权日2002年9月9日
发明者许振兴 申请人:苏荣仁
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