专利名称：制备抗菌素a-21978c复合物或因子的方法
技术领域：
本发明是有关分子式为(Ⅰ)的A-21978环状肽抗菌素衍生物的经过改进的制备方法，其中R是C2-C14的链烷酰基。特别是这
种经过改进的方法包括了在发酵时把2个碳原子到14个碳原子的链烷酸提供给产生A-21978C的培养物。这个方法的优点是(1)、生产步骤较原有的方法少，(2)、产量提高，(3)、须要的时间少。
这种A-21978C系列抗菌素是很好的抗菌药物，A-21978 C的诸多衍生物中，具有分子式(Ⅰ)的一组尤为重要，(也可参见专利号为4，537，717的美国专利.Bernard.J.Abbott，David S Fukuda and Manuel Debono.)。过去，这些衍生物的制备需要某种多级步骤，该多级步骤费时间，产量低，而且价格昂贵。而本发明则提供了制备这些A-21978C衍生物的一种经过改进的方法。原有的制备一种分子为(Ⅰ)的衍生物的方法，例如制备A-21978C的正-癸酰基衍生物，需要下列步骤1、产生A-21978C培养的发酵过程a、用一种液体氮安瓿开始。
b、初级接种步骤(48小时)。
c、二级接种步骤(24小时)。
d、三级接种步骤(24小时)。
e、发酵(140小时)。
2、过滤，树脂吸附和洗脱，及浓缩3、制备t-BOC复合物(即被保护的叔丁氧基羰基)4、对被保护的复合物进行浓缩5、脱酰基培养物的发酵，如使用游动放线菌属(Actinoplanes utahensis)a、用一种液体氮安瓿开始。
b、初级接种步骤(72小时)。
c、二级接种步骤(48小时)。
d、发酵(67小时)。
6、带有脱酰基培养物的复合物的脱酰基作用。
7、过滤，树脂吸附及洗脱，浓缩。
8、再酰化作用。
9、保护基团的水解。
10、最后进行纯化。
本发明的新的方法包括了在发酵生产步骤中(步骤1的e)，把一种具有2个碳原子到14个碳原子的链烷酸(一种ROH化合物，其中，R如同上述规定)，或者它们的一种酯或者盐，加入到产生A-21978C培养物中，以得到与分子式(Ⅰ)相对应的化合物，使用这个方法，就可以省去原方法中的3，4，5，6，7，8和9的步骤，此外，这种新的方法可以明显的提高产量，其所得到的产量大大超过了使用原有方法所获得的收率。
Streptomyces roseosporus菌种A-21978.6(CCTCC No.85-006)及其突变体菌种A-21978.65(CCTCC No.85-007)是产生A-21978C培养物的有用的菌种。这两个菌种已于1985年10月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。其中S.roseosporus A-21978.6培养物和A-21978C抗菌素的生产使用条件，已经由Robert L.Hamill和Marvin M.Hoehen在美国专利(US 4331594)中进行了说明，该专利文件也作为本文的参考文献。
虽然在本发明的方法中，所指定了的A-21978.6和A-21978.65是较好的微生物菌种，但是任何生产A-21978C的培养物都可以使用。本技术领域中的技术熟练的人们会了解哪种菌种会对本方法有用。
在美国专利US4，331，594所介绍的天然产生的A-21978C因子是C0，C1，C2，C3，C4和C5。在C1，C2，C3，C4，C5的众因子中，在式(Ⅰ)中的R是一种特殊的10个碳原子到12个碳原子的烷酰基，A-21978C因子C0，很容易想到，它是一种具有单一支链化的，有10个碳原子的烷酰基侧链，已经发现，它们是二种组份的混合物，二种组份大致的比例为2∶1，其中，主要的组份是带有10个碳原子的以支链作为侧链的组份，较少的组份是具有10个碳原子的以直链作为侧链的组份。
为了便于讨论，使用本发明的方法而制备的分子式为(Ⅰ)的化合物，也称作A-21978C因子，除了天然产生的因子外，通常用侧链的长度表示因子。从而，例如，分子式为(Ⅰ)的化合物，其中R＝辛酰基，当使用本发明的方法进行制备时，则被称作一种A-21978C3因子。
在本发明的方法中，所用的2个碳原子到14个碳原子的链烷酸，酯或盐，(基质，The aubstrate)可以是直链，也可以是支链化合物，例如，为了制备天然产生的A-21978C的因子C1，C2，C3，可以使用一种8-甲基正十二烷酸，10-甲基正十二烷酸，或者10-甲基十一烷酸，酯或者盐，由于2个碳原子到14个碳原子的直链酸，酯或盐容易得到，成本低，因此推荐使用于本方法中，特别好的基质，(Substrate)是正-十二烷酸，它的酯或者盐。
当使用2个碳原子到14个碳原子的链烷酸酯时，推荐使用C1-C4的烷基酯，在这样一种酯中，1个碳原子到4个碳原子的烷基可以是直链，或者是支链。
在这个方法中，所使用的典型的2个碳原子到14个碳原子的链烷酸的适宜的盐，包括了链烷酸与碱金属或者碱土金属所形成的盐，例如钠，钾，锂，铯，钕，钡，钙或镁。合适的胺盐包括1个碳原子到4个碳原的伯，仲，叔烷基铵盐和羟基-C2-C4-烷基铵盐。
这种酶作用物(Substiate)，最好是以无菌液的形式加入到发酵过程中，用在这种方法的溶剂，虽然可以使用乙醇，醋酸乙酯，和1个碳原子到4个碳原子的不饱和脂肪酸的酯，但是特别有用的溶剂是油酸甲酯，如果，这种基质，(The substrate)，在发酵温度下，是一种适当的液体，则可以直接把这种基质(substrate)加入其中。
这种基质(substrate)的加入速率必须是够低，以避免发酵中产生中毒作用，不过加入速率高，则可足以提高所希望得到的分子式为(Ⅰ)的化合物的产量。每小时对每升发酵液建议其加入速率大约为0.1到0.2毫升。
在发酵生产步骤时，这种基质(Sustrate)是生产A-21978C培养物正处于生长阶段时而被加入其中的，从大约在15小时到32个小时才开始加入，并继续加入，直至发酵作用终止。这种基质(Substrate)的加入方式可以是以各种不同的方法而加入，但最好的加入方式是能通过某种能更接近于稳定流动状态的方式而加入。
接着，进行发酵，如果需要，则可以用已知的工艺步骤来回收所产生的分子式(Ⅰ)的化合物(也见美国专利US4，331，594)本发明也提供了上面已经提到的新型微生物，Streptomyces(链霉素)Roseosporus NRRL15998，这种微生物也能产生A-21978C抗菌素。本发明特别涉及到一种经过改进的，用于生产A-21978C抗菌素的方法，这种方法是通过在液内需氧发酵的条件下，通过培养新型的Steptomyces roseosporus，NRRL15998的菌种，直至产生出基本上达到A-21978C抗菌素的水准。该A-21978C的抗菌素复合物可以用极性有机溶剂从发酵液和菌丝体中萃取出来，这种A-21978C的各个因子也可以用本领域中人所共知的技术如柱上色谱分析法来进一步纯化。
一般，从天然状态中分离出来的培养物(称野生型“The Wild type”)，用来生产的抗菌素，其产量低，抗菌素的生产常常是不稳定的。因此，使用高效的菌种来不断地生产抗菌素是有很大的价值的。
本发明的目的是提供某种经过很大改进的用来制备A-21978C抗菌素的方法，该方法是通过培养Streptomyces(链霉素)roseosporus NRRL15998，或者通过培养某种A-21978C产生的突变体，变异体，或者它们的重组体，在一种培养物培养基中，该培养物培养基包括可同化源碳源，氮和无机盐，在液内需氧发酵的条件下，直至生产出A-21978C的抗菌素。这种A-21978C抗菌素复合物，或者它的各个单独的因子，可以使用本领域已知的不同的分离和纯化步骤来加以回收。
本发明的这一部份的微生物，已经被称为A-21978.65。这个菌种是通过菌种选择和从已经被定名为A-21978.6的菌种(NRRL 11379)中发生突变作用而培育出来的。Frederick P.Mertz和Ralph.E.Ka the(Lilly研究实验室)已经对这种A-21978.6菌种进行了研究和鉴定。该A-21978.6是从土耳其的亚拉拉特山的土块中选择出母体菌种而周转培育出来的这种A-21978.6菌种被下列人员即Falcaode Morias和Dalia Maria等人于1961年，被作为新的菌种而归类于Streptomyces(链霉素)Roseosporus。这种分类是与已经出版的出版物所叙述的内容相比较而作出的〔即R.E.Buchanan和N.E.Gibbons的“Bergey的细菌学测定手册”William和wilkins公司8th.Ed.，1974;和E.B.Shirling及D.Gottlieb，的“链霉菌素类菌种的共同说明”intern.Journal oF Systematic Bacteriol 808-809(1972)〕。
这种分类是以国际链霉素项目所推荐的方法〔E.B.Shirling和D.Gottieb.“链霉菌素种的
定方法”，在Intern.Journal of Systematic Bactriol.16，313-340(1966)〕，以及相关的辅助实验作为基础而作出的。
在ISP9＃基础培养基上，决定碳的使用的量，在该基础培养基中，所加入的碳源，其最终达到的浓度是1.0%。碳源通过过滤作用而达到无菌，这种基础培养基是用高压灭菌作用而达到无菌。基片在30℃，经过14天的接种过程之后，可以被辨认出来。
其细胞壁结晶，可以利用改进的Lechevalier的方法来加以测定，(M.P.Lechevalier，“关于分离放线菌素到属的化学方法”。由美国微生物放线菌委员会小组专门小组主办。由Dr.Thomas G.pridham，Convenor;在下列部门举行，即微生物研究所，Rutgers大学及在美国的新泽西州，新布鲁诺兹友市，新泽西的州立大学，1971年)。
二氨基庚二酸的异构物是利用Becker等人的方法来进行测定，〔B.Becker，et.al，“利用整个细胞水解的纸上色谱方法快速区分诺卡氏菌(Norcardia)和链霉素菌(Streptomyces)”。AppL.Microbiol 11，421-423(1964)〕。
分析氨基酸是利用洗涤细胞壁断裂物的方法来进行，类黑色素的测定是利用ISP1＃(胰蛋白-酵母菌提取物培养物)，ISP6＃(胨-酵母菌提取物，铁琼脂)，ISP7＃(酪氨酸琼脂)，改进的ISP7＃(即ISP7＃不含有酪氨酸)，及某种酪氨酸鉴定〔Yuzuru Mikami，et，al的“改进的链霉素Arai和Mikani黑色素形成试验”，发表于Intern.journal of Systematic Bactrsiol.27(3)，290(1977)〕。测定淀粉水解物是使用淀粉与碘的实验方法来进行。
利用ISP2＃琼脂培养基，来进行温度范围，耐Nacl性质，PH范围，和抗菌素敏感性的试验。其温度范围是25，28，30，34，37，40，45，50和55℃。抗Nacl性质是利用把Nacl加入到琼脂中来进行测定。其用量相当于0，1，2，3，4，5，6，8，10和12%。这些都是在30℃温度下进行培养。测定PH范围是调节琼脂使其PH值从3.0到11.0，按每次以1.0的PH单位而递增，正好在下一次调节PH之前来进行测定。抗菌素敏感性试验，是使用将敏感性的磁盘垫在已接种的琼脂板上的方法来进行测定的。
其颜色的确定可以按照Iscc-NBS方法(K.L.Kelly和D.B.judd。的“The Iscc-NBS颜色标志方法和颜色名称字典”来进行。U.S.Department of Commerce Circ.553，Washington，D.C，1955)。
圆括号中的数字表示Tresner和Baekus的颜色系列，〔H.D.Trenser和E.j.Backus.的“关于链霉菌素分类学的色轮系统”，AppL Microbiol.11 335-338(1956年)〕。其色片标志可以用在其下部划一横线来加以标志。其Maerz和paul颜色组可以用括号括出。(A.Maerz和M.R.paul“颜色字典”，McGraw-Hill Book Company.Inc.New york.N.Y.1950)形态(Morphology)A-21978.6培养物的形态包括孢囊柱，该孢囊柱是属于Rectus-Flexibilis(RF)分类，孢子的每段链长大于10个孢子(Spore)，孢子的表面柔软。
A-21978.6培养物是以基本上产生稀薄的红色的孢子群颜色而作为特征的，并具有微淡红色-棕色互相交变的颜色。也存在有微棕色的水溶性的色素。在14种琼脂板培养基中，有三种显示这种特性，这三种培养基(ISP 2＃，7＃，TPO)，被认为是由空气和营养物而大量生长的一类培养基。
有二种琼脂板培养基，即ISP4＃和葡萄糖一天门冬酰胺琼脂，产生出一种由白到灰的稀薄的孢子群颜色，并具有交变的黄色，没有观测到其中有水溶性的色素，这二种培养基被认为是较好的培养基，但得到的数量不多，它们是通过空气和营养物而生长。
也利用另外的九种琼脂板培养基，但是它们仅有少量产生，或者不生长，和不形成芽孢。气生的颜色存在时，虽然很少，不过这种气生的颜色都属于由白到灰的颜色系列。
类黑色素色素也不存在，主要是由细胞壁而组成，它们是LL-二氨基庚二酸，甘氨酸，葡萄糖和核糖。这些都用类型l细胞壁和类型C糖型来表示(R.E.Buchanan和N.E.Gibbon，Eds，“Becgey的细菌学测定手册”，William & Wilkins Compauy.8fh.Edition 1974.P.658)下列五种培养物是与A-21978.6相比较的实验室试验Streptomyces(链霉素)AlbovinaceousISP 5136;ATcc 15833Streptomyces(链霉素)CandidusISp 5141;ATcc 19891Streptomyces(链霉素)moderatusISp 5529;ATcc 23443Streptomyces roseosporus(链霉素) ISp 5122;ATcc 23958Streptomyces(链霉素)SetoniiISp 5395;ATcc 25497这些培养物属于白色和红色颜色系列，具有RF型孢囊柱形态，具有光滑的孢子表面，按照Isp的说明的，是属于类黑色素负性，没有明显的交替颜色和水溶性色素。这些特征，与碳利用型和其它的第二级特征相结合，都与A-21978.6的培养物相符合。
在实验室的条件下，这些培养物与A-21978.6相比较时，有四种培养物不合乎要求。S.Candidus和S.Setonii在很多培养基中，表现出气生的黄色孢子群颜色，S.Albovinaceous和S.Moderatus表现出明显的暗的交变的颜色;水溶性色素，并产生出了类黑色素，所有这些，都与A-21978.6的培养物不同。由ISp，表明S.moderatus是属于红棕或强烈的棕色交变颜色，而不属于S.Albovinaceous一类的特征。这二种培养基都不能列入黑色素类型。
因而，Falcao de Morias和Dalia Maia于1961年把A-21978.6培养物分类于Streptomyces(链霉素)roseosporus菌种。这种分类是以与出版物说明的内容相比较，及直接在实验室进行比较作为基础而得到的，下列列出的培养物的特性即概括了直接比较的研究内容。
培养特性形态(Morphology)A21978.6 S.roseosporus观测到孢囊柱直接呈现弯曲形(属于RF)，没有观测到钩形，环形和螺形，孢子链长＞10。用电子显微镜观测到孢子的表面光滑孢子伸长至椭圆 伸长到圆筒形平均0.85×1.78μM 1.01×2.47μM范围0.65-0.97 0.97-1.3×1.63×0.97-2.6μM -3.25μM所含有的培养物的特性
A-21978.6菌种的某些特性不同于已知的S.roseosporus。A-21978.6培养物在孢子大小，葫萝卜和马铃薯柱的生长，防Nacl的性质，和在硝酸盐的还原作用等性质方面都和已经公开的菌种不同。
本发明中的A-21978.65菌种具有与A-21978.6的菌种同样的特性。但是，不同之处在于所生产的A-21978C的抗菌素的总量不同。较早的菌种，每毫升发酵基中所产生的A-21978 C抗菌素，最好的也没有超过100mcg。而本发明的经过改进的A-21978.65的菌种，在罐发酵中所得到的量至少是上述数量的2.5倍，而在振荡瓶中的发酵中，已经得到18倍于上述数量的产量。具有这种提高产量的A-21978C所产生的特征是，使这种新的菌种能对要得到的各种抗菌素的生产在方法上作出巨大的改进。
和其它的有机体一样，本发明产生的新的A-21978C培养基Streptomyces(链霉素)roseoporus NRRL15998，易发生变异。NRRL15998菌种的重组体，变异体和突变体，可以用已知的，不同的诱变原进行处理而得到，例如，紫外线，X-射线，高频波，放射线和化学品等。天然的和经过诱导而得到的Streptomyces(链霉素)roseosporus NRRL15998的突变体，变异体和重组体，只要保留了产生A-21978C抗菌素的特性，产量也高，则它们也可以用在本发明中。
用于Streptomyces roseoporus NRRL15998菌种生长的培养基，可以是培养液中的任何一种培养基。例如，可以使用葡萄糖，果糖，半乳糖，麦芽糖，甘露糖，棉子油，油酸甲酯，甘油，精制大豆油等，然而，就生产的经济性，最佳产率和容易离析等方面来说，在大范围的发酵过程中，一种最好的碳源却是木薯糊精。
关于氮源，虽然可以利用可溶性的肉胨，大豆粉，大豆水解产物，大豆渣，酵母，氨基酸类像L-天门冬酰氨和DL-亮氨酸等，但是一种较好的氮源是一种水解酪蛋白酶。
可以与培养基配合使用的无机盐营养物，是可以形成钾，铵，氯化物，硫酸盐，硝酸钾盐等离子的可溶性的盐，其中，K2SO4在抗菌素生产中最有用，糖蜜灰，灰渗析液，和合成的无机混合物等也有用。
生产A-21978C抗菌素时，在其发酵培养基中最好使用蒸馏水或者去离子水，在自来水中，如果存在如钙和碳酸盐等无机物，则会对抗菌素的生产起阻碍作用。
用于微生物的生长发育所必须的基本微量元素也应该包括在菌种培养基中。这种微量元素一般是在其它培养基的结构中，作为不纯物而存在的，其含量足以满足微生物生长所需要的量。
如果在大范围发酵过程中，发泡作用影响发酵，则必须加入某种少量防泡剂(用量为0.2毫升/每升)如加入聚丙烯乙二醇到发酵培养基中。
大量生产A-21978C抗菌素，最好在罐内进行，用液内需氧发酵方法。不过，也可以用震动-摇瓶培养法来得到少量的A-21978C抗菌素。
由于在微生物的生产中，其时间滞后通常与大罐的接种，及微生物的孢子形式有关系，因此，最好是利用某种营养接种物。这种营养接种物是利用孢子形式，或者微生物的菌丝体的断片来接种某种小量的培养物培养基，以得到某种新鲜的、有活性的，微生物菌种生长培养物，然后再把这种营养物移植到一种大罐中。
这种新产生的A-21978C的微生物，可以在温度为20℃和40℃之间的温度进行生长培育。A-21978C的生长的最适宜的条件为在温度30℃到32℃为好。
通常，在液内需氧培养的方法中，无菌空气被通过培养物培养基而扩散。为了有效的生产A-21978C的抗菌素，在罐内生产所用的饱和空气的百分含量应该高于20%，最好是高于30%(温度为30℃和压力为1个大气压)罐内发酵，最好保持发酵培养基的PH范围在大约6.5-7.0。这可以通过加入适当量的如氢氧化钠(在开始步骤)和加入盐酸(在最后步骤)而作到这一点。
A-21978C抗菌素产品能在发酵期间，通过测定液体培养液或菌丝体固体提取物样品，用已知对抗菌素过敏的有机体作对比，来测定抗菌素的活度。在测定这些抗菌素时，一种常用的鉴定有机体是黄球菌(Micrococcus Luteus)。生物鉴定是通过纸盘在琼脂板上来完成的。
另外，培养物固体，包括培养基成分和使用没被提取或分离的菌丝体，但最好是去除水份后，选择来作为A-21978 C抗菌素的来源。例如，在A-21978 C活性抗菌素的生产之后，培养基能用在真空中的冷冻状态下蒸发水份的方法来干燥，混合后直接进入供给预混合料中。
结构式Ⅰ的化合物是的抗菌素剂。
为了很完全地说明本发明的操作，下面提供了未加限制的例子。
例一A-21978C 复合物的生产在液氨的汽化相中制备和保存一种原种培养物。Streptomy-ces roseosporus NRRL15998，在液氨的汽化相中予先给以保存，然后使用50毫升的下列组合物的营养培养基进行接种。
成分 数量(%)胰蛋白酶大豆液体培养基〔Tryptlcase 3.0soy Broth＊〕糊精 2.5水(去离子) 94.5＊Baltimore生物实验室，Cockeysville MD接种后的培养基放在一个250毫升的锥形瓶中，该烧瓶放在一个二英寸的拱形板的旋转振荡器上，转速为250转/分钟，于30℃培养48小时。然后将成熟的营养培养物分散到多个(0.5毫升)的容器中，并在液氨的汽化相中储藏。
为了提供大量均匀的供应储存物品，用在液氨中1毫升的培养储存物接种到80毫升的上面所讨论的营养培养基上，把接种后的营养培养基放一个250毫升的锥形瓶中，该烧瓶放在一个二英寸的拱形板的旋转振荡器上，转速为250转/分钟，于30℃培养48小时。
用10毫升的这种培养物来接种到450毫升的有如上面所描述的第一阶段营养培养基相同组成的第二阶段营养生长培养基上。第二阶段的培养基放在一个2升的锥形烧瓶中，该烧瓶放在一个2英寸的拱形板的旋转振荡器上，转速为250转/分钟，于30℃，培育24小时。
使用1升的第二阶段的营养培养物接种到39升的有下列成分的无菌的第三个接种物生长培养基上成分 数量(%)大豆蛋白粉〔Soybcan Flowr〕 0.5酵母萃取物a0.5葡糖酸钙 1.0Kclb0.02MgSO4.7H2Ob0.02FeSO4.7H2Ob0.0004Sag471〔防泡〕 0.03水 97.9296a、Difco实验室，Detroit MIb、如下面方法来制备微量无机物将FeSO4.7H2O(7.6克)溶解在经浓缩的Hcl(76毫升)，然后加入MgSO4.7H2O(380克)，Kcl(380克)和去离子的水使总体积为3800毫升，为了提供满意的无机物，使用每39升的第三个接种物生长阶段的80毫升的溶液。
c、Union Carbide，Danbury CT接种后的培养基在一个不锈钢容器中于30℃培育24小时，容器中以0.85V/V/m的速度充以无菌空气，并用常规的搅拌器搅拌，转速为350～450转/分钟，容器中的压力保持在5泊斯卡(PSIG)。
使用1升的培育后的第三个接种体阶段产物来接种到有下列组成的119升的无菌产品培养基上
成分 数量(%)大豆蛋白粉〔Soybean Flour〕 2.2Fe(NH4)2SO4.6H2O 0.066葡萄糖 0.825Sag471 0.022土豆糊精 3.3糖浆(乳化黑色油) 0.275自来水 93.312在加入第一、二种成分之后，将PH调节到7.0，接着加入所有的成分，立刻消毒灭菌一段时间。
接种后的产品培养基在一个不锈钢容器中，于30℃并以0.5V/V/m的速度充以无菌容气，培养6天。培养基用常规的搅拌器搅拌，在速度为250转/分钟时，搅拌0～15小时，和在速度350转/分钟时，搅拌15小时，加入氢氧化胺(NH3.H2O)来保持PH值等于或超过6.5。在发酵结束时，A-21978C复合物的产量是每升发酵液体培养液为0.282克，因子分析如表一所描述的。
例2增加 A-21978C8的产量进行如例1所描述的第一，第二，第三生长步骤。最初的生产步骤除列1描述的之外，开始时含有50%V/V辛酸(C7H15COOH)和甲基油酸盐的无菌溶液以每小时每升发酵液体培养液0.13毫升的速率供给发酵体28小时，以这个速度，经144小时直到发酵结束。A-21978C复合物的产量是每升液体培养液1.255克，比例1获得的产量增加445%。因子A-21978C8〔结构式Ⅰ的化合物，其中R是辛(酰)基〕代表用这个方法制备出的总的A-21978C合成物的9%。在用例1的方法制备出的A-21978C复合物中没有测出有A-21978C8。
例3增加A-21978C9的产量进行如例1所描述的第一，第二和第三步培养生长步骤，最初的生产步骤除例1描述的之外，开始时含有25%V/V壬酸和75%甲基油酸盐以每小时每升发酵液体培养液0.13毫升的速率供给发酵体28小时，以这个速度时，经144小时直到发酵结束。A-21978C合成物的产量是每升液体培养液肉汤0.821克，超过例1获得的产量293%。因子A-21978 C9〔结构式IR是壬酰基(CH3(CH2)7CO-)〕代表用这个方法制备出的总的A-21978C复合物的10%。在用例1的方法制备出的A-21978C复合物中没有测出有A-21978C9。
例4增加A-21978C10的产量因子A-21978C10〔结构式IR是癸酰基〕进行如例1所描述的第一，第二步营养生长培育步骤，在第三步，使用800毫升的第二步接受体培养物接种到有下列组成的950升的无菌的第三个接受体生长培养基上。
成分 数量(%)葡萄糖 2.0碳酸钙 0.2大豆蛋白粉(Soybean Flour) 2.0
酵母萃取物 0.1Kcla0.02MgSO4.7H2Oa0.02FeSO4.7H2Oa0.0004Sag471(防泡) 0.02水 95.6396a、如例1所描述的方法来制备微量无机物溶液。
经接种后的培养基在一个不锈钢容皿中于30℃培育24小时，容器中以0.8V/V/m的速度充以无菌空气并用常规的搅拌器搅拌。用1升的这种第三步接受体来接种到119升有如例1描述的组成的生产步骤培养基上。除了例1所叙述的开始步骤之外，在开始了28个小时，把一个含有50%V/V的癸酸和50%的甲基油酸盐的无菌溶液以每小时每升发酵液体培养物0.26毫升的速率进入发酵体，保持这个速度，经283个小时，直到发酵结束。A-21978C复合成物的产量是每升液体培养液1.94克，比用例1的方法增加687%。浓缩A-21978C10因子(结构式IR是N-癸酰基〕得每升1.63克或总的A-21978复合物的84%，这比用例1的方法所得到的A-21978C10大13583%。
例5增加A-21978C10产量的另外方法进行如例1所描述的第一，第二和第三个接种体生长步骤。除了最初的生产步骤如例1所描述的之外，开始了28小时，把一个含有25%V/V的辛酸乙基酯(乙基辛酸酯)和甲基油酸脂的无菌溶液以每小时每升发酵液体培养液0.13毫升的速率加到发酵体中，保持这个速率，经144小时直到发酵结束，A-21978C合成物的产量是每升1.022克，比用例1方法所得到的产物增加362%。浓缩A-21978C10因子是每升0.202克或总的A-21978合成物的20%。这比用例1的方法所生产的浓缩A-21978C10的产量大1683%。
例6增加A-21978C10产量的另外方法进行如例1所描述的第一，第二步营养生长培养步骤。除了第三步接受体如例4所描述的培养之外，培养基的体积是1900升，这一步骤持续48个小时。从0～24小时充气速率为0.3V/V/m，从24～40小时，充气速率为0.45V/V/m，从40～48小时，充气速率为0.90V/V/m。最初的生产步骤如例1所描述的。在23小时之内，把0.004%的酵母萃取物的无菌悬浮液成批供给发酵体。开始36小时，丙三醇和癸酸铵溶液以每小时每升发酵液体培养液0.84毫升的速率供给。供给的溶液含有丙三醇(3600克)、去离子水(9000毫升)、辛酸(1升)和浓缩的氢氧化胺溶液(620毫升)。在这个速率下保持供给143小时，直到发酵结束。A-21978C合成物的产量是每升1.772克，比用例1方法获得的产品产量增加628%，浓缩A-21978C10因子经测定是每升0.739克或是总的A-21978C合成物的42%，这比用例1方法生产的浓缩A-21978C10的产量大6158%。
例7增加A-21978C11的产量进行如例1所描述的第一，第二和第三个接种步骤，除了最初的生产步骤如例1描述的之外，开始28个小时内，一个含有25%V/V十一烷酸和75%的甲基油酸盐的无菌溶液以每小时每升发酵液体培养液0.13毫升的速率加到发酵体中，在144小时内直到发酵结束。A-21978C10合成物的产量是每升1.62克，这比用例1方法所得到的A-21978 C10的产量高574%。浓缩A-21978C11因子〔结构式IR是十一酰基〕经测定是每升0.70克，或是总的A-21978C复合物的43%。在通过用例1方法制备的A-21978C复合物中没有发现A-21978C11因子。
例8增加A-21978C5的产量进行如例1所描述的第一，第二和第三步接种步骤，除了最初的生产步骤如例1描述的之外，在开始的28个小时之内，一个含有25%V/V的十二烷酸和75%甲基油酸盐的无菌溶液以每小时，每升发酵液体培养液0.13毫升的速率加入到发酵体中，在144小时内直到发酵结束。A-21978C合成物的产量是每升1.12克比用例1的方法产品增加400%，浓缩因子A-21978C5〔结构式IR是十二烷酰基〕经测定是每升0.372克或是总的A-21978C复合物的33%。这比用例1方法制备的A-21978C合成物中发现的浓缩A-21978C5大5314%。
例9生产A-21978C合成物的其它方法使用例1的方法制备A-21978C复合物，但使用Streplomyces reseosporus NRRL 11379培养物。
例10增加A-21978C10产量的其它方法使用例6的方法制备A-21978C10，但使用Streptomyces reseosporus NRRL 11379培养物。
例11振荡瓶生产的A-21978C合成物使用如例1描述的一般方法，但在振荡瓶条件下，使用下列发酵培养基成分 数量(%)葡萄糖 7.5糊精a30酶水解酪蛋白b5胨c5糖浆 2.5去离子水 总量为1升a、Stadex 11，A、E，Staleyco，Decatur ILb、NZ Amine A，Humko Shebbield chemical Lyndurst NJc、Biosate，Baltimore Biological laboratories，Coekeysville MD从这个发酵体中得到的A-21978C合成物的产量是每升液体培养物1800mcg。
权利要求
1.制备抗菌素A-21978C复合物或因子的方法，该方法包括在含有可同化的碳、氮源和无机盐的培养基中和液面下需氧发酵条件下，将Streptomyces roseosporus(CCTCC No.85-007)培养至产生A-21978C抗菌素。
2.按照权利要求1制备抗菌素A-21978C复合物或因子的方法，包括从该培养基中分离出A-21978C复合物的附加步骤。
3.按照权利要求1或2制备抗菌素A-21978C复合物或因子的方法，包括从所述A-21978C抗菌素复合物中分离出C0，C1，C2，C3，C4或C5各个因子的附加步骤。
全文摘要
提供一种制备抗菌素A-21978C复合物或因子的方法，包括在含有可同化的碳、氮源和无机盐的培养基和液面下需氧发酵条件下，培养产生A-21978C抗菌素的新的微生物菌种，然后由该培养基中分离出A-21978C复合物，再由该复合物中分离得到C
文档编号C07K14/41GK1051200SQ9010930
公开日1991年5月8日 申请日期1985年10月8日 优先权日1984年10月9日
发明者弗洛伊德·米尔顿·休伯, 理查德·路易斯·皮珀, 安东尼·约瑟夫·蒂尔特斯, 汤姆·爱德华·伊顿, 林达·马克辛·福特, 小奥蒂斯·书伯斯特·戈弗雷, 马丽·路易丝·布朗·休伯, 小米尔顿·约瑟夫·兹米史斯基 申请人:伊莱利利公司
技术领域：
本发明是有关分子式为(Ⅰ)的A-21978环状肽抗菌素衍生物的经过改进的制备方法，其中R是C2-C14的链烷酰基。特别是这
种经过改进的方法包括了在发酵时把2个碳原子到14个碳原子的链烷酸提供给产生A-21978C的培养物。这个方法的优点是(1)、生产步骤较原有的方法少，(2)、产量提高，(3)、须要的时间少。
这种A-21978C系列抗菌素是很好的抗菌药物，A-21978 C的诸多衍生物中，具有分子式(Ⅰ)的一组尤为重要，(也可参见专利号为4，537，717的美国专利.Bernard.J.Abbott，David S Fukuda and Manuel Debono.)。过去，这些衍生物的制备需要某种多级步骤，该多级步骤费时间，产量低，而且价格昂贵。而本发明则提供了制备这些A-21978C衍生物的一种经过改进的方法。原有的制备一种分子为(Ⅰ)的衍生物的方法，例如制备A-21978C的正-癸酰基衍生物，需要下列步骤1、产生A-21978C培养的发酵过程a、用一种液体氮安瓿开始。
b、初级接种步骤(48小时)。
c、二级接种步骤(24小时)。
d、三级接种步骤(24小时)。
e、发酵(140小时)。
2、过滤，树脂吸附和洗脱，及浓缩3、制备t-BOC复合物(即被保护的叔丁氧基羰基)4、对被保护的复合物进行浓缩5、脱酰基培养物的发酵，如使用游动放线菌属(Actinoplanes utahensis)a、用一种液体氮安瓿开始。
b、初级接种步骤(72小时)。
c、二级接种步骤(48小时)。
d、发酵(67小时)。
6、带有脱酰基培养物的复合物的脱酰基作用。
7、过滤，树脂吸附及洗脱，浓缩。
8、再酰化作用。
9、保护基团的水解。
10、最后进行纯化。
本发明的新的方法包括了在发酵生产步骤中(步骤1的e)，把一种具有2个碳原子到14个碳原子的链烷酸(一种ROH化合物，其中，R如同上述规定)，或者它们的一种酯或者盐，加入到产生A-21978C培养物中，以得到与分子式(Ⅰ)相对应的化合物，使用这个方法，就可以省去原方法中的3，4，5，6，7，8和9的步骤，此外，这种新的方法可以明显的提高产量，其所得到的产量大大超过了使用原有方法所获得的收率。
Streptomyces roseosporus菌种A-21978.6(CCTCC No.85-006)及其突变体菌种A-21978.65(CCTCC No.85-007)是产生A-21978C培养物的有用的菌种。这两个菌种已于1985年10月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。其中S.roseosporus A-21978.6培养物和A-21978C抗菌素的生产使用条件，已经由Robert L.Hamill和Marvin M.Hoehen在美国专利(US 4331594)中进行了说明，该专利文件也作为本文的参考文献。
虽然在本发明的方法中，所指定了的A-21978.6和A-21978.65是较好的微生物菌种，但是任何生产A-21978C的培养物都可以使用。本技术领域中的技术熟练的人们会了解哪种菌种会对本方法有用。
在美国专利US4，331，594所介绍的天然产生的A-21978C因子是C0，C1，C2，C3，C4和C5。在C1，C2，C3，C4，C5的众因子中，在式(Ⅰ)中的R是一种特殊的10个碳原子到12个碳原子的烷酰基，A-21978C因子C0，很容易想到，它是一种具有单一支链化的，有10个碳原子的烷酰基侧链，已经发现，它们是二种组份的混合物，二种组份大致的比例为2∶1，其中，主要的组份是带有10个碳原子的以支链作为侧链的组份，较少的组份是具有10个碳原子的以直链作为侧链的组份。
为了便于讨论，使用本发明的方法而制备的分子式为(Ⅰ)的化合物，也称作A-21978C因子，除了天然产生的因子外，通常用侧链的长度表示因子。从而，例如，分子式为(Ⅰ)的化合物，其中R＝辛酰基，当使用本发明的方法进行制备时，则被称作一种A-21978C3因子。
在本发明的方法中，所用的2个碳原子到14个碳原子的链烷酸，酯或盐，(基质，The aubstrate)可以是直链，也可以是支链化合物，例如，为了制备天然产生的A-21978C的因子C1，C2，C3，可以使用一种8-甲基正十二烷酸，10-甲基正十二烷酸，或者10-甲基十一烷酸，酯或者盐，由于2个碳原子到14个碳原子的直链酸，酯或盐容易得到，成本低，因此推荐使用于本方法中，特别好的基质，(Substrate)是正-十二烷酸，它的酯或者盐。
当使用2个碳原子到14个碳原子的链烷酸酯时，推荐使用C1-C4的烷基酯，在这样一种酯中，1个碳原子到4个碳原子的烷基可以是直链，或者是支链。
在这个方法中，所使用的典型的2个碳原子到14个碳原子的链烷酸的适宜的盐，包括了链烷酸与碱金属或者碱土金属所形成的盐，例如钠，钾，锂，铯，钕，钡，钙或镁。合适的胺盐包括1个碳原子到4个碳原的伯，仲，叔烷基铵盐和羟基-C2-C4-烷基铵盐。
这种酶作用物(Substiate)，最好是以无菌液的形式加入到发酵过程中，用在这种方法的溶剂，虽然可以使用乙醇，醋酸乙酯，和1个碳原子到4个碳原子的不饱和脂肪酸的酯，但是特别有用的溶剂是油酸甲酯，如果，这种基质，(The substrate)，在发酵温度下，是一种适当的液体，则可以直接把这种基质(substrate)加入其中。
这种基质(substrate)的加入速率必须是够低，以避免发酵中产生中毒作用，不过加入速率高，则可足以提高所希望得到的分子式为(Ⅰ)的化合物的产量。每小时对每升发酵液建议其加入速率大约为0.1到0.2毫升。
在发酵生产步骤时，这种基质(Sustrate)是生产A-21978C培养物正处于生长阶段时而被加入其中的，从大约在15小时到32个小时才开始加入，并继续加入，直至发酵作用终止。这种基质(Substrate)的加入方式可以是以各种不同的方法而加入，但最好的加入方式是能通过某种能更接近于稳定流动状态的方式而加入。
接着，进行发酵，如果需要，则可以用已知的工艺步骤来回收所产生的分子式(Ⅰ)的化合物(也见美国专利US4，331，594)本发明也提供了上面已经提到的新型微生物，Streptomyces(链霉素)Roseosporus NRRL15998，这种微生物也能产生A-21978C抗菌素。本发明特别涉及到一种经过改进的，用于生产A-21978C抗菌素的方法，这种方法是通过在液内需氧发酵的条件下，通过培养新型的Steptomyces roseosporus，NRRL15998的菌种，直至产生出基本上达到A-21978C抗菌素的水准。该A-21978C的抗菌素复合物可以用极性有机溶剂从发酵液和菌丝体中萃取出来，这种A-21978C的各个因子也可以用本领域中人所共知的技术如柱上色谱分析法来进一步纯化。
一般，从天然状态中分离出来的培养物(称野生型“The Wild type”)，用来生产的抗菌素，其产量低，抗菌素的生产常常是不稳定的。因此，使用高效的菌种来不断地生产抗菌素是有很大的价值的。
本发明的目的是提供某种经过很大改进的用来制备A-21978C抗菌素的方法，该方法是通过培养Streptomyces(链霉素)roseosporus NRRL15998，或者通过培养某种A-21978C产生的突变体，变异体，或者它们的重组体，在一种培养物培养基中，该培养物培养基包括可同化源碳源，氮和无机盐，在液内需氧发酵的条件下，直至生产出A-21978C的抗菌素。这种A-21978C抗菌素复合物，或者它的各个单独的因子，可以使用本领域已知的不同的分离和纯化步骤来加以回收。
本发明的这一部份的微生物，已经被称为A-21978.65。这个菌种是通过菌种选择和从已经被定名为A-21978.6的菌种(NRRL 11379)中发生突变作用而培育出来的。Frederick P.Mertz和Ralph.E.Ka the(Lilly研究实验室)已经对这种A-21978.6菌种进行了研究和鉴定。该A-21978.6是从土耳其的亚拉拉特山的土块中选择出母体菌种而周转培育出来的这种A-21978.6菌种被下列人员即Falcaode Morias和Dalia Maria等人于1961年，被作为新的菌种而归类于Streptomyces(链霉素)Roseosporus。这种分类是与已经出版的出版物所叙述的内容相比较而作出的〔即R.E.Buchanan和N.E.Gibbons的“Bergey的细菌学测定手册”William和wilkins公司8th.Ed.，1974;和E.B.Shirling及D.Gottlieb，的“链霉菌素类菌种的共同说明”intern.Journal oF Systematic Bacteriol 808-809(1972)〕。
这种分类是以国际链霉素项目所推荐的方法〔E.B.Shirling和D.Gottieb.“链霉菌素种的
定方法”，在Intern.Journal of Systematic Bactriol.16，313-340(1966)〕，以及相关的辅助实验作为基础而作出的。
在ISP9＃基础培养基上，决定碳的使用的量，在该基础培养基中，所加入的碳源，其最终达到的浓度是1.0%。碳源通过过滤作用而达到无菌，这种基础培养基是用高压灭菌作用而达到无菌。基片在30℃，经过14天的接种过程之后，可以被辨认出来。
其细胞壁结晶，可以利用改进的Lechevalier的方法来加以测定，(M.P.Lechevalier，“关于分离放线菌素到属的化学方法”。由美国微生物放线菌委员会小组专门小组主办。由Dr.Thomas G.pridham，Convenor;在下列部门举行，即微生物研究所，Rutgers大学及在美国的新泽西州，新布鲁诺兹友市，新泽西的州立大学，1971年)。
二氨基庚二酸的异构物是利用Becker等人的方法来进行测定，〔B.Becker，et.al，“利用整个细胞水解的纸上色谱方法快速区分诺卡氏菌(Norcardia)和链霉素菌(Streptomyces)”。AppL.Microbiol 11，421-423(1964)〕。
分析氨基酸是利用洗涤细胞壁断裂物的方法来进行，类黑色素的测定是利用ISP1＃(胰蛋白-酵母菌提取物培养物)，ISP6＃(胨-酵母菌提取物，铁琼脂)，ISP7＃(酪氨酸琼脂)，改进的ISP7＃(即ISP7＃不含有酪氨酸)，及某种酪氨酸鉴定〔Yuzuru Mikami，et，al的“改进的链霉素Arai和Mikani黑色素形成试验”，发表于Intern.journal of Systematic Bactrsiol.27(3)，290(1977)〕。测定淀粉水解物是使用淀粉与碘的实验方法来进行。
利用ISP2＃琼脂培养基，来进行温度范围，耐Nacl性质，PH范围，和抗菌素敏感性的试验。其温度范围是25，28，30，34，37，40，45，50和55℃。抗Nacl性质是利用把Nacl加入到琼脂中来进行测定。其用量相当于0，1，2，3，4，5，6，8，10和12%。这些都是在30℃温度下进行培养。测定PH范围是调节琼脂使其PH值从3.0到11.0，按每次以1.0的PH单位而递增，正好在下一次调节PH之前来进行测定。抗菌素敏感性试验，是使用将敏感性的磁盘垫在已接种的琼脂板上的方法来进行测定的。
其颜色的确定可以按照Iscc-NBS方法(K.L.Kelly和D.B.judd。的“The Iscc-NBS颜色标志方法和颜色名称字典”来进行。U.S.Department of Commerce Circ.553，Washington，D.C，1955)。
圆括号中的数字表示Tresner和Baekus的颜色系列，〔H.D.Trenser和E.j.Backus.的“关于链霉菌素分类学的色轮系统”，AppL Microbiol.11 335-338(1956年)〕。其色片标志可以用在其下部划一横线来加以标志。其Maerz和paul颜色组可以用括号括出。(A.Maerz和M.R.paul“颜色字典”，McGraw-Hill Book Company.Inc.New york.N.Y.1950)形态(Morphology)A-21978.6培养物的形态包括孢囊柱，该孢囊柱是属于Rectus-Flexibilis(RF)分类，孢子的每段链长大于10个孢子(Spore)，孢子的表面柔软。
A-21978.6培养物是以基本上产生稀薄的红色的孢子群颜色而作为特征的，并具有微淡红色-棕色互相交变的颜色。也存在有微棕色的水溶性的色素。在14种琼脂板培养基中，有三种显示这种特性，这三种培养基(ISP 2＃，7＃，TPO)，被认为是由空气和营养物而大量生长的一类培养基。
有二种琼脂板培养基，即ISP4＃和葡萄糖一天门冬酰胺琼脂，产生出一种由白到灰的稀薄的孢子群颜色，并具有交变的黄色，没有观测到其中有水溶性的色素，这二种培养基被认为是较好的培养基，但得到的数量不多，它们是通过空气和营养物而生长。
也利用另外的九种琼脂板培养基，但是它们仅有少量产生，或者不生长，和不形成芽孢。气生的颜色存在时，虽然很少，不过这种气生的颜色都属于由白到灰的颜色系列。
类黑色素色素也不存在，主要是由细胞壁而组成，它们是LL-二氨基庚二酸，甘氨酸，葡萄糖和核糖。这些都用类型l细胞壁和类型C糖型来表示(R.E.Buchanan和N.E.Gibbon，Eds，“Becgey的细菌学测定手册”，William & Wilkins Compauy.8fh.Edition 1974.P.658)下列五种培养物是与A-21978.6相比较的实验室试验Streptomyces(链霉素)AlbovinaceousISP 5136;ATcc 15833Streptomyces(链霉素)CandidusISp 5141;ATcc 19891Streptomyces(链霉素)moderatusISp 5529;ATcc 23443Streptomyces roseosporus(链霉素) ISp 5122;ATcc 23958Streptomyces(链霉素)SetoniiISp 5395;ATcc 25497这些培养物属于白色和红色颜色系列，具有RF型孢囊柱形态，具有光滑的孢子表面，按照Isp的说明的，是属于类黑色素负性，没有明显的交替颜色和水溶性色素。这些特征，与碳利用型和其它的第二级特征相结合，都与A-21978.6的培养物相符合。
在实验室的条件下，这些培养物与A-21978.6相比较时，有四种培养物不合乎要求。S.Candidus和S.Setonii在很多培养基中，表现出气生的黄色孢子群颜色，S.Albovinaceous和S.Moderatus表现出明显的暗的交变的颜色;水溶性色素，并产生出了类黑色素，所有这些，都与A-21978.6的培养物不同。由ISp，表明S.moderatus是属于红棕或强烈的棕色交变颜色，而不属于S.Albovinaceous一类的特征。这二种培养基都不能列入黑色素类型。
因而，Falcao de Morias和Dalia Maia于1961年把A-21978.6培养物分类于Streptomyces(链霉素)roseosporus菌种。这种分类是以与出版物说明的内容相比较，及直接在实验室进行比较作为基础而得到的，下列列出的培养物的特性即概括了直接比较的研究内容。
培养特性形态(Morphology)A21978.6 S.roseosporus观测到孢囊柱直接呈现弯曲形(属于RF)，没有观测到钩形，环形和螺形，孢子链长＞10。用电子显微镜观测到孢子的表面光滑孢子伸长至椭圆 伸长到圆筒形平均0.85×1.78μM 1.01×2.47μM范围0.65-0.97 0.97-1.3×1.63×0.97-2.6μM -3.25μM所含有的培养物的特性
A-21978.6菌种的某些特性不同于已知的S.roseosporus。A-21978.6培养物在孢子大小，葫萝卜和马铃薯柱的生长，防Nacl的性质，和在硝酸盐的还原作用等性质方面都和已经公开的菌种不同。
本发明中的A-21978.65菌种具有与A-21978.6的菌种同样的特性。但是，不同之处在于所生产的A-21978C的抗菌素的总量不同。较早的菌种，每毫升发酵基中所产生的A-21978 C抗菌素，最好的也没有超过100mcg。而本发明的经过改进的A-21978.65的菌种，在罐发酵中所得到的量至少是上述数量的2.5倍，而在振荡瓶中的发酵中，已经得到18倍于上述数量的产量。具有这种提高产量的A-21978C所产生的特征是，使这种新的菌种能对要得到的各种抗菌素的生产在方法上作出巨大的改进。
和其它的有机体一样，本发明产生的新的A-21978C培养基Streptomyces(链霉素)roseoporus NRRL15998，易发生变异。NRRL15998菌种的重组体，变异体和突变体，可以用已知的，不同的诱变原进行处理而得到，例如，紫外线，X-射线，高频波，放射线和化学品等。天然的和经过诱导而得到的Streptomyces(链霉素)roseosporus NRRL15998的突变体，变异体和重组体，只要保留了产生A-21978C抗菌素的特性，产量也高，则它们也可以用在本发明中。
用于Streptomyces roseoporus NRRL15998菌种生长的培养基，可以是培养液中的任何一种培养基。例如，可以使用葡萄糖，果糖，半乳糖，麦芽糖，甘露糖，棉子油，油酸甲酯，甘油，精制大豆油等，然而，就生产的经济性，最佳产率和容易离析等方面来说，在大范围的发酵过程中，一种最好的碳源却是木薯糊精。
关于氮源，虽然可以利用可溶性的肉胨，大豆粉，大豆水解产物，大豆渣，酵母，氨基酸类像L-天门冬酰氨和DL-亮氨酸等，但是一种较好的氮源是一种水解酪蛋白酶。
可以与培养基配合使用的无机盐营养物，是可以形成钾，铵，氯化物，硫酸盐，硝酸钾盐等离子的可溶性的盐，其中，K2SO4在抗菌素生产中最有用，糖蜜灰，灰渗析液，和合成的无机混合物等也有用。
生产A-21978C抗菌素时，在其发酵培养基中最好使用蒸馏水或者去离子水，在自来水中，如果存在如钙和碳酸盐等无机物，则会对抗菌素的生产起阻碍作用。
用于微生物的生长发育所必须的基本微量元素也应该包括在菌种培养基中。这种微量元素一般是在其它培养基的结构中，作为不纯物而存在的，其含量足以满足微生物生长所需要的量。
如果在大范围发酵过程中，发泡作用影响发酵，则必须加入某种少量防泡剂(用量为0.2毫升/每升)如加入聚丙烯乙二醇到发酵培养基中。
大量生产A-21978C抗菌素，最好在罐内进行，用液内需氧发酵方法。不过，也可以用震动-摇瓶培养法来得到少量的A-21978C抗菌素。
由于在微生物的生产中，其时间滞后通常与大罐的接种，及微生物的孢子形式有关系，因此，最好是利用某种营养接种物。这种营养接种物是利用孢子形式，或者微生物的菌丝体的断片来接种某种小量的培养物培养基，以得到某种新鲜的、有活性的，微生物菌种生长培养物，然后再把这种营养物移植到一种大罐中。
这种新产生的A-21978C的微生物，可以在温度为20℃和40℃之间的温度进行生长培育。A-21978C的生长的最适宜的条件为在温度30℃到32℃为好。
通常，在液内需氧培养的方法中，无菌空气被通过培养物培养基而扩散。为了有效的生产A-21978C的抗菌素，在罐内生产所用的饱和空气的百分含量应该高于20%，最好是高于30%(温度为30℃和压力为1个大气压)罐内发酵，最好保持发酵培养基的PH范围在大约6.5-7.0。这可以通过加入适当量的如氢氧化钠(在开始步骤)和加入盐酸(在最后步骤)而作到这一点。
A-21978C抗菌素产品能在发酵期间，通过测定液体培养液或菌丝体固体提取物样品，用已知对抗菌素过敏的有机体作对比，来测定抗菌素的活度。在测定这些抗菌素时，一种常用的鉴定有机体是黄球菌(Micrococcus Luteus)。生物鉴定是通过纸盘在琼脂板上来完成的。
另外，培养物固体，包括培养基成分和使用没被提取或分离的菌丝体，但最好是去除水份后，选择来作为A-21978 C抗菌素的来源。例如，在A-21978 C活性抗菌素的生产之后，培养基能用在真空中的冷冻状态下蒸发水份的方法来干燥，混合后直接进入供给预混合料中。
结构式Ⅰ的化合物是的抗菌素剂。
为了很完全地说明本发明的操作，下面提供了未加限制的例子。
例一A-21978C 复合物的生产在液氨的汽化相中制备和保存一种原种培养物。Streptomy-ces roseosporus NRRL15998，在液氨的汽化相中予先给以保存，然后使用50毫升的下列组合物的营养培养基进行接种。
成分 数量(%)胰蛋白酶大豆液体培养基〔Tryptlcase 3.0soy Broth＊〕糊精 2.5水(去离子) 94.5＊Baltimore生物实验室，Cockeysville MD接种后的培养基放在一个250毫升的锥形瓶中，该烧瓶放在一个二英寸的拱形板的旋转振荡器上，转速为250转/分钟，于30℃培养48小时。然后将成熟的营养培养物分散到多个(0.5毫升)的容器中，并在液氨的汽化相中储藏。
为了提供大量均匀的供应储存物品，用在液氨中1毫升的培养储存物接种到80毫升的上面所讨论的营养培养基上，把接种后的营养培养基放一个250毫升的锥形瓶中，该烧瓶放在一个二英寸的拱形板的旋转振荡器上，转速为250转/分钟，于30℃培养48小时。
用10毫升的这种培养物来接种到450毫升的有如上面所描述的第一阶段营养培养基相同组成的第二阶段营养生长培养基上。第二阶段的培养基放在一个2升的锥形烧瓶中，该烧瓶放在一个2英寸的拱形板的旋转振荡器上，转速为250转/分钟，于30℃，培育24小时。
使用1升的第二阶段的营养培养物接种到39升的有下列成分的无菌的第三个接种物生长培养基上成分 数量(%)大豆蛋白粉〔Soybcan Flowr〕 0.5酵母萃取物a0.5葡糖酸钙 1.0Kclb0.02MgSO4.7H2Ob0.02FeSO4.7H2Ob0.0004Sag471〔防泡〕 0.03水 97.9296a、Difco实验室，Detroit MIb、如下面方法来制备微量无机物将FeSO4.7H2O(7.6克)溶解在经浓缩的Hcl(76毫升)，然后加入MgSO4.7H2O(380克)，Kcl(380克)和去离子的水使总体积为3800毫升，为了提供满意的无机物，使用每39升的第三个接种物生长阶段的80毫升的溶液。
c、Union Carbide，Danbury CT接种后的培养基在一个不锈钢容器中于30℃培育24小时，容器中以0.85V/V/m的速度充以无菌空气，并用常规的搅拌器搅拌，转速为350～450转/分钟，容器中的压力保持在5泊斯卡(PSIG)。
使用1升的培育后的第三个接种体阶段产物来接种到有下列组成的119升的无菌产品培养基上
成分 数量(%)大豆蛋白粉〔Soybean Flour〕 2.2Fe(NH4)2SO4.6H2O 0.066葡萄糖 0.825Sag471 0.022土豆糊精 3.3糖浆(乳化黑色油) 0.275自来水 93.312在加入第一、二种成分之后，将PH调节到7.0，接着加入所有的成分，立刻消毒灭菌一段时间。
接种后的产品培养基在一个不锈钢容器中，于30℃并以0.5V/V/m的速度充以无菌容气，培养6天。培养基用常规的搅拌器搅拌，在速度为250转/分钟时，搅拌0～15小时，和在速度350转/分钟时，搅拌15小时，加入氢氧化胺(NH3.H2O)来保持PH值等于或超过6.5。在发酵结束时，A-21978C复合物的产量是每升发酵液体培养液为0.282克，因子分析如表一所描述的。
例2增加 A-21978C8的产量进行如例1所描述的第一，第二，第三生长步骤。最初的生产步骤除列1描述的之外，开始时含有50%V/V辛酸(C7H15COOH)和甲基油酸盐的无菌溶液以每小时每升发酵液体培养液0.13毫升的速率供给发酵体28小时，以这个速度，经144小时直到发酵结束。A-21978C复合物的产量是每升液体培养液1.255克，比例1获得的产量增加445%。因子A-21978C8〔结构式Ⅰ的化合物，其中R是辛(酰)基〕代表用这个方法制备出的总的A-21978C合成物的9%。在用例1的方法制备出的A-21978C复合物中没有测出有A-21978C8。
例3增加A-21978C9的产量进行如例1所描述的第一，第二和第三步培养生长步骤，最初的生产步骤除例1描述的之外，开始时含有25%V/V壬酸和75%甲基油酸盐以每小时每升发酵液体培养液0.13毫升的速率供给发酵体28小时，以这个速度时，经144小时直到发酵结束。A-21978C合成物的产量是每升液体培养液肉汤0.821克，超过例1获得的产量293%。因子A-21978 C9〔结构式IR是壬酰基(CH3(CH2)7CO-)〕代表用这个方法制备出的总的A-21978C复合物的10%。在用例1的方法制备出的A-21978C复合物中没有测出有A-21978C9。
例4增加A-21978C10的产量因子A-21978C10〔结构式IR是癸酰基〕进行如例1所描述的第一，第二步营养生长培育步骤，在第三步，使用800毫升的第二步接受体培养物接种到有下列组成的950升的无菌的第三个接受体生长培养基上。
成分 数量(%)葡萄糖 2.0碳酸钙 0.2大豆蛋白粉(Soybean Flour) 2.0
酵母萃取物 0.1Kcla0.02MgSO4.7H2Oa0.02FeSO4.7H2Oa0.0004Sag471(防泡) 0.02水 95.6396a、如例1所描述的方法来制备微量无机物溶液。
经接种后的培养基在一个不锈钢容皿中于30℃培育24小时，容器中以0.8V/V/m的速度充以无菌空气并用常规的搅拌器搅拌。用1升的这种第三步接受体来接种到119升有如例1描述的组成的生产步骤培养基上。除了例1所叙述的开始步骤之外，在开始了28个小时，把一个含有50%V/V的癸酸和50%的甲基油酸盐的无菌溶液以每小时每升发酵液体培养物0.26毫升的速率进入发酵体，保持这个速度，经283个小时，直到发酵结束。A-21978C复合成物的产量是每升液体培养液1.94克，比用例1的方法增加687%。浓缩A-21978C10因子(结构式IR是N-癸酰基〕得每升1.63克或总的A-21978复合物的84%，这比用例1的方法所得到的A-21978C10大13583%。
例5增加A-21978C10产量的另外方法进行如例1所描述的第一，第二和第三个接种体生长步骤。除了最初的生产步骤如例1所描述的之外，开始了28小时，把一个含有25%V/V的辛酸乙基酯(乙基辛酸酯)和甲基油酸脂的无菌溶液以每小时每升发酵液体培养液0.13毫升的速率加到发酵体中，保持这个速率，经144小时直到发酵结束，A-21978C合成物的产量是每升1.022克，比用例1方法所得到的产物增加362%。浓缩A-21978C10因子是每升0.202克或总的A-21978合成物的20%。这比用例1的方法所生产的浓缩A-21978C10的产量大1683%。
例6增加A-21978C10产量的另外方法进行如例1所描述的第一，第二步营养生长培养步骤。除了第三步接受体如例4所描述的培养之外，培养基的体积是1900升，这一步骤持续48个小时。从0～24小时充气速率为0.3V/V/m，从24～40小时，充气速率为0.45V/V/m，从40～48小时，充气速率为0.90V/V/m。最初的生产步骤如例1所描述的。在23小时之内，把0.004%的酵母萃取物的无菌悬浮液成批供给发酵体。开始36小时，丙三醇和癸酸铵溶液以每小时每升发酵液体培养液0.84毫升的速率供给。供给的溶液含有丙三醇(3600克)、去离子水(9000毫升)、辛酸(1升)和浓缩的氢氧化胺溶液(620毫升)。在这个速率下保持供给143小时，直到发酵结束。A-21978C合成物的产量是每升1.772克，比用例1方法获得的产品产量增加628%，浓缩A-21978C10因子经测定是每升0.739克或是总的A-21978C合成物的42%，这比用例1方法生产的浓缩A-21978C10的产量大6158%。
例7增加A-21978C11的产量进行如例1所描述的第一，第二和第三个接种步骤，除了最初的生产步骤如例1描述的之外，开始28个小时内，一个含有25%V/V十一烷酸和75%的甲基油酸盐的无菌溶液以每小时每升发酵液体培养液0.13毫升的速率加到发酵体中，在144小时内直到发酵结束。A-21978C10合成物的产量是每升1.62克，这比用例1方法所得到的A-21978 C10的产量高574%。浓缩A-21978C11因子〔结构式IR是十一酰基〕经测定是每升0.70克，或是总的A-21978C复合物的43%。在通过用例1方法制备的A-21978C复合物中没有发现A-21978C11因子。
例8增加A-21978C5的产量进行如例1所描述的第一，第二和第三步接种步骤，除了最初的生产步骤如例1描述的之外，在开始的28个小时之内，一个含有25%V/V的十二烷酸和75%甲基油酸盐的无菌溶液以每小时，每升发酵液体培养液0.13毫升的速率加入到发酵体中，在144小时内直到发酵结束。A-21978C合成物的产量是每升1.12克比用例1的方法产品增加400%，浓缩因子A-21978C5〔结构式IR是十二烷酰基〕经测定是每升0.372克或是总的A-21978C复合物的33%。这比用例1方法制备的A-21978C合成物中发现的浓缩A-21978C5大5314%。
例9生产A-21978C合成物的其它方法使用例1的方法制备A-21978C复合物，但使用Streplomyces reseosporus NRRL 11379培养物。
例10增加A-21978C10产量的其它方法使用例6的方法制备A-21978C10，但使用Streptomyces reseosporus NRRL 11379培养物。
例11振荡瓶生产的A-21978C合成物使用如例1描述的一般方法，但在振荡瓶条件下，使用下列发酵培养基成分 数量(%)葡萄糖 7.5糊精a30酶水解酪蛋白b5胨c5糖浆 2.5去离子水 总量为1升a、Stadex 11，A、E，Staleyco，Decatur ILb、NZ Amine A，Humko Shebbield chemical Lyndurst NJc、Biosate，Baltimore Biological laboratories，Coekeysville MD从这个发酵体中得到的A-21978C合成物的产量是每升液体培养物1800mcg。
权利要求
1.制备抗菌素A-21978C复合物或因子的方法，该方法包括在含有可同化的碳、氮源和无机盐的培养基中和液面下需氧发酵条件下，将Streptomyces roseosporus(CCTCC No.85-007)培养至产生A-21978C抗菌素。
2.按照权利要求1制备抗菌素A-21978C复合物或因子的方法，包括从该培养基中分离出A-21978C复合物的附加步骤。
3.按照权利要求1或2制备抗菌素A-21978C复合物或因子的方法，包括从所述A-21978C抗菌素复合物中分离出C0，C1，C2，C3，C4或C5各个因子的附加步骤。
全文摘要
提供一种制备抗菌素A-21978C复合物或因子的方法，包括在含有可同化的碳、氮源和无机盐的培养基和液面下需氧发酵条件下，培养产生A-21978C抗菌素的新的微生物菌种，然后由该培养基中分离出A-21978C复合物，再由该复合物中分离得到C
文档编号C07K14/41GK1051200SQ9010930
公开日1991年5月8日 申请日期1985年10月8日 优先权日1984年10月9日
发明者弗洛伊德·米尔顿·休伯, 理查德·路易斯·皮珀, 安东尼·约瑟夫·蒂尔特斯, 汤姆·爱德华·伊顿, 林达·马克辛·福特, 小奥蒂斯·书伯斯特·戈弗雷, 马丽·路易丝·布朗·休伯, 小米尔顿·约瑟夫·兹米史斯基 申请人:伊莱利利公司
再多了解一些
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