高动态范围成像的制作方法

高动态范围成像
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年02月01日提交的序列号为62/800,160的美国临时申请的优先权。该美国临时申请62/800,160的公开内容和全部教导在此通过引用方式并入本技术作。
技术领域
3.本发明涉及显微技术，更具体地，涉及一种在多光子显微技术中用于高动态范围成像的系统及方法。


背景技术：

4.在激光扫描荧光显微镜中，同时吸收两个光子(或多个光子)进行分子激发可提供固有的三维分辨率。双光子显微镜和多光子显微镜已被广泛应用于测量完整大脑神经元群的动态过程(如钙动力学)，甚至是大脑在动物行为期间的动态过程。
5.可检测低至单光子水平的光的光电探测器，如光电倍增管(photomultiplier tube，pmt)和硅光电倍增管(silicon photomultiplier，sipm)，因成本低、灵敏度高且波长覆盖范围广而常被用于双光子显微镜系统中。在荧光显微镜中，激发样本时，样本某些结构的更多光子及其他结构会发出荧光。例如，在对神经元活动成像时，组织体的亮度比在神经网络中的活动要亮得多。样品结构的成像能力取决于背景信号和探测器检测到的光子数量。为了检测样本中的细微结构，需增加探测器的增益或积分时间。然而，增益或积分时间的增加受样本中最亮物体的限制，因为如果将增益或积分时间调整得太高，则最亮物体发出的光子会使包括探测器、放大器和数字化工具等在内的检测系统饱和。因此，荧光显微镜中使用的光电探测器、放大器和数字化工具的检测动态范围有限，因其检测范围受到视野内可同时检测的最大强度和最小强度的限制。当前成像技术的动态范围可达到约14位。然而，在某些成像应用中需要高达22
‑
24位的高动态范围，例如，神经活动和精细神经结构的光学成像。因此，需要一种克服上述局限的方法，以对样本进行高动态范围成像。


技术实现要素：

6.本发明的实施例提供了一种成像系统，包括：光源，配置成生成具有脉冲间隔的强度衰减的连续光脉冲；以及显微镜系统，配置成成像样本，并基于连续光脉冲的强度处理从样本检测到的信号。
7.此外，针对成像系统，本发明的实施例还提供了一种配置成生成一系列强度降低的激光脉冲的光源，包括：脉冲激光器，配置成生成具有重复间隔的光脉冲；第一分束器，配置成接收光脉冲，并将第一百分比光脉冲引导至延迟环路上以及输出第二百分比光脉冲；其中，延迟环路配置成将第一百分比光脉冲延时引导回第一分束器；并且其中，系统配置成通过在延迟环路中连续循环光脉冲，输出强度衰减且脉冲间隔等于延时的连续光脉冲。
8.此外，针对成像系统，本发明的实施例还提供了一种显微系统，包括：样本物镜，探
测器，以及一个或多个光学元件，配置成将连续光脉冲引导至样本物镜；其中，样本接物镜配置成将连续光脉冲聚焦在样本内的焦平面上；其中，探测器配置成响应于聚焦的连续光脉冲，检测从样本内的焦平面发射的光。
9.本发明的实施例提供了一种成像方法，包括：通过光源生成具有脉冲间隔的强度衰减的连续光脉冲；以及成像样本，并基于连续光脉冲的强度处理从样本检测到的信号。
10.此外，针对成像方法，本发明的实施例还提供了一种用于生成一系列强度降低的激光脉冲的方法，包括：通过脉冲激光器生成具有重复间隔的光脉冲；通过第一分束器接收光脉冲，并将第一百分比光脉冲引导至延迟环路上以及输出第二百分比光脉冲；通过延迟环路将第一百分比光脉冲延时引导回第一分束器；以及通过在延迟环路中连续循环光脉冲，输出强度衰减且脉冲间隔等于延时的连续光脉冲。
11.此外，针对成像方法，本发明的实施例还包括：通过一个或多个光学元件将连续光脉冲引导至样本物镜；通过样本接物镜将连续光脉冲聚焦到样本内的焦平面上；以及响应于聚焦的连续光脉冲，通过探测器检测从样本内的焦平面发射的光。
附图说明
12.图1是根据实施例的用于生成一系列强度降低的激光脉冲的光源的示图；
13.图2是根据实施例的成像系统示图；
14.图3是根据实施例的一系列调制光脉冲示图；
15.图4是根据实施例的用于生成一系列强度降低的激光脉冲的光源的示图；
16.图5是根据实施例的光电同步调制器(synchronous electro
‑
optic modulator，seom)示图。
具体实施方式
17.根据本发明原理的说明性实施例的描述旨在结合附图进行解读，其将被视作整个书面描述的一部分。在文中所公开的本发明的实施例的说明中，任何方向或方位参考都仅仅旨在便于进行说明，而并非旨在以任何方式限制本发明的范围。如“下”、“上”、“水平”、“垂直”、“上方”、“下方”、“向上”、“向下”、“顶部”和“底部”等相对性用语及其派生词(例如，“水平地”、“向下地”、“向上地”等)应当被视作是如后面所述或如所述附图中所示的方位。这些相对性用语仅仅旨在便于进行说明，而并非要求设备以特定方位进行构造或操作，除非明确如此表示。除非另有明确说明，否则如“附接”、“附连”、“连接”、“联接”、“互连”和类似用语是指其中结构直接地或通过介入结构间接地相互固定或附连的关系，以及可动或刚性附接或关系。此外，本发明的特征和有益效果通过参照示例性实施例示出。因此，本发明明显不应当被限定于示出的一些可能可单独存在的非限制性特征组合或其他特征组合的示例性实施例，本发明的范围由所附权利要求限定。
18.本公开描述了目前所能预期的本发明的一个或多个最佳实施方式。此描述并非旨在从限制意义上理解本发明，而仅仅出于示例目的结合附图提供本发明的实例，以告知本领域中的普通技术人员本发明的优点和构造。在各附图中，相似的内容用相似的附图标记表示。
19.重要的是，应当注意本公开的实施例仅仅是本文的创新性教导的许多有利用途的
示例。通常，本技术的说明书中进行的陈述不一定限制了各个要求保护的发明的任何方面，而且，某些陈述可以适用于某些创造性特征，但不适用于其他特征。通常，除非另有说明，单数元素可以表示复数元素，反之亦然，以不失一般性。
20.在一个实施例中，成像系统包括：光源，配置成生成具有脉冲间隔的强度衰减的连续光脉冲(如图1所示)；以及显微镜系统，配置成成像样本，并基于连续光脉冲的强度处理从样本检测到的信号(如图2所示)。图1是根据实施例的用于生成一系列强度降低的激光脉冲的系统的示图。该系统包括可生成具有重复频率的光脉冲的脉冲激光器110。例如，该脉冲激光器可以是可调谐飞秒级钛(ti)宝石激光器，其重复频率约在70
‑
90mhz之间且可调波长范围在650
‑
1110nm之间。应当理解，可根据具体应用使用不同规格或类型的脉冲激光器。在一个实施例中，将脉冲激光器产生的光脉冲引导至偏振分束器(polarizing beam splitter，pbs)120，并使第一偏振态的光脉冲透过pbs到达分束器122。在一个实施例中，分束器122是部分反射镜，例如，50/50反射镜。注意，根据具体要求，还可设想采用不同的反射/透射比或百分比，如60/40、80/20等。分束器122将光脉冲分成两路：第一百分比到延迟环路，而第二百分比到输出。在一个实施例中，输出传到显微镜系统的成像路径。如图2所示，在成像路径中，有一个或多个光学元件用于将光脉冲引导至所需位置。例如，该一个或多个光学元件可以是透镜、反射镜、分束器或扫描仪等元件或其部分组合。在一个实施例中，x
‑
y扫描仪130扫描第二百分比光脉冲以覆盖样本160平面内的区域。通过扫描平面内的位置，可进行显微镜扫描。分色镜140将光脉冲反射到物镜150中。应当注意，技术人员可使用一个或多个光学元件的配置或其等效物，将光引导至平面内的位置。物镜150随后将光脉冲聚焦到样本160中具有所需深度的图像平面170上。应当注意，技术人员可使用一个或多个光学元件的配置或其等效物，将光引导至平面内的位置。在一个实施例中，选择激光波长，使得样品在焦点处发出荧光。在一个实施例中，选择激光波长，使得在样品引起双光子激发态。样本160发出的光由探测器180采集。在一个实施例中，探测器是光电倍增管(pmt)。在一个实施例中，探测器是硅光电倍增管(sipm)。在一个实施例中，样本160发出的光透过物镜150和分色镜140到达探测器160上方。注意，图2中所示的分色镜和探测器布置仅是示例性的。其他光学元件和/或布置也可实现光到样本的所需方向和对样本发射的光的检测。
21.在一个实施例中，延迟环路包括穿过分束器122的路径，该路径将第一百分比光脉冲引导至第一反射镜124，第一反射镜将脉冲反射至第二反射镜126，第二反射镜126反射脉冲通过半波片(half
‑
wave plate，hwp)128到达pbs 120。半波片128将脉冲改为第二偏振态，使得pbs 120将脉冲反射回分束器122。注意，半波片128可放置在路径内的任何位置。图1中所示仅为示例性布置。延迟环路将预期延时引入相对于第二百分比光脉冲的第一百分比光脉冲中。注意，图1中示出的延迟环路布置仅为说明性示例。可使用其他光学元件和/或布置创建这样的延迟环路或其等效物。
22.分束器122根据延迟光脉冲的反射/透射比对其进一步分束，使得由分束器122传输的延迟光脉冲的强度进一步衰减。每次由分束器122反射到延迟环路中的光会因围绕延迟环路循环而延迟预期时间，并且由分束器122传输的光的强度会根据分束器的反射/透射比而减小。因此，初始光脉冲生成一系列强度衰减的延迟脉冲。图3是根据实施例的调制光脉冲的强度随时间变化图。从图3可以看出，第二光脉冲相对于第一光脉冲延迟，并且第二光脉冲的强度低于第一光脉冲。第三脉冲延迟相同的时间量并且其强度进一步衰减。图3中
所示脉冲仅供说明之用。脉冲的数量、相对强度和延迟等可随具体设置和应用要求而变化。注意，图3中还示出了强度与第一脉冲相同的第四脉冲。该第四脉冲是因脉冲激光器到达下一个重复间隔而发出的脉冲。
23.根据实施例的成像系统可利用已知的脉冲强度、测试样本上的位置和测得的荧光量，生成相对于普通双光子成像系统获得的图像而言动态范围增加的图像。
24.在一个实施例中，探测器包括多个用于存储来自样本的信号的时间缓存器。探测器响应于聚焦光脉冲所检测到的荧光信号可存储在缓存器中的一个中。如果选择延迟环路引入的延时使得在延迟脉冲到达样本时，荧光由于之前的脉冲而已基本减弱，则因响应于聚焦的延迟光脉冲的荧光而检测到的信号可存储在另一个缓存器中。因此，在样本中的每个焦点，缓存器存储不同时间的荧光数据，每个对应于不同强度的光脉冲。由于荧光强度取决于激发脉冲强度的平方，因此，对于一些脉冲强度，样本中结构发出的光亮度高使得缓存器饱和，而对于其他一些脉冲强度，样本中结构发出的光非常微弱使得信号未被寄存。在一个实施例中，成像系统包括处理器190，其配置成从多个时间缓存器中选择缓存器，其中所选缓存器未被最亮对象饱和。因此，对于每个光斑，处理器可选择不同的强度调制脉冲，并且可选择与最适合该光斑的动态范围相对应的激发强度。在一个实施例中，处理器可选择缓存器中的数据，该缓存器对应于未使其饱和的脉冲中的强度最强的脉冲。
25.可在系统扫描样本时实时进行相应缓存器的选择。在一个实施例中，处理器可包括现场可编程门阵列(fpga)，其允许高速、灵活地将可编程逻辑整合到处理器上。
26.在另一个实施例中，通过具有延迟环路的光电同步调制器(seom)实现一系列幅度减小的脉冲的生成，如图4所示。图5是根据实施例的seom的示例性布置图。四分之一波片(quarter wave plate，qwp)510和第一pbs或偏振器520配置成接收脉冲激光输入，以将圆偏振激光脉冲提供到电光调制器eom(例如普克尔斯盒)530中。如果pbs 520反射激光脉冲，则激光脉冲引入接收器560。电光调制器530由波形驱动器驱动。电光调制器的调制输出由第二pbs 550根据其各自的偏振态分束为输出1和输出2。
27.eom调制波形由波形驱动器540生成。波形驱动器包括定制电路以锁定激光器并生成锁相信号，并能够将信号步进相移至驱动变压器的射频功率放大器，从而为eom提供交流电压。在一个实施例中，代表eom调制波形的正弦波形表示为：
[0028][0029]
其中，v
p
是波形的幅度或“峰值幅度”；f是频率，单位为赫兹；是相位，单位为弧度。
[0030]
代表脉冲激光器的周期性脉冲序列表示为：
[0031][0032]
其中，t
s
为绕延迟环路的脉冲周期。这表明系列激光脉冲在t＝0、t＝t
s
、t＝2t
s
、
……
时到达。此时，eom驱动正弦波的相位与该值有关，且由f定义。eom上的电压仅在eom材料(晶体)中存在激光脉冲的瞬间相关。这意味着正弦波形上的电压仅在时刻t＝0、t＝t
s
、t＝2t
s
、
……
时相关。因此，驱动电压是在这些瞬时时刻计算的正弦方程，而此时，驱动电压看起来像离散时间采样信号：
[0033][0034]
当正弦波形与连续延迟脉冲同步时，f＝1/t
s
＝幅度减小的系列脉冲的重复频率。系列脉冲的减小幅度可通过改变eom驱动器的相位进行调整。
[0035]
本发明通过生成一系列幅度减小的脉冲，然后利用已知的脉冲强度、测试样本上的位置和测得的荧光量来拼合最终的高动态范围图像，从而克服了传统检测/数字化系统在动态范围方面的局限性。因此，本发明的实施例体现了对现有显微成像技术的显着改进。
[0036]
虽然本发明已经对数个所述实施例进行了非常详细和专门的描述，但是，其并非旨在局限于任何此类特例或实施例或任何特定实施例，而应当解释为结合所附权利要求在现有技术领域对此类权利要求进行尽可能地解释，从而有效地涵盖本发明的预期范围。
[0037]
尽管本文提及了与显微镜的特定实施例一起使用的特定参数，但是应当理解，本发明并不限于与这些特定实施例一起使用的任何特定参数。本文中所引用的所有实例和条件性用语均出于教导性目的，旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为推动现有技术而赋予本发明的概念，而不应解释为受限于此类特别引用的实例和条件。此外，本文中所引用的原理、方面以及本发明实施例的所有陈述均旨在涵盖其结构性和功能性等效物。另外，其目的是此类等效物不仅包括现有已知的等效物，而且还包括未来开发出的等效物，例如：开发用于执行相同功能的任何元件，而不论其结构如何。