一种靶向线粒体RNA的碱基编辑系统及应用

本发明涉及基因编辑，特别涉及一种靶向线粒体rna的碱基编辑系统及应用。

背景技术：

1、线粒体是真核细胞的半自主性细胞器，拥有独立的环状基因组。线粒体基因组编码呼吸链复合物中的多种核心蛋白，其突变与多种人类遗传病和植物细胞质雄性不育密切相关。线粒体基因的表达受到多层次调控，其中rna层面的转录后修饰和碱基编辑在基因功能调控中发挥重要作用。

2、近年来，rna碱基编辑技术快速发展。基于adar2脱氨酶的repair系统和基于tada脱氨酶的rescue系统能够在rna层面实现a-to-i（相当于a-to-g）和c-to-u（相当于c-to-t）的碱基转换。这些系统通常利用cas13蛋白在向导rna（grna）引导下识别目标rna，并招募脱氨酶进行定点编辑。与此同时，基于可编程rna结合蛋白的rna编辑技术也取得了重要进展。rewire系统将puf（pumilio/fbf family protein）rna结合结构域与人源adar脱氨酶或apobec3a 脱氨酶融合，构建了无需向导rna的单蛋白rna a-to-i和c-to-u碱基编辑器。其后续研究进一步优化了cu-rewire系统。需要指出的是，上述rewire及其衍生系统主要靶向动物细胞的细胞质或细胞核内的mrna，尚未有将其与细胞器定位肽组合用于线粒体或叶绿体rna编辑的实验报道。

3、此外，基于ppr（pentatricopeptide repeat）蛋白的细胞器rna编辑技术也取得了重要进展。ppr蛋白是植物中天然存在的rna结合蛋白家族，其rna识别特异性由每个重复单元中第5位和第35位氨基酸决定（即"ppr密码"）。研究者通过工程化改造ppr蛋白并将其与具有胞嘧啶脱氨酶活性的dyw结构域融合，构建了多种不依赖向导rna的细胞器rna c-to-u编辑工具。

4、然而，现有细胞器rna编辑工具仍存在以下不足：第一，cas13类系统依赖外源向导rna，而向导rna难以进入线粒体，导致该系统无法直接用于线粒体rna编辑；第二，ppr-dyw类系统虽然解决了向导rna递送问题并实现了线粒体和叶绿体的c-to-u编辑，但其编辑类型仅限于c-to-u，无法实现a-to-i编辑，而a-to-i编辑在线粒体rna研究中同样具有重要价值；第三，rewire及其衍生系统虽然利用puf实现了a-to-i和c-to-u编辑，但其应用范围局限于细胞质和细胞核内的mrna，尚未有具体实施方案和实验验证将其拓展至细胞器rna编辑；第四，线粒体dna编辑工具如ddcbe和taled作用于dna而非rna，无法用于研究rna层面的转录后调控。

5、因此，亟需一种不依赖向导rna、既能实现a-to-i编辑又能实现c-to-u编辑、且能够在线粒体中发挥作用的rna碱基编辑系统。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种靶向线粒体rna的碱基编辑系统及应用。本发明利用puf（pumilio/fbf family protein）rna结合结构域替代cas13-grna体系，将脱氨酶直接招募至线粒体目标rna附近，通过蛋白质-rna直接识别实现靶向编辑，从而克服grna无法进入线粒体的技术瓶颈。

2、本发明提供一种靶向线粒体rna的碱基编辑系统，包括融合蛋白，所述融合蛋白包括线粒体定位信号肽（mts）、puf rna结合结构域和rna脱氨酶结构域；

3、所述线粒体定位信号肽的氨基酸序列如seq id no:1所示。

4、线粒体定位信号肽并非仅发挥将融合蛋白导入线粒体的单一定位作用，而是直接影响融合蛋白在细胞内的定位效率、线粒体内富集程度以及puf rna结合结构域和rna脱氨酶结构域的功能发挥。本技术采用如seq id no:1所示的线粒体定位信号肽，将其与pufrna结合结构域及rna脱氨酶结构域构建融合蛋白后，一方面能够有效介导融合蛋白进入线粒体，另一方面能够在不破坏puf对目标rna的特异性识别以及rna脱氨酶催化活性的情况下，使puf与rna脱氨酶协同定位于线粒体目标rna附近，从而实现目标rna中碱基的定点脱氨编辑。

5、在本发明中，所述puf rna结合结构域用于特异性识别线粒体目标rna的靶序列，所述rna脱氨酶结构域用于对所述线粒体目标rna中的目标碱基进行脱氨编辑。本技术的线粒体定位信号肽与puf rna结合结构域及rna脱氨酶结构域之间存在功能上的匹配关系。

6、在本发明中，puf结构域的rna识别特异性由每个重复单元中特定位置的氨基酸决定，特别是第12位和第 16位氨基酸。通过改变这些位置的氨基酸组合，可重新编程puf结构域对rna序列的识别特异性，使其识别任意设定的rna靶序列。

7、在一些实施方式中，所述puf rna结合结构域包括2个及以上puf重复单元，每个重复单元包含36~43个氨基酸。

8、优选地，所述puf rna结合结构域包含8个或更多个puf重复单元。根据不同靶序列按照puf识别规则调整重复单元的氨基酸组成后获得的puf变体，均在本发明保护范围内。

9、在一些实施方式中，所述puf rna结合结构域的氨基酸序列如seq id no:2所示。

10、在一些实施方式中，所述rna脱氨酶结构域为腺苷脱氨酶或胞苷脱氨酶。

11、在一些实施方式中，所述rna脱氨酶结构域为tada8e腺苷脱氨酶或其保留rna腺苷脱氨活性的变体。

12、在一些实施方式中，所述rna脱氨酶结构域的氨基酸序列如seq id no:3或seq idno:4所示。

13、在一些实施方式中，所述线粒体定位信号肽、puf rna结合结构域和rna脱氨酶结构域之间通过连接肽连接；

14、所述连接肽为柔性连接肽、刚性连接肽或柔性连接肽与刚性连接肽的组合，所述连接肽包括2～50个氨基酸。

15、优选地，所述连接肽长度为2~7个氨基酸，更优选地，所述连接肽的序列为vdtgngs。

16、在一些实施方式中，所述融合蛋白的结构排列为：

17、线粒体定位信号肽-puf rna结合结构域-rna脱氨酶结构域；

18、或者，

19、线粒体定位信号肽-rna脱氨酶结构域-puf rna结合结构域。

20、在本发明中，线粒体定位信号肽优选位于n端以利于线粒体导入。

21、本发明还提供一种对线粒体rna进行定点碱基编辑的方法，包括如下步骤：

22、（1）确定线粒体目标rna及待编辑碱基，并确定所述待编辑碱基为腺苷或胞苷；

23、（2）根据所述线粒体目标rna中的靶序列设计puf rna结合结构域；

24、（3）当所述待编辑碱基为腺苷时，选择腺苷脱氨酶作为rna脱氨酶结构域；

25、或者，当所述待编辑碱基为胞苷时，选择胞苷脱氨酶作为rna脱氨酶结构域；

26、（4）将所述线粒体定位信号肽、所述puf rna结合结构域和所述rna脱氨酶结构域连接形成融合蛋白；

27、（5）将编码所述融合蛋白的核酸分子导入宿主细胞或生物体中，对所述目标碱基进行编辑；

28、所述线粒体定位信号肽的氨基酸序列如seq id no:1所示。

29、在一些实施方式中，所述腺苷脱氨酶的氨基酸序列如seq id no:3所示；

30、所述胞苷脱氨酶的氨基酸序列如seq id no:4所示。

31、本发明还提供一种核酸分子，编码所述的融合蛋白。

32、本发明还提供一种表达载体，包含所述的核酸分子，所述载体为植物表达载体、哺乳动物表达载体或昆虫细胞表达载体。

33、本发明还提供一种宿主细胞，含有所述的表达载体，所述宿主细胞为植物细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞。

34、本发明还提供所述的碱基编辑系统在线粒体rna编辑、线粒体基因功能研究、植物细胞质雄性不育调控或作物性状改良中的应用。

35、本发明还提供一种试剂盒，包含所述的融合蛋白或所述的核酸分子。

36、综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

37、（1）本发明以puf rna结合结构域作为通用靶向模块，通过模块化更换rna脱氨酶，在相同的puf靶向架构下分别实现a-to-i和c-to-u两种rna碱基编辑。其中，采用tada8e作为rna脱氨酶可实现a-to-i编辑，采用tada8e-cmax作为rna脱氨酶可实现c-to-u编辑。由此，在无需改变puf靶向模块的情况下，仅通过替换效应模块即可实现不同类型的rna碱基编辑，相较于仅能够实现特定类型碱基编辑的细胞器rna编辑系统，具有更强的功能拓展能力。

38、（2）本发明采用特定的线粒体定位信号肽、puf rna结合结构域、连接肽和rna脱氨酶结构域组成模块化融合体系，各功能模块分别承担线粒体定位、rna靶向和碱基编辑功能，并可根据目标rna及所需编辑类型对相应模块进行选择或替换，从而构建不同的线粒体rna碱基编辑系统。进一步地，puf结构域相较于高度重复的rna结合蛋白模块具有较明确的序列设计规则，其重复单元可根据目标rna序列进行定制，有利于不同靶序列编辑系统的构建；同时，puf重复单元序列的重复性相对较低，有利于基因序列的设计与合成。

39、（3）本发明利用puf rna结合结构域直接识别目标rna，无需额外引入或共表达grna，从而避免了向导rna进入线粒体所面临的递送限制。同时，puf rna结合结构域具有明确的rna识别规则，可根据目标rna序列选择相应的puf重复单元进行组合，从而获得针对不同线粒体rna靶序列的识别能力。因此，本发明将rna靶向和碱基编辑整合于同一融合蛋白中，具有较强的靶向可编程性。

40、（4）本发明作用于rna层面，通过对线粒体rna中的特定碱基进行脱氨编辑实现目标转录本的定点改变，而无需直接改变线粒体dna序列。因此，可将本发明用于植物线粒体rna的定点编辑、线粒体基因功能研究、植物细胞质雄性不育调控以及作物性状改良，为线粒体转录后调控及相关植物性状研究提供新的技术手段。