检测小分子药物与靶蛋白结合强度的方法

本发明属于生物医药，更具体地，本发明涉及一种小分子药物与靶蛋白结合强度的检测方法。

背景技术：

1、目前测定小分子药物与靶蛋白（如受体或酶）结合强度的方法有很多，其中，有两种“金标准”——表面等离子体共振（spr）与生物膜干涉技术（bli）。

2、spr的核心原理是通过检测芯片表面金属膜（金）附近折射率的变化，spr的芯片表面金膜面积小，偶联容量有限，通常需要将蛋白偶联到响应值（ru）在5000-10000 ru左右，对于50 kda靶蛋白，整张芯片通常需要50-100 ng的用量。bli的核心原理是检测光纤探针末端生物膜层厚度变化引起的干涉光谱位移，bli的探针是三维多孔生物层，虽然探针很小，但要填满多孔层达到1-3 nm位移信号，需要更高的蛋白浓度（通常10-50 µg/ml）。做8根探针的平行实验，至少需要200 µg左右。因此，这两种“金标准”都有纯化靶蛋白用量多的缺陷，且spr需要极高的仪器购置费，仪器维护费用也很高，而bli仪器购置费虽然低一些，探针成本高，且探针都是一次性使用，单次运行成本贵。

3、除了“金标准”方法外，还有光亲和标记方法、免修饰的检测方法、基于蛋白质稳定性变化的方法等。光亲和标记方法将小分子与体积庞大的光敏基团或报告标签进行连接，会改变小分子原有的结合性质，导致活性改变甚至丧失，且该过程可能会引入非特异性结合。免修饰的检测方法通过直接检测小分子结合靶蛋白后引起的靶蛋白自身物理化学性质变化，但随着小分子类型的多样性，靶蛋白的物理化学性质变化多样，无法在一个技术平台完成检测分析。基于蛋白质稳定性变化的方法是基于小分子结合靶蛋白后，通常会改变靶蛋白的热稳定性的原理而进行的，但只有那些结合后能显著改变靶蛋白构象或稳定性的靶蛋白才能被检测到，因此漏检很严重。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的是提供一种检测小分子药物与靶蛋白结合强度的方法，该方法需要用的靶蛋白用量极小、成本低。

2、实现上述发明目的的技术方案包括如下。

3、本发明提供一种检测小分子药物与靶蛋白结合强度的方法，包括以下步骤：

4、s1、使用磁珠与靶蛋白的捕获抗体进行结合后，再加入靶蛋白，得到磁珠-抗体-蛋白复合体；

5、s2、将小分子药物与核酸片段进行连接后，回收，得到偶联核酸片段的小分子药物；

6、s3、步骤s1所述磁珠-抗体-蛋白复合体与步骤s2所述偶联核酸片段的小分子药物相结合，得到小分子药物-靶蛋白结合物；

7、s4、回收步骤s3所述小分子药物-靶蛋白结合物中的核酸片段，所述核酸片段偶联有所述小分子药物；

8、s5、在步骤s4的产物中加入上游引物、下游引物和荧光标记的taqman探针，经pcr扩增，检测所述核酸片段的丰度，即可判断所述小分子药物与靶蛋白的结合强度。

9、本发明的发明人通过使小分子药物偶联上核酸分子，同时基于抗原抗体免

10、疫结合的原理，使靶蛋白的捕获抗体与靶蛋白进行结合，从而实现了小分子药物与靶蛋白的结合，回收核酸分子后，再进一步通过由根据核酸分子设计的上下游引物和探针，进行pcr扩增，然后经定量检测技术检测核酸的丰度，核酸的丰度即可反映小分子药物与靶蛋白的结合强度。

11、本发明基于ddpcr技术检测核酸的丰度，灵敏度极高，仅需要超微量（低至0.1 ng）的靶蛋白样本，即可实现检测目的，相比现有技术，样本量大大减小、成本显著降低。

12、另外，本发明的检测方法无需考虑靶蛋白的物理化学性质变化、靶蛋白的热稳定性及蛋白酶敏感性，且可以通过更换不同的核酸，达到针对明确药物靶标蛋白，筛选药物分子的目的。

1.一种检测小分子药物与靶蛋白结合强度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的检测小分子药物与靶蛋白结合强度的方法，其特征在于，步骤s2中，所述小分子药物为含nh2基团的小分子药物、含cooh基团的小分子药物或含巯基基团的小分子药物；

3.根据权利要求2所述的检测小分子药物与靶蛋白结合强度的方法，其特征在于，步骤s2中，当所述小分子药物为含nh2基团的小分子药物或含cooh基团的小分子药物时，所述核酸片段标记有nh2基团；当所述小分子药物为含巯基基团的小分子药物时，所述核酸片段标记有马来酰亚胺基团。

4.根据权利要求3所述的检测小分子药物与靶蛋白结合强度的方法，其特征在于，步骤s2中，所述小分子药物为阿霉素，所述核酸片段的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述核酸片段标记有nh2基团；步骤s5中，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述taqman探针的核苷酸序列如seq id no:4所示。

5.根据权利要求3所述的检测小分子药物与靶蛋白结合强度的方法，其特征在于，步骤s2中，所述小分子药物为硫普罗宁，所述核酸片段的核苷酸序列如seq id no:5所示，所述核酸片段标记有nh2基团；步骤s5中，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述taqman探针的核苷酸序列如seq id no:6所示。

6.根据权利要求1所述的检测小分子药物与靶蛋白结合强度的方法，其特征在于，步骤s5中，所述pcr扩增为ddpcr扩增。

7.根据权利要求1所述的检测小分子药物与靶蛋白结合强度的方法，其特征在于，步骤s1中，所述磁珠为protein a/g磁珠；

8.根据权利要求1所述的检测小分子药物与靶蛋白结合强度的方法，其特征在于，步骤s2中，所述小分子药物与核酸片段的摩尔浓度比为1：10 ~ 100。

9.根据权利要求1所述的检测小分子药物与靶蛋白结合强度的方法，其特征在于，步骤s3中，所述偶联核酸的小分子药物与所述磁珠-抗体-蛋白复合体的摩尔体积比为0.1~50pmol：10ul。

10.根据权利要求1所述的检测小分子药物与靶蛋白结合强度的方法，其特征在于，步骤s5中，所述taqman探针的荧光标记为bqh1和fam。