一种抗B7H3纳米抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种抗b7h3纳米抗体及其应用。

背景技术：

1、以靶向pd-1/pd-l1和ctla-4为代表的免疫检查点阻断治疗在实体瘤的治疗中取得了不俗疗效，但仅有不到30%的 患者能够从中受益的现实表明，还存在其他免疫检查点分子介导的免疫抑制现象。b7h3（也称cd276），为一种跨膜糖蛋白，是免疫调节剂b7家族的一员，表达于apc抗原递呈细胞上。与ctla-4/pd-1主要表达在t细胞并介导后者的免疫抑制或耗竭不同，b7h3蛋白不仅诱导性表达在免疫细胞，还组成性高表达在多种肿瘤细胞和肿瘤相关脉管系统，如胶质母细胞瘤（glioblastoma，gbm）、神经母细胞瘤（neuroblastoma，nb）、非小细胞肺癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌、骨肉瘤、血液瘤和肾癌等。b7h3不仅能够激活多条信号通路直接促进肿瘤细胞恶性表型，还在肿瘤的发生、增殖、迁移等生物学进程中也发挥着重要作用。有些研究显示b7h3在多种自身免疫性疾病中起到重要作用，如红斑狼疮、脓毒症、关节炎、胰腺炎和i型糖尿病。

2、传统单克隆抗体更容易受到化学处理因素造成的抗原表位丢失，相比较，羊驼抗体的变形温度可以达到60-80℃。同时，传统单抗为了保障生产中正确的结构折叠和糖基化等翻译后修饰，较多采用哺乳动物细胞株进行生产，故生产成本高昂，耗时很长。非全人源的单克隆抗体的免疫原性较大。

3、b7h3蛋白在肿瘤组织及肿瘤相关脉管组织高表达而在正常组织低表达或不表达的特性，使其成为car-t细胞设计的理想肿瘤抗原靶标，目前在研的靶向b7h3的car-t细胞临床试验项目显示靶向b7h3的car-t细胞在多种实体瘤和血液瘤中显示出强大的抗肿瘤活性，且未检测到明显毒性，其中一种b7h3-car-t细胞（taa-06）已经获得fda治疗神经母细胞瘤孤儿药资格认定。

4、有研究显示联合阻断b7h3和pd-l1可显著增加肿瘤抗原特异性cd8+t细胞抗肿瘤效应 。ⅰ期临床试验结果显示，依诺布利妥单抗联合ctla-4抗体或pd-1抗体治疗较单独任何一种抗体药物都更有效，两者联合治疗显著提升til的瘤内募集和抗肿瘤活性，且未见剂量依赖毒性和严重不良反应。依诺布利妥单抗联合帕博利珠单抗在初发性/转移性非小细胞肺癌和复发性/转移性头颈鳞状细胞癌患者中的总反应率分别可达36%和33%。

5、纳米抗体（vhh）与普通抗体vh具有相同的结构域，即4个保守框架区（fr1/2/3/4）和3个互补决定区（cdr1/2/3）。纳米抗体分子量仅为传统抗体的10%，保留了hcabs完整的抗原结合能力，特异性强、亲和性好、稳定性高的特点。由于纳米抗体不具有fc段，无法像传统抗体那样产生adcc/cdc等细胞毒作用，因此也常将vhh抗体与fc段融合表达，构建fc-vhh融合抗体以增加adcc（抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）和cdc（补体依赖的细胞毒作用，complement dependentcytotoxicity）活性。与普通抗体相比，这些形式的纳米抗体可广泛应用于各种疾病治疗。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种抗b7h3纳米抗体。

2、本发明第二方面的目的，在于提供一种融合抗体。

3、本发明第三方面的目的，在于提供与本发明第一方面的抗b7h3纳米抗体或本发明第二方面的融合抗体相关的生物材料。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种免疫缀合物。

5、本发明第五方面的目的，在于提供一种药物。

6、本发明第六方面的目的，在于提供本发明第一方面的抗b7h3纳米抗体、本发明第二方面的融合抗体、本发明第三方面的生物材料、本发明第四方面的免疫缀合物或本发明第五方面的药物的应用。

7、本发明第七方面的目的，在于提供一种试剂盒或药盒。

8、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

9、本发明的第一个方面，提供一种抗b7h3纳米抗体，所述抗b7h3纳米抗体包括互补决定区cdr，所述互补决定区cdr包括互补决定区cdr1、互补决定区cdr2和互补决定区cdr3，其中，

10、所述抗b7h3纳米抗体的互补决定区cdr1、互补决定区cdr2和互补决定区cdr3的氨基酸序列依次如seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21所示。

11、在本发明一些实施方式中，所述的cdr1、cdr2和cdr3由vhh链的骨架区fr1、fr2、fr3和fr4所隔开。

12、在本发明一些实施方式中，所述抗b7h3纳米抗体的氨基酸序列如seq id no:17所示或与seq id no:17所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。

13、本发明的第二个方面，提供一种融合抗体，包括第一结构域和第二结构域；

14、所述第一结构域为本发明第一方面的抗b7h3纳米抗体；

15、所述第二结构域具有延长体内半衰期作用和/或对效应细胞具有结合作用。

16、在本发明一些实施方式中，所述第二结构域包括（但不限于）：

17、免疫球蛋白fc区（如人免疫球蛋白fc区）；和/或

18、血清白蛋白（如人源的hsa）或其片段、结合血清白蛋白的结构域（如抗血清白蛋白抗体，包括纳米抗体）、聚乙二醇、聚乙二醇-脂质体复合体，或其组合；和/或

19、对t细胞表面分子具有亲和力和/或能够与t细胞上存在的表面分子（如cd3）结合的分子。

20、在本发明一些实施方式中，所述人免疫球蛋白fc区中包括用于改变fc介导的效应功能的突变，所述效应功能包括cdc活性、adcc活性、adcp活性中的一种或多种的组合。

21、在本发明一些实施方式中，所述免疫球蛋白为选自igg、iga1、iga2、igd、ige、igm中的一种或多种的组合。

22、在本发明一些实施方式中，所述igg选自igg1、igg2、igg3或igg4亚型中的一种或多种的组合。

23、在本发明一些实施方式中，所述免疫球蛋白fc区的氨基酸序列如seq id no:56；或与seq id no:56所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。

24、在本发明一些实施方式中，所述第一结构域连接在第二结构域n端或c端。

25、在本发明一些实施方式中，所述第一结构域和第二结构域铰链连接（如抗b7h3纳米抗体与fc的铰链区直接融合）或通过连接肽连接。

26、在本发明一些实施方式中，所述连接肽为柔性linker。

27、在本发明一些实施方式中，所述柔性linker氨基酸序列包括但不限于gsas、（ggcagcgccagc）n、（ggcggcggcagc）n、（ggcggcggcggcagc）n、yapvdv、（gggs）n、（ggsg）n、（ggggs）n、（g）n，其中1≤n≤5，且n为整数。

28、在本发明一些实施方式中，所述融合抗体的氨基酸序列如seq id no:1～8。

29、本发明的第三个方面，提供与本发明第一方面的抗b7h3纳米抗体或本发明第二方面的融合抗体相关的生物材料；所述生物材料为a1）～a12）中的任一种：

30、a1）编码本发明第一方面的抗b7h3纳米抗体或本发明第二方面的融合抗体的核酸分子；

31、a2）含有a1）所述核酸分子的表达盒；

32、a3）含有a1）所述核酸分子的重组载体；

33、a4）含有a2）所述表达盒的重组载体；

34、a5）含有a1）所述核酸分子的重组微生物；

35、a6）含有a2）所述表达盒的重组微生物；

36、a7）含有a3）所述重组载体的重组微生物；

37、a8）含有a4）所述重组载体的重组微生物；

38、a9）含有a1）所述核酸分子的转基因细胞系；

39、a10）含有a2）所述表达盒的转基因细胞系；

40、a11）含有a3）所述重组载体的转基因细胞系；

41、a12）含有a4）所述重组载体的转基因细胞系。

42、在本发明一些实施方式中，所述编码本发明第一方面的抗b7h3纳米抗体的核酸分子如seq id no:18所示。

43、在本发明一些实施方式中，所述编码本发明第二方面的融合抗体的核酸分子如seq id no:9所示。

44、在本发明一些实施方式中，所述转基因动物细胞系不包含繁殖材料。

45、在本发明一些实施方式中，所述表达盒包括5’转录控制区、编码本发明第一方面融合抗体的开放阅读框、翻译控制信号、3’非翻译区（3’utr）和转录终止信号。

46、在本发明一些实施方式中，所述5’转录控制区包含启动子（可以使用通用启动子，例如病毒启动子（sv40启动子）或哺乳动物“管家”启动子）、转录起始位点、增强子和/或沉默子元件。

47、在本发明一些实施方式中，所述3’utr可以编码富含au的元件，通过3’-5’外来体途径，富含au的元件（are）是mrna稳定性的常见调节因子，并通常位于3’utr中。富含au的元件可以包含序列auuua的一个或多个重复。它还可能包含一个或多个具有序列auauau的所谓的us2b元件。

48、在本发明一些实施方式中，所述载体包括启动子，所述启动子与所述核酸分子可操作的连接。

49、在本发明一些实施方式中，所述载体独立地选自非致病性病毒载体和病毒载体。

50、在本发明一些实施方式中，所述病毒性载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、反转录病毒载体、痘病毒载体、仙台病毒载体、单纯疱疹病毒载体中至少一种。

51、在本发明一些实施方式中，所述非病毒载体包括质粒载体、阳离子多聚物载体、壳聚糖、聚乙烯亚胺、纳米颗粒载体、脂质体中的至少一种。

52、在本发明一些实施方式中，所述载体为质粒载体、噬菌粒、病毒载体、细胞载体、噬菌体、黏粒、f黏粒、人工染色体。

53、在本发明一些实施方式中，所述质粒载体可以是任选的质粒，所述病毒载体可以任选的病毒。

54、在本发明一些实施方式中，所述的重组表达载体以pet-28a（+）作为原始表达载体。

55、在本发明一些实施方式中，所述细胞包括原核细胞、真核细胞；所述细胞非植物或动物新品种。

56、在本发明一些实施方式中，所述原核细胞包括大肠杆菌、链霉菌、枯草芽孢杆菌等本领域熟知的能够用于表达目的蛋白的细菌。

57、在本发明一些实施方式中，所述真核细胞包括酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞中的至少一种。

58、本发明的第四个方面，提供一种免疫缀合物，包括：

59、（a）本发明第一方面的抗pd-l1纳米抗体或本发明第二方面的融合抗体；以及

60、（b）与（a）连接（包括但不限于共价连接、偶联、附着、吸附）的功能性分子。

61、在本发明一些实施方式中，所述（b）包括细胞毒素、放射性同位素、生物活性蛋白质、靶向肿瘤表面标志物的分子、抑制肿瘤的分子、靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物、基于嵌合抗原受体技术的胞外铰链区、跨膜区（如cd8或cd28的跨膜区）及胞内信号区（如cd3ζ链，fcεriγ酪氨酸激活基序，共刺激信号分子cd27、cd28、cd137、cd134、myd88、cd40等的胞内信号区），或其组合。

62、在本发明一些实施方式中，所述靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体。

63、在本发明一些实施方式中，所述抑制肿瘤的分子是抗肿瘤的细胞因子（如il-12、il-15、ifn-beta、tnfalpha）或抗肿瘤的毒素。

64、在本发明一些实施方式中，所述可检测标记物选自放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质，或其任意组合。

65、在本发明一些实施方式中，所述（b）选自：荧光物质、化学发光标记物、有色物质、放射性同位素、mri（磁共振成像）或ct（电子计算机x射线断层扫描技术）造影剂或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子（如il-2等）、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂（例如，顺铂）或任何形式的纳米颗粒等。

66、本发明的第五个方面，提供一种药物，包括本发明第一方面的抗b7h3纳米抗体、本发明第二方面的融合抗体、本发明第三方面的生物材料或本发明第四方面的免疫缀合物。

67、在本发明一些实施方式中，所述的药物中还包括药学上可接受的辅料。

68、在本发明一些实施方式中，所述药学可接受的辅料包括填充剂、崩解剂、稀释剂、分散剂、赋形剂、稳定剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助溶剂、助悬剂、溶剂、缓释剂、乳化剂、吸收促进剂、表面活性剂、防腐剂、色素、香精和溶剂中的至少一种。

69、在本发明一些实施方式中，所述药物还包括联用药物，包括但不限于免疫效应分子，细胞，细胞毒性物质，多激酶抑制剂。

70、本发明的第六个方面，提供本发明第一方面的抗b7h3纳米抗体、本发明第二方面的融合抗体、本发明第三方面的生物材料、本发明第四方面的免疫缀合物或本发明第五方面的药物在（1）～（4）中任一项中的应用：

71、（1）制备用于诊断、治疗或预防癌症的制剂、试剂盒或药盒；

72、（2）制备用于治疗或预防自身免疫性疾病的制剂或药盒；

73、（3）定量/定性检测b7h3表达量；

74、（4）制备定量/定性检测b7h3表达量的试剂/试剂盒。

75、亦可用于靶向递送传统化疗药物（中药单体，microrna等）。

76、在本发明一些实施方式中，（1）中所述癌症包括：胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠癌、黑色素癌、卵巢癌、骨肉瘤、神经母细胞瘤、血液瘤和肾癌中至少一种。

77、在本发明一些实施方式中，（2）中所述自身免疫性疾病包括红斑狼疮、脓毒症、关节炎、胰腺炎和i型糖尿病中至少一种。

78、在本发明一些实施方式中，（4）中所述试剂盒/试剂盒包括用于免疫印记、酶联免疫反应、流式细胞检测计数的试剂。

79、本发明的第七个方面，提供一种试剂盒或药盒，包括本发明第一方面的抗b7h3纳米抗体、本发明第二方面的融合抗体、本发明第三方面的生物材料、本发明第四方面的免疫缀合物或本发明第五方面的药物。

80、在本发明一些实施方式中，所述试剂盒可用于免疫印记、酶联免疫反应、流式细胞检测计数。

81、本发明的有益效果是：

82、本发明通过免疫羊驼获得的抗b7h3纳米抗体，亲和力高、特异性强，可用于免疫印记、酶联免疫反应试剂盒、流式细胞检测计数，也可用于肿瘤、自身免疫性疾病和慢性感染性等疾病的治疗，有开发作为免疫检查点抑制剂的潜力。