一种高活性eTranC核酸酶突变体及其筛选方法与应用与流程

本发明属于基因工程领域。具体而言，本发明涉及一种新的crispr基因编辑系统及其应用。更具体而言，本发明提供了一种转座子与crispr-cas12中间体(tranc)效应蛋白的突变体，及其高通量筛选体系和在细胞基因编辑中的应用。本发明提供了一系列相比已知的etranc具有更高编辑效率的突变体，并验证了其在真核细胞中的编辑效果。本发明还披露了rna引导的tranc核酸酶的sgrna(向导rna)结构优化方案，优化后的sgrna尤其适用于提高etranc核酸酶及其变体的基因编辑效率，可广泛应用于生物医学研究、基因治疗、农业生物技术等领域。

背景技术：

0、发明背景

1、基因组编辑技术是生命科学研究、疾病治疗及生物制造领域的核心工具，其中crispr-cas系统因操作简便、靶向性强被广泛应用，但仍存在编辑效率依赖特定pam序列、真核细胞中活性不足、脱靶风险可控性差等局限。转座子相关核酸酶因具备自主整合/切割能力，为基因编辑提供了新方向，例如tnpb蛋白通过转座子右端衍生的rna(right-endtransposon element-derived rna，rerna，也称作ωrna)引导，识别并切割被转座子相关序列(tam)包围的dna区域，从而促进同源重组修复，恢复并维持转座元件的可动性。

2、有报道表明tranc蛋白是一类兼具转座子核酸酶结构域与crispr-cas12a系统sgrna结合域的中间体蛋白，与tnpb在进化上的亲缘关系非常接近。而代表性的latranc系统可以同时使用来自crispr和转座子的rna作为引导rna，靶向切割双链dna(wo2023232109a1)。其中一种优化的etranc蛋白在真核细胞中核酸酶活性具有相对较高的基因编辑效果和低脱靶风险，且蛋白的尺寸仅为crispr-cas9蛋白尺寸的一半，可以解决基因治疗方法中载体容量低的关键问题。例如在亨廷顿病(hd)治疗相关基因编辑研究中，通过靶向亨廷顿蛋白基因(htt)中含异常cag重复序列的突变位点进行编辑，试图敲除或修正突变基因以减少致病性亨廷顿蛋白的表达。但crispr-cas系统在应用中存在脱靶效应风险较高、对htt基因特定突变位点编辑效率有限、在中枢神经系统(纹状体、大脑皮层)靶向递送效果不佳等问题，限制了其在亨廷顿病治疗中的临床应用前景。etranc蛋白借助其自身优势，可以解决上述基因治疗中所面临的问题。然而基因治疗中，仍需要通过核酸酶突变改造提升活性，实现高特异性、高效率的基因编辑，以满足临床前研究及产业化应用需求。

3、另一方面，sgrna作为rna引导的核酸酶系统中的关键组成部分，其结构直接影响与核酸酶的结合能力、靶向特异性及编辑效率。现有tranc核酸酶对应的grna骨架结构中，包含多个茎环结构(stem-loop)和内环结构(internal loop)，其中内环结构作为sgrna高级结构的重要组成部分，参与调控sgrna与tranc核酸酶的相互作用及sgrna的稳定性。然而，目前尚未针对sgrna骨架内环结构相关的核苷酸序列进行系统性优化，导致tranc核酸酶的编辑效率难以满足实际应用需求，尤其在etranc及其变体的应用场景中，编辑效率不足的问题更为突出。亟需一种针对tranc核酸酶sgrna骨架内环结构的优化方案，通过序列优化改进sgrna的高级结构，提升其与tranc核酸酶(包括etranc及其变体)的适配性，进而提高基因编辑效率。

4、因此，开发一套可高效筛选高活性etranc突变体的体系，并获得能在原核细胞和真核细胞中均能稳定发挥高编辑效率的编辑系统etranc变体，成为突破现有基因编辑工具局限的关键。

技术实现思路

0、发明简述

1、在一个方面，本发明提供一种etranc效应蛋白突变体，其中所述突变体相对于seqid no：1所示的etranc效应蛋白包含n109c和a76t的氨基酸取代，所述氨基酸位置参考seqid no:1，其中所述突变体的氨基酸序列与seq id no:1具有至少90%相同性，其中所述etranc蛋白突变体相对于seq id no：1所示的etranc效应蛋白具有提高的基因编辑效率。

2、在一个方面，本发明提供一种etranc效应蛋白突变体，其中所述突变体相对于seqid no：1所示的etranc效应蛋白在选自第52、55、65、75、76、77、78、81、82、83、87、88、90、91、92、93、94、96、97、99、100、101、102、107、108、109、110、111、112、114、115、116、118、120、127、133、135、146、186、202、203、211、222、224、294、313、346、347、349、353、357、389、401、403、404、405、445、462、493、497、500、504、510、540、541、542、543、544、546、547、548、549、550、551、552、553、554、557、558、560、562、563、564、或565位的一个或多个位置具有氨基酸取代，所述氨基酸位置参考seq id no:1。

3、在一个方面，本发明提供一种融合蛋白，其中所述融合蛋白包括本发明所述的etranc蛋白突变体的结构域和额外的功能结构域。

4、在一个方面，本发明提供一种经修饰的sgrna分子，其中所述经修饰的sgrna分子包括骨架序列和靶向序列，其中所述骨架序列相对于seq id no：31所示的骨架序列具有如下一项或多项改变或修饰，所述碱基位置参考seq id no:31：

5、i) 相对于seq id no：31，缺失第89-94位碱基(对应于sg1)；

6、ii) 相对于seq id no：31，缺失第89-94位和第127位碱基(对应于sg2)；

7、iii) 相对于seq id no：31，缺失选自第93位、94位、95位中的任意一个c碱基(对应于sg3)；

8、iv) 相对于seq id no：31，缺失第86-91位、第128位和第129位碱基(对应于sg4)；

9、v) 相对于seq id no：31，在第26、27位之间插入c碱基(对应于sg5)；

10、vi) 相对于seq id no：31，第37和38位碱基替换为ca(对应于sg6)；

11、vii) 相对于seq id no：31，缺失第37-41位和54-60位碱基(对应于sg7)；

12、viii) 相对于seq id no：31，缺失第35-41位和第54-60位碱基(对应于sg8)；

13、ix) 相对于seq id no：31，第74-78位碱基替换为ccacc(对应于sg9)。

14、在一个方面，本发明提供一种用于对细胞基因组中靶核酸序列进行定点修饰的基因编辑系统，其中所述系统包括

15、a) 本发明所述的etranc蛋白突变体或者编码所述etranc蛋白突变体的一种或多种核苷酸序列的表达构建体，以及

16、b) 至少一种grna，或者编码所述至少一种grna的核苷酸序列的表达构建体；

17、所述grna能够结合本发明所述的etranc蛋白突变体。

18、在一个方面，本发明提供一种用于对细胞中目的序列进行定点修饰的基因编辑系统，其中所述基因编辑系统包含：

19、a) 本发明所述的sgrna，或者编码所述sgrna的核苷酸序列的表达构建体，和

20、b) sgrna引导的核酸酶或含有sgrna引导的核酸酶的结构域的融合蛋白，或包含编码sgrna引导的核酸酶或含有sgrna引导的核酸酶的结构域的融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体。

21、在一个方面，本发明提供一种组合物，其包含：

22、(i)蛋白组分，其为本发明所述的etranc蛋白突变体或所述的融合蛋白，或者编码本发明所述的etranc蛋白突变体或所述的融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体；

23、(ii)核酸组分，其为至少一种grna，或者编码所述至少一种grna的核苷酸序列的表达构建体，所述至少一种grna能够结合本发明所述的etranc蛋白突变体；

24、所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。

25、在一个方面，本发明提供一种组合物，其包含：

26、(i)核酸组分，其为本发明所述的sgrna分子，或者编码所述sgrna分子的核苷酸序列的表达构建体；

27、(ii)蛋白组分，其为sgrna引导的核酸酶或含有sgrna引导的核酸酶的结构域的融合蛋白，或者编码sgrna引导的核酸酶或含有sgrna引导的核酸酶的结构域的融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体；

28、所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。

29、在一个方面，本发明提供本发明所述的etranc蛋白突变体、融合蛋白、sgrna分子、多核苷酸、表达构建体、基因编辑系统、组合物或宿主细胞在细胞中基因编辑、基因靶向或基因切割中的用途；或者，在制备用于基因编辑、基因靶向或基因切割的试剂或试剂盒中的用途。

30、在一个方面，本发明提供本发明所述的etranc蛋白突变体、融合蛋白、sgrna分子、多核苷酸、表达构建体、基因编辑系统、组合物或宿主细胞在选自如下任一或任意几种中的用途：靶向和/或编辑靶核酸分子；切割双链dna、单链dna或单链rna；非特异性切割和/或降解侧枝核酸；非特异性的切割单链核酸；核酸检测；特异性地编辑双链核酸；碱基编辑双链核酸；碱基编辑单链核酸；靶向插入核酸片段；靶向删除核酸片段。

31、在一个方面，本发明提供本发明所述的etranc蛋白突变体、融合蛋白、sgrna分子、多核苷酸、表达构建体、基因编辑系统、组合物或宿主细胞在制备用于在对象中治疗基因疾病的药物中的用途。

32、在一个方面，本发明提供一种产生经遗传修饰的细胞的方法，包括将本发明所述的etranc蛋白突变体、融合蛋白、sgrna分子、多核苷酸、表达构建体、基因编辑系统、组合物导入所述细胞。

33、在一个方面，本发明提供一种修饰目的dna序列的方法，该方法包括将本发明所述的etranc蛋白突变体、融合蛋白、sgrna分子、多核苷酸、表达构建体、基因编辑系统、组合物或宿主细胞递送到所述目的dna序列或含有该目的dna序列的细胞中。

34、在一个方面，本发明提供一种提升植物基因编辑效率的方法，其包括：

35、s1：构建含有编辑工具的表达构建体；

36、s2：将表达构建体转化至植物受体材料；

37、s3：对转化后的植物材料进行培养；

38、s4：获得编辑后的植物材料。

39、其中，所述s1中的含有编辑工具的表达构建体包括编码本发明所述的etranc蛋白突变体、融合蛋白、sgrna分子、或基因编辑系统的核苷酸序列。

40、在一个方面，本发明提供一种组合物或基因编辑系统在制备用于在对象中治疗基因疾病的药物中的用途，所述组合物或基因编辑系统包含本发明所述的etranc蛋白突变体、融合蛋白、sgrna分子、多核苷酸、表达构建体、基因编辑系统、组合物或宿主细胞。

41、在一个方面，本发明提供一种用于在对象中治疗基因疾病的药物组合物，其中所述药物组合物包括本发明所述的etranc蛋白突变体、融合蛋白、sgrna分子、多核苷酸、表达构建体、基因编辑系统、组合物或宿主细胞，以及药学上可接受的赋形剂。