一种连翘来源外泌体样纳米颗粒及其制备方法、应用

本发明涉及生物制品，尤其涉及一种连翘来源外泌体样纳米颗粒及其制备方法、应用。

背景技术：

1、脓毒症是一种综合征，其特征是由于机体对感染失控的反应所导致的全身性炎症反应和器官功能障碍。这种失调的反应可导致心脏、肾脏、肺和其他器官的损伤及衰竭。脓毒症是全球范围内导致死亡的主要原因之一。据统计，2017年确诊为脓毒症的人数接近4900万，相关死亡人数约为1100万，约占当年死亡总数的20%。

2、脓毒症心肌病（sepsis-induced cardiomyopathy，sicm）是脓毒症常见的并发症，表现为一种由脓毒症诱发的急性但可逆的心脏病。脓毒症心肌病在早期可在7-10天内缓解，约影响40%的脓毒症患者。其主要病理特征是左心室和/或右心室收缩与舒张功能障碍、左心室输出量减少以及射血分数降低。其核心病理机制涉及过度的炎症因子释放所引发的细胞因子风暴、心肌细胞凋亡与焦亡、线粒体功能障碍以及氧化应激失衡等。若未及时干预，患者病情会进行性恶化，导致脓毒性休克，进而引发全身性器官功能障碍和衰竭，死亡率可高达70%-90%。目前，临床治疗在疾病早期主要采用液体复苏和抗生素治疗等支持性疗法；然而，仍缺乏能够直接对抗心肌细胞炎症损伤、修复亚细胞器功能且具有良好心脏靶向性的特异性治疗药物。中药连翘具有清热解毒，消肿散结，疏散风热的功效，归肺、心、小肠经。现代药理学研究显示连翘抗炎作用确切。但传统研究多聚焦于连翘苷、连翘酯苷a等小分子化学成分。然而，近年研究显示，植物细胞能够分泌一类携带蛋白质、核酸及脂质的天然纳米囊泡，被称为中草药囊泡或植物外泌体样纳米颗粒。这类囊泡的生物学效应往往有别于单一小分子提取物，容易被生物体吸收，可以作为生物治疗剂和药物递送载体，有助于解决许多活性成分生物利用度差的问题。与其他来源的纳米递送系统相比，植物来源的外泌体样纳米颗粒具有更高的生物相容性，在跨越生物屏障、靶向特定器官方面展现出巨大潜力。这为开发针对脓毒症心肌病等急性炎症性器官损伤的天然生物治疗剂提供了新的物质基础。

3、然而，截至目前，尚无任何现有技术公开从连翘中成功分离纯化出高纯度、具有完整生物活性的外泌体样纳米颗粒，并明确其在脓毒症心肌病模型中的保护作用。

技术实现思路

1、针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种连翘来源外泌体样纳米颗粒及其制备方法、应用。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、第一方面，本申请公开了一种连翘来源外泌体样纳米颗粒的制备方法，包括：

4、将清洗晾干的连翘叶与预冷的磷酸盐缓冲液按照1:1比例混合，并进行破壁处理，得到提取液；

5、将所述提取液进行过滤，得到滤液；

6、将所述滤液进行梯度离心，得到富集外泌体样纳米颗粒组分的沉淀；

7、将所述沉淀进行重悬后，采用蔗糖密度梯度离心法进行提纯，收集30%~40%蔗糖浓度层级区间的层级液体；

8、将所述层级液体进行洗涤和离心，得到连翘来源外泌体样纳米颗粒。

9、进一步的，所述提取液进行过滤的滤网目数为100目。

10、进一步的，所述滤液进行梯度离心的步骤包括：

11、将所述滤液在4℃下，依次进行500×g离心10分钟、2000×g离心20分钟以及10000×g离心40分钟，分别去除活细胞、死细胞及细胞碎片、凋亡小体与大微囊泡，得到上清液；

12、将所述上清液在4℃下进行150000×g超速离心90分钟，收集富集外泌体样纳米颗粒组分的沉淀。

13、进一步的，采用蔗糖密度梯度离心法进行提纯的步骤包括：

14、向离心管中依次加入不同浓度的蔗糖溶液，形成不连续密度梯度体系；

15、将重悬后的沉淀加入所述不连续密度梯度体系的最上层，并在4℃下进行150000×g超速离心90分钟；

16、收集30%~40%蔗糖浓度层级区间的层级液体。

17、进一步的，所述不同浓度的蔗糖溶液的浓度分别为40%、30%、20%、10%、5%。

18、第二方面，本申请公开了一种连翘来源外泌体样纳米颗粒，由上述的方法制备得到。

19、第三方面，本申请公开了连翘来源外泌体样纳米颗粒在制备用于脓毒症心肌病预防或治疗的产品中的应用。

20、进一步的，所述产品为食品、保健品、药物。

21、进一步的，所述产品为药物时，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

23、本申请提供了一种从连翘叶中提取外泌体样纳米颗粒的方法，并首次揭示了连翘来源外泌体样纳米颗粒在预防或治疗脓毒症心肌病方面的显著应用价值。实验结果表明，连翘来源外泌体样纳米颗粒能够有效缓解脓毒症心肌病小鼠的体重下降，显著降低血清中心肌损伤标志物的水平。同时，它还能有效改善受损心脏的收缩与舒张功能，并减轻受损心脏的病理损伤。综上，本申请为开发防治脓毒症心肌病的新型药物提供了重要的实验依据和新的思路。

1.一种连翘来源外泌体样纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的一种连翘来源外泌体样纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述提取液进行过滤的滤网目数为100目。

3.根据权利要求1所述的一种连翘来源外泌体样纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述滤液进行梯度离心的步骤包括：

4.根据权利要求1所述的一种连翘来源外泌体样纳米颗粒的制备方法，其特征在于，采用蔗糖密度梯度离心法进行提纯的步骤包括：

5.根据权利要求4所述的一种连翘来源外泌体样纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述不同浓度的蔗糖溶液的浓度分别为40%、30%、20%、10%、5%。

6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到的连翘来源外泌体样纳米颗粒。

7.根据权利要求6所述的连翘来源外泌体样纳米颗粒在制备用于脓毒症心肌病预防或治疗的产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、保健品、药物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品为药物时，所述药物还包括药学上可接受的辅料。