一种用于制备合胞病毒疫苗的纳米颗粒

本技术涉及合胞病毒，特别是涉及一种用于制备合胞病毒疫苗的纳米颗粒。

背景技术：

1、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，rsv）是一种有包膜单股负链rna病毒，属于副黏液病毒科（paramyxoviridae），肺病毒属（pneumovirus）。rsv引发的呼吸道感染对婴幼儿和老年人具有较高的感染风险。rsv的包膜由宿主细胞膜的脂质双层构成，其中嵌入的两种表面糖蛋白f蛋白和g蛋白对病毒的感染至关重要。

2、g蛋白负责帮助病毒附着到宿主细胞，主要通过与宿主细胞硫酸乙酰肝素的相互作用。根据g蛋白的差异，rsv分为两大亚型：a型和b型。f蛋白负责病毒与宿主细胞膜的融合，促使病毒rna进入宿主细胞。f蛋白在两种亚型中的同源序列为89%，远高于g蛋白的53%。这使得f蛋白成为疫苗研发的主要候选抗原。

3、f蛋白是一种三聚体糖蛋白，介导病毒进入宿主细胞。单体前体肽链被称为f0，其含有n-末端的信号肽序列（氨基酸1～25），被细分为两个主要片段，f2（氨基酸26～109）和f1（氨基酸136～524）。这两个片段由一个中间肽分隔，命名为pep27，两侧有两个furin位点。在c末端还有一个跨膜域（氨基酸525～550）和胞内段（氨基酸551～574）。在成熟过程中，f0通过两个furin位点的蛋白水解性切割而被激活，导致pep27的去除。f1和f2仍然由两个二硫键结合在一起（图1）。

4、在f1蛋白n末端存在有一段高疏水性的融合肽fp，其位于蛋白的疏水腔中而免受外部亲水环境的影响。当f蛋白出现在病毒体表面或细胞表面时，它的结构并不稳定，而是处于一种高能级亚稳态的融合前构象。随后，f1蛋白的ｎ末端经历了剧烈的结构变化，其ｎ末端的二级结构组件α2、α3、α4和α5一同形成了一个更大的α螺旋结构，命名为七重复序列（hra）。这一系列的重排最终导致了三聚化f1蛋白n末端的fp插入到相邻细胞中，三聚体中三个hra与另一端三个七重复序列，hrb，通过ｆ蛋白的折叠，配对形成六螺旋束（6hb）。这个过程诱导了膜融合的发生，从而达到了病毒感染细胞的目的。同时，该过程还导致了f蛋白由融合前构象（prefusion f，pre-f，图2）转变为融合后构象（postfusion f，post-f，图3）。其中前融合构象包含多个重要中和抗体结合表位，是诱导高效保护性免疫应答的重要抗原形式。然而，天然rsv f蛋白前融合构象稳定性较差，易发生向后融合构象转变，从而导致抗原表位丢失，降低免疫原性。

5、关于rsv f蛋白疫苗的研究，近年来基于结构的疫苗设计取得了显著进展。2013年，mclellan等首次解析了rsv f蛋白的融合前构象（pre-f），这一突破为疫苗开发奠定了基础。通过x射线晶体学技术，他们成功确定了rsv f蛋白的三维结构，并据此设计了稳定的融合前状态蛋白ds-cav1。ds-cav1的开发引领了基于pre-f蛋白的疫苗设计潮流，成为多个疫苗候选物的核心基础。尽管ds-cav1在增强pre-f蛋白稳定性方面取得了显著进展，但在某些条件下，其稳定性不足，影响了蛋白质的长期储存和运输。随后，研究者们在此基础上开发了多种基于f蛋白的候选疫苗，包括pfizer的二价亚单位疫苗和moderna的mrna疫苗，目前已进入临床开发阶段。然而，rsv疫苗在中国尚未上市。

6、a2毒株是呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial viru，rsv）的一种经典a亚型毒株，广泛用于科研和疫苗/药物研发中。

7、d25 单克隆抗体是一种靶向呼吸道合胞病毒（rsv）融合前 f 蛋白（pre-f）特有序位 ø（site ø）的中和抗体。

8、palivizumab单克隆抗体是一种靶向呼吸道合胞病毒（rsv）融合前 f 蛋白（pre-f）和融合后特有序位 ⅱ（site ⅱ）的中和抗体。

9、ds-cav1为一种经稳定化改造的呼吸道合胞病毒（rsv）融合前f蛋白（pre-f）抗原，通过引入特定二硫键突变以提高f蛋白融合前构象的稳定性，减少其向融合后构象转变，从而维持融合前f蛋白特异性抗原表位。

10、ds-cav1可作为rsv pre-f抗原稳定化设计的阳性参考分子，用于评价工程化rsvf蛋白的构象保持能力及稳定性。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用于制备合胞病毒疫苗的纳米颗粒。

2、本发明的第一个目的是提供一种融合蛋白。

3、本发明的第二个目的是提供一种核酸分子。

4、本发明的第三个目的是提供一种生物材料。

5、本发明的第四个目的是提供一种融合蛋白组合物。

6、本发明的第五个目的是提供一种蛋白纳米颗粒。

7、本发明的第六个目的是提供一种蛋白纳米颗粒的制备方法。

8、本发明的第七个目的是提供所述蛋白纳米颗粒在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。

9、本发明的第八个目的是提供一种组合物。

10、本发明的第九个目的是提供另一种组合物。

11、本发明的第十个目的是提供所述组合物在制备合胞病毒疫苗中的应用。

12、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

13、本发明要求保护一种融合蛋白，其氨基酸序列如seq id no:4到12到任一所示。

14、其中，氨基酸序列如seq id no:7到9的重组蛋白为在氨基酸序列如seq id no:4到6的基础上c 末端加上了用于构建蛋白纳米颗粒的gv-tag；氨基酸序列如seq id no:10到12的重组蛋白为在氨基酸序列如seq id no:4到6的基础c 末端上加上了用于构建三聚体的t4 三聚化结构域（t4 trimerization domain， t4 foldon）。

15、优选地，所述氨基酸序列如seq id no:5或8到任一所示，该融合蛋白的稳定性更好。

16、本发明还要求保护一种核酸分子，编码所述融合蛋白的编码基因，或为所述编码基因的反向互补序列。

17、本发明要求保护一种生物材料，其为以下中的任意一种：

18、（1）含有所述核酸分子的表达盒；

19、（2）含有所述核酸分子或（1）中所述表达盒的重组载体；

20、（3）含有所述核酸分子、（1）中所述表达盒或（2）中所述重组载体的重组微生物；

21、（4）含有所述核酸分子、（1）中所述表达盒、（2）中所述重组载体、或（3）中所述重组微生物的细胞系。

22、本发明要求保护一种融合蛋白组合物，包括氨基酸序列如seq id no.17所示的hpf融合蛋白和氨基酸序列如seq id no.7到9任一所示的融合蛋白。

23、本发明要求保护一种蛋白纳米颗粒，利用氨基酸序列如seq id no.17所示的hpf融合蛋白和氨基酸序列如seq id no.7到9任一所示的融合蛋白自组装得到。

24、本发明要求保护一种蛋白纳米颗粒的制备方法，氨基酸序列如seq id no.17所示的hpf融合蛋白和seq id no.7到9任一所示的融合蛋白置于缓冲液孵育即得。

25、本发明要求保护所述蛋白纳米颗粒在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。

26、本发明要求保护一种组合物，含有所述融合蛋白组合物和佐剂。

27、本发明要求保护一种组合物，含有所述蛋白纳米颗粒和佐剂。

28、本发明要求保护所述组合物在制备合胞病毒疫苗中的应用。

29、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

30、本发明利用pymol和rf diffusion设计了一种rsv f蛋白抗原，其能很好地稳定在融合前构象，有利于诱导出更强的中和抗体；通过gvtagopti/sdcatcher系统（gv/sd系统，参见中国专利cn113621031a）该rsv f蛋白抗原与多聚体复合物hpf蛋白纳米颗粒自行组装，自组装组装成球状二十四聚体sp-ve-np蛋白纳米颗粒，将rsv f蛋白抗原展示在纳米颗粒的表面，能够有效地引起更强的免疫反应，产生阻止呼吸道合胞病毒入侵靶细胞的抗体。本发明的二十四聚体sp-ve-np蛋白纳米颗粒，通过多抗原展示的方式显著提高了中和抗体的滴度。通过肌肉注射和滴鼻免疫小鼠和棉鼠后发现，制备所得呼吸道合胞病毒纳米颗粒疫苗可诱导高滴度的中和抗体产生，通过肌肉注射和滴鼻接种可以保护小鼠和棉鼠免受呼吸道合胞病毒a2亚型的感染。