一种用于鉴定小管福寿螺的特定性DNA片段、产品和方法

发明领域本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种用于鉴定小管福寿螺的特定性dna片段、试剂和方法。

背景技术：

1、小管福寿螺（

pomacea canaliculata）是一种原产于南美洲的淡水蜗牛，被国际自然保护联盟列为世界100种入侵外来物种之一，同时也被列入我国首批外来入侵物种名单。福寿螺的食性是灵活的，不仅食用农作物和水生植物，还捕食小蜗牛和其他水生动物。福寿螺还具有繁殖力高、生长快、在入侵湿地缺乏有效天敌的特点，对溶解氧浓度低、养分含量高、食物供应少、温度等恶劣环境条件有很强的适应能力。福寿螺入侵对当地造成的健康、经济和环境问题是一个不可逆的过程，且大多对其有效的治理方式不但所需费用高也容易对环境产生危害。

2、入侵生物的快速识别鉴定是其早期预防、综合防控的关键。小管福寿螺与斑点福寿螺

pomacea maculata等特点相似、形态相近，仅从形态上看很容易混淆，在田间野外难以辨别。目前常用的分子鉴定标记主要是线粒体保守基因（coⅰ、16s rdna等）的特异性区段，在检测病原微生物等遗传群体复杂、进化速率快、成灾风险差异大的入侵物种时，其精准度仍然不能满足实际需求，利用基因组等多组学大数据筛选的新型标记亟待开发。

3、目前常用的分子鉴定方法主要有rapd (randomly amplified polymorphicdna)，rflp (restriction fragment length polymorphism)，aflp (amplifiedfragmentlength polymorphism)， sscp (single strand conformationpolymorphisms)，dna序列分析等。rapd技术是一种以基础的分子鉴定和遗传多态性分析的方法。该方法的优点是需要的dna样品较少，实验操作简单，周期短，可同时筛选大量样品。但由于退火温度较低，特异性较差和重复性不好。rflp技术是在聚合酶链反应（pcr）的基础上，对特异性片段进行切割，然后通过琼脂糖凝胶电泳法进行检测，其具直观、灵敏、重现性好、专属性高等特点。但由于该方法是建立在已知序列的基础上的，因此此种方法对未知序列的物种不能得到满意的结果，所以该方法也不太适合群体多态性的研究。sscp技术是通过非变性聚丙烯酰胺做介质，电泳合适大小的单链dna(ssdna)片段，然后显影观察ssdna之间的迁移率的差异。但技术可能检测不到所有的突变位点，检测结果容易受电泳温度、缓冲液组成及电泳条件等的影响。

4、综上，现有检测方法存在操作时间长、操作要求高、检测精准性差等缺点，有些检测方法价格昂贵。因此，有必要研究一种速度快、特异性高且成本低的小管福寿螺鉴定产品和方法。

技术实现思路

1、本发明的首要发明目的在于提出一种用于鉴定小管福寿螺的特定性dna片段、产品和方法，本发明解决了现有操作时间长、操作要求高、检测精准性差等缺点。

2、本发明提出包括如seq id no: 1所示的基因片段在用于鉴定小管福寿螺中的应用。

3、本发明提出一种用于鉴定小管福寿螺的产品，包括：用于检测待测样本中是否含有如seq id no: 1所示的基因片段的试剂。

4、本发明提出一种用于鉴定小管福寿螺的引物对和探针，引物对包括：核苷酸序列如seq id no: 2所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no: 3所示的下游引物；探针的核苷酸序列如seq id no: 4所示。

5、可选地，上游引物或所述下游引物的5’端或3’端连接有a，探针的5’端或3’端连接有b；其中，a、b表示不同的标记物；

6、可选的，a选自生物素或地高辛，b选自fitc。

7、本发明提出一种用于鉴定小管福寿螺的恒温扩增试剂盒，含有恒温扩增试剂和试纸条；恒温扩增试剂中含有上述引物对和探针；

8、可选地，所述恒温扩增试剂包括引物混合物和反应酶系混合物。

9、可选地，以50 μl反应体系计，引物混合物中上游引物的浓度为0.1 ~ 1 nmol/l，下游引物的浓度为0.1~ 1 nmol/l，探针的浓度为0.02 ~ 0.2 nmol/l。

10、可选地，以50 μl反应体系计，上游引物的浓度为0.2 nmol/l，下游引物的浓度为0.2 nmol/l，探针的浓度为0.06 nmol/l。

11、可选地，引物混合物中还含有a buffer和 b buffer；a buffer的体积百分比为55% ~ 60%，b buffer的体积百分比为4% ~ 6%。

12、可选地，buffer a中含有20 mm tris-hcl、150 mm kcl、5v/v%peg和1v/v%triton-x100；buffer b中含有200 mm醋酸镁。

13、可选地，反应酶系混合物中含有逆转录酶、核酸内切酶、dna聚合酶、单链dna结合蛋白和重组酶。

14、可选地，反应酶系混合物中各组分的含量为：以50 μl反应体积计，反应酶系混合物中含有重组酶520 ~ 725 ng/μl、单链dna结合蛋白100 ~ 200 ng/μl、dna聚合酶350 ~450 ng/μl、核酸内切酶300 ~ 400 ng/μl、逆转录酶480 ~ 500 ng/μl。

15、可选地，所述反应酶系混合物为冻干粉，还有冻干支持剂。

16、可选地，恒温扩增试剂盒中还包括胶体金试纸条。

17、可选地，下游引物的5’端连接有标记物a、探针的5’端连接有标记物b时，胶体金试纸条的结合垫上包被有抗标记物a的抗体-胶体金标记，胶体金试纸条的检测线内包被有抗b抗体，胶体金试纸条的质控线内包被有用于结合a的二抗。

18、可选地，下游引物的5’端连接有生物素、探针的5’端连接有fitc时，胶体金试纸条的结合垫上包被有生物素抗体-胶体金标记物，胶体金试纸条的检测线内包被有fitc抗体，胶体金试纸条的质控线内包被有用于结合生物素的二抗。

19、可选地，下游引物的5’端连接有地高辛、探针的5’端连接有fitc时，胶体金试纸条的结合垫上包被有地高辛抗体-胶体金标记，胶体金试纸条的检测线内包被有fitc抗体，胶体金试纸条的质控线内包被有用于结合地高辛二抗。

20、本发明还提出小管福寿螺的鉴定方法，采用上述恒温扩增试剂盒进行鉴定。

21、可选地，包括以下步骤：

22、在恒温扩增试剂中加入待测dna样本，恒温扩增反应后，采用试纸条显色，观察质控线与检测线判读结果；

23、可选地，在反应酶系混合物中加入待测dna样本和引物混合物，恒温扩增反应后，稀释反应产物后采用试纸条显色；若质控线与检测线均显色则为阳性；若仅质控线显色则为阴性，若质控线、检测线均未显色则为无效。

24、可选地，所述恒温扩增反应的温度为30 ~ 40℃。

25、可选地，所述恒温扩增反应的时间为10 ~ 30分钟。

26、可选地，所述稀释反应产物的稀释倍数为10 ~ 50倍，进一步为20倍。

27、本发明技术方案与现有技术相比具有如下优点：

28、本发明筛选得到一段特异性的基因组dna片段，为目标物种小管福寿螺独有，该片段区别于传统的线粒体标记，具有更高的特异性，降低了检测的假阳性率，提高了检出率和准确率，实现了在不同存活状态、标本不完整等情况下的准确检测。

29、本发明还提出一种用于鉴定小管福寿螺的试剂，基于上述特异性基因组dna片段设计。本发明采用多酶恒温扩增试纸条法（mira-lfd），采用含有dna聚合酶、单链dna结合蛋白和重组酶的3种核心物质来辅助dna扩增，短时间内达到极高检测灵敏度与特异性，适合多种样品的快速检测，所需时间小于20 min。在优选的技术方案中，通过设计带有修饰基团的引物与探针，结合三明治夹心法核酸检测试纸条，就能实现对样本中不同靶标的检测。

30、本发明的方法不需要反复变换温度，检测速度、易携性等方面比pcr有很大的优势，有着操作简单、快速、敏感性和特异性好等特点，具有良好的发展前景。