一种骨关节软骨细胞适配体、纳米颗粒的制备方法及应用与流程

本发明涉及生物，特别涉及一种骨关节软骨细胞适配体、纳米颗粒的制备方法及应用。

背景技术：

1、骨关节炎（osteoarthritis, oa）是一种以关节软骨退行性变、软骨细胞凋亡、滑膜炎症及骨质增生为主要特征的慢性退行性关节疾病，多见于中老年人，临床常表现为关节疼痛、僵硬、活动受限，严重影响患者生活质量，是导致中老年人群致残的重要原因。oa病理进程复杂，核心环节包括软骨细胞过度凋亡、细胞外基质降解、炎症因子大量释放及软骨下骨异常重塑，目前临床上缺乏根治手段，传统治疗多以抗炎镇痛为主，难以逆转软骨退变、保护软骨细胞。

2、现有 oa 治疗药物普遍存在靶向性差、软骨渗透弱、生物利用度低、全身毒副作用大等缺陷：小分子药物关节腔注射后易扩散流失、局部滞留时间短、难以在软骨深层富集；全身给药易造成肝肾毒性、消化道不良反应，且难以穿透致密软骨基质到达病变部位。近年来，纳米递送系统在 oa 靶向治疗中展现潜力，但现有载体缺乏软骨细胞特异性识别能力，难以实现精准靶向，易被滑膜、成骨细胞等非靶细胞非特异性摄取，导致治疗效率低、安全性不足。

3、然而，目前尚无特异性靶向软骨细胞、不结合滑膜成纤维细胞 / 成骨细胞、可共递送治疗药物与 aie 荧光分子的适配体修饰纳米递送系统，oa 靶向治疗仍存在显著空白。

技术实现思路

1、本发明实施例提供一种骨关节软骨细胞适配体纳米颗粒的制备方法，以解决相关技术中oa 治疗药物缺乏软骨细胞特异性靶向能力的问题。

2、第一方面，本发明提供了一种骨关节软骨细胞适配体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

3、s1，利用selex技术富集软骨细胞适配体序列，得到若干条候选适配体序列；其中，靶细胞为培养至第三代的软骨细胞，消减细胞为培养至第七代的软骨细胞；

4、s2，将候选适配体序列分别与正常大鼠软骨细胞进行孵育，挑选出对软骨细胞特异性结合的适配体c22；

5、s3，制备步骤s2挑选出的适配体c22修饰的纳米颗粒。

6、一些实施例中，所述适配体c22的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体为：5’-gcaatggtacggtacttccggcgactttctcgtctcacgcagcggcgtattcggtgttacaaaagtgcacgctactttgctaa-3’；

7、一些实施例中，步骤s1的具体过程为：配制缓冲液→孵育靶细胞→扩增结合核苷酸序列→扩增次级文库→鉴定富集文库→富集文库进行单克隆测序→分析获取核苷酸序列。

8、一些实施例中，配制的缓冲液包括：结合缓冲液：ph 7.4 pbs，包含5mmmgcl2、0.1μg/μl 酵母trna和0.1μg/μl鲑鱼精dna；洗涤缓冲液：ph 7.4 pbs，包含5mmmgcl2；凝胶洗脱缓冲液：ph8.0，包含0.5 mol/l nh4ac、0.1% sds和1mmol/l edta。

9、一些实施例中，孵育靶细胞的过程为：取用细胞计数板定量后的p3 cc 靶细胞，经洗涤缓冲液洗涤后备用；将适配体文库置于结合缓冲液中进行变性及冰水浴预处理；向预处理体系中加入 酵母trna 与鲑鱼精 dna，配制得到孵育体系，再将孵育体系与靶细胞混匀孵育；将变性后的适配体文库与消减细胞混匀孵育，离心后收集上清液，再将上清液与预处理后的靶细胞混匀孵育；孵育完成后利用洗涤缓冲液对细胞进行多次洗涤离心处理，去除上清后加入 depc 水进行加热处理，制得 pcr 扩增模板。

10、一些实施例中，扩增结合核苷酸序列的过程为：根据标准pcr反应体系进行扩增，100μl/管，利用7 m尿素8%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳确定pcr扩增的最佳循环数。

11、一些实施例中，扩增次级文库的过程为：将扩增产物经变性处理后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完成后进行核酸染色，于紫外环境下定位目标核酸条带并切取对应凝胶，切碎凝胶后加入凝胶洗脱缓冲液进行振荡洗脱；收集洗脱液后依次加入镁离子溶液、醋酸钠溶液与无水乙醇混匀进行核酸沉淀，经离心弃除上清，采用预冷乙醇洗涤沉淀并再次离心，去除上清后静置干燥，加入纯水溶解得到单链 dna，经定量后低温保存待用。

12、一些实施例中，鉴定富集文库的过程为：对特定轮次回收的适配体次级文库进行cy3 荧光标记，以该次级文库为模板，采用 cy3 标记引物经 pcr 扩增制备荧光文库并避光保存；将 p3 cc 细胞接种于共聚焦小皿培养；将荧光文库溶于缓冲液中，经变性及冰水浴预处理后，加入 酵母trna 与鲑鱼精 dna 配制得到孵育体系；用洗涤缓冲液润洗共聚焦小皿内的 p3 cc 细胞后，加入孵育体系进行孵育，通过共聚焦显微镜观察 cy3 荧光强度，完成富集文库鉴定。

13、一些实施例中，富集文库进行单克隆测序的过程为：对富集后的适配体文库进行pcr扩增，经聚丙烯酰氨凝胶电泳回收制备dsdna文库；将所述dsdna文库与t载体连接后，与感受态细胞混合，取菌液涂布于含氨苄青霉素的 lb 培养基上，经培养后挑取单菌落进行测序。

14、一些实施例中，分析获取核苷酸序列的过程为：对单克隆测序结果利用dnaman进行一级序列分析，meme在线软件进行家族分析以及rna structure进行二级结构分析，挑选出能级最低的作为候选序列。

15、一些实施例中，步骤s3的具体过程为：

16、首先将氨基修饰的软骨细胞适配体与cooh-peg2000-dspe连接，形成c22-peg2000-dspe，之后将c22-peg2000-dspe与nh2-peg2000-dspe共同溶解于pbs中，并加入含4bc荧光分子与治疗药物派立辛的四氢呋喃溶液，通过共沉淀法制备c22-peg@4bc-pa纳米颗粒。

17、一些实施例中，dspe-peg2000-c22的制备过程为：将cooh-peg2000-dspe溶解于mes缓冲液中，向溶液中依次加入edc 和sulfo-nhs，混匀后避光孵育以活化聚合物末端羧基；将活化后的 cooh-peg2000-dspe溶液转移至预先溶解有氨基修饰的适配体c22-nh2的hepes缓冲液中，混匀后避光反应；反应完成后加入 tris-hcl 缓冲液淬灭未反应的活性酯；将混合反应液转移至截留分子量为 10 kda 的超滤离心管中，经离心超滤去除小分子副产物及未反应的游离物质，收集纯化后的偶联产物，即得dspe-peg2000-c22。

18、一些实施例中，c22-peg@4bc-pa纳米颗粒的制备过程为：称取靶向聚合物dspe-peg2000-c22与常规聚合物nh2-peg2000-dspe，溶解于超纯水中经超声处理形成聚合物胶束水相；将疏水性药物派立辛pa 与荧光分子 4bc 溶解于四氢呋喃中制备有机相；在磁力搅拌条件下，将有机相匀速滴加至聚合物胶束水相中，诱导纳米颗粒初步自组装；将混合溶液经超声破碎处理形成均匀纳米乳液，敞口磁力搅拌使有机溶剂完全挥发；采用水系微孔滤膜过滤去除游离药物及大尺寸聚集体，将滤液经超滤离心管离心浓缩，收集纯化后的靶向纳米颗粒 anp 溶液并避光保存。

19、第二方面，本发明还提供了包括上述纳米颗粒的药物制剂。

20、一些实施例中，所述药物制剂用于骨关节炎靶向治疗，靶向作用于软骨细胞。

21、本发明提供的技术方案带来的有益效果包括：

22、1、本发明通过 selex 技术筛选获得特异性靶向软骨细胞、不结合滑膜成纤维细胞/成骨细胞/间充质干细胞的适配体 c22，修饰于纳米颗粒表面后，可精准识别软骨细胞膜表面 fas 蛋白，实现病变软骨组织的高效靶向富集，显著提升药物局部浓度；

23、2、本发明提供的纳米颗粒可响应 oa 关节腔弱酸微环境，表面电荷反转促进穿透致密软骨基质，直达软骨深层病变部位，克服传统药物渗透弱、滞留短的缺陷。