尼帕病毒N基因靶向Taqman探针引物组合物、试剂盒及应用

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物、试剂盒及应用。

背景技术：

1、尼帕病毒（nipah virus，niv）属于副黏病毒科亨尼帕病毒属，为不分节段单股负链rna病毒，是生物安全四级（bsl-4）病原。自1998年在马来西亚首次发现以来，已在孟加拉国、印度等国引发周期性大规模传染，病死率高达40%-75%，部分暴发中超过90%。天然宿主为狐蝠科果蝠，可通过接触感染动物、食用被污染食物或人传人途径传播。我国华南、西南地区广泛分布果蝠种群，且已检测到尼帕病毒相关抗体与核酸序列，存在自然疫源地与输入风险。

2、目前全球尚无获批的特效抗病毒药物与疫苗，早期发现、早期诊断、早期隔离是阻断尼帕病毒传播的关键。实验室检测方法主要包括三类：病毒分离培养为“金标准”，但须在bsl-4实验室操作，周期长达3-7天，无法用于快速筛查；血清学检测存在窗口期长、交叉反应强等局限；实时荧光定量pcr特异性强、灵敏度高、检测速度快，可在bsl-2实验室完成，是当前首选技术。然而，现有尼帕病毒荧光定量pcr检测方法普遍存在缺陷：引物和探针多基于少量毒株序列设计，未覆盖不同地域、不同宿主、不同年代的流行株，保守区选择缺乏充分的数据支撑，存在漏检风险。

3、此外，多数已报道的检测方法仅以标准质粒为模板进行验证，而质粒无法模拟真实临床样本的复杂场景。质粒为双链dna，而临床样本中病毒为rna，检测需经历逆转录步骤，质粒标准品完全绕过了这一环节，无法反映逆转录效率的变异。同时，质粒的超螺旋构象可导致定量结果显著高估，且其扩增效率与复杂基质中的rna模板存在实质差异；仅以质粒验证的检测方法，其灵敏度和可靠性在真实临床样本中可能大打折扣。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供一种尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物；第二目的是提供基于该尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物的试剂盒；第三目的是提供上述产品在制备检测尼帕病毒的产品以及非诊断目的的尼帕病毒检测中的应用。

2、技术方案：本发明所述的尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物，由上游引物、下游引物及taqman探针组成，可特异性识别检测序列如seq id no：1所示的尼帕病毒n基因共识保守序列。

3、优选的，所述上游引物、下游引物的熔解温度均为58~62℃，上、下游引物的熔解温度差值≤2℃，基于上、下游引物的扩增子长度为80~200 bp；所述taqman探针的熔解温度为66~72℃，探针序列中任意位置连续出现的鸟嘌呤数量≤4个。

4、优选的，所述上游引物序列如seq id no：2所示，下游引物序列如seq id no：3所示，taqman探针序列如seq id no：4所示，所述taqman探针5’端修饰荧光基团，3’端修饰淬灭基团；进一步优选的，其特征在于，所述荧光基团选自fam、hex、cy5、cy3、rox、tamra中的任一种，所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、dabcyl中的任一种。

5、本发明所述的试剂盒，含有前述的尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物。

6、优选的，所述试剂盒还包括检测所需的阳性对照品、阴性对照品和荧光定量检测试剂。

7、优选的，所述阳性对照品为含有前述尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物扩增子序列的重组质粒；所述阴性对照品为无酶无菌水。

8、本发明所述的尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物或试剂盒在制备检测尼帕病毒的产品中的应用。

9、本发明所述的尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物或试剂盒在非诊断目的的尼帕病毒检测中的应用。

10、优选的，所述应用检测的样品为动物源样品、人源样品、环境样品中的任一种；进一步优选的，所述动物源样品包括但不限于果蝠的唾液、尿液、血液或组织，猪的鼻拭子、咽拭子、血清、肺组织、肾组织或其他器官组织，以及马或其他中间宿主的相应生物样品；所述人源样品包括但不限于咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、痰液、唾液、呼吸道分泌物、组织匀浆液或细胞培养物；所述环境样品包括但不限于果蝠栖息环境的表面拭子、被果蝠污染食品以及上述样品经处理后的核酸提取物或培养物。

11、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：1、该尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物针对尼帕病毒n基因共识保守序列，可以实现不同国家来源、不同宿主来源、不同流行年代的尼帕病毒检测，反应谱广；2、基于该taqman探针引物组合物进行检测，灵敏度高，以标准质粒或模拟临床样品的rna为模板时，最低检测限均可达101copies，可用于感染早期患者低病毒载量咽拭子、蝙蝠微量组织样本、口岸低污染环境样本的检测；特异性强，与流感病毒、水泡性口炎病毒与戊型肝炎病毒样品均无交叉反应，可以降低假阳性风险；重复性好，检测结果稳定，具有优异的应用价值。

1.一种尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物，其特征在于，所述taqman探针引物组合物由上游引物、下游引物及taqman探针组成，可特异性识别检测序列如seq id no：1所示的尼帕病毒n基因共识保守序列。

2.根据权利要求1所述的尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物，其特征在于，所述上游引物、下游引物的熔解温度均为58~62℃，上、下游引物的熔解温度差值≤2℃，基于上、下游引物的扩增子长度为80~200 bp；所述taqman探针的熔解温度为66~72℃，探针序列中任意位置连续出现的鸟嘌呤数量≤4个。

3.根据权利要求2所述的尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物，其特征在于，所述上游引物序列如seq id no：2所示，下游引物序列如seq id no：3所示，taqman探针序列如seq id no：4所示，所述taqman探针5’端修饰荧光基团，3’端修饰淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物，其特征在于，所述荧光基团选自fam、hex、cy5、cy3、rox、tamra中的任一种，所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、dabcyl中的任一种。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1~4任一项所述的尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测所需的阳性对照品、阴性对照品和荧光定量检测试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有权利要求1~4任一项所述的尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物扩增子序列的重组质粒；所述阴性对照品为无酶无菌水。

8.权利要求1~4任一项所述的尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物，或权利要求5~7任一项所述的试剂盒在制备检测尼帕病毒的产品中的应用。

9.权利要求1~4任一项所述的尼帕病毒n基因靶向taqman探针引物组合物，或权利要求5~7任一项所述的试剂盒在非诊断目的的尼帕病毒检测中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用检测的样品为动物源样品、人源样品、环境样品中的任一种。