一种用于构建胆囊癌类器官的试剂组合、试剂盒、方法和应用与流程

本技术属于类器官培养，具体涉及一种用于构建纤维化胆囊癌样本来源的胆囊癌类器官的试剂组合、试剂盒、方法和应用。

背景技术：

1、胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤，绝大多数为腺癌，其中硬化型腺癌占比高达60%以上。胆囊癌起病隐匿、进展迅速，多数患者确诊时已属中晚期，对常规化疗、放疗的应答率普遍偏低，患者5年总体生存率长期徘徊在5%-15%的极低水平。其中，纤维化是胆囊癌的普遍病理属性。临床病理研究显示，胆囊癌组织中肿瘤间质比例常高达50%-80%，致密交联的胶原纤维（如i型/iii型胶原）与大量活化的癌相关成纤维细胞（caf）密集包绕癌巢，形成坚硬的组织学结构。因此，构建能够忠实保留纤维化微环境特征的胆囊癌类器官模型，对于解析癌-基质互作机制、开发基质靶向治疗策略以及建立具有临床预测价值的体外药敏平台，具有重要的科学意义与转化价值。

2、然而，纤维化胆囊癌类器官的成功构建与培养是非常困难的，这主要是源于纤维化微环境对类器官形成全过程的多维度抑制，具体的说：

3、（1）组织消化阶段的物理屏障效应。纤维化胆囊癌组织中，致密交联的胶原纤维与大量活化caf形成结构性囚笼，常规胶原酶或胰蛋白酶消化难以有效渗透至癌巢内部；而单纯延长消化时间或提高酶浓度虽可部分松解基质，却会导致癌细胞因机械剪切、酶毒性及氧化应激而大量失活。在标准消化条件下，纤维化胆囊癌组织的活细胞回收率仅为未纤维化组织的20%以下，真正具有类器官形成能力的恶性上皮细胞严重匮乏。

4、（2）培养体系中的细胞竞争与信号拮抗。即使成功获取含癌细胞的细胞团，纤维化来源的caf在标准培养条件下也表现出远强于癌细胞的增殖优势：caf迅速贴壁铺展并分泌细胞外基质，从物理空间与营养供给双重层面压制类器官形成；同时，caf通过旁分泌tgf-β、il-6等细胞因子直接抑制上皮细胞增殖并诱导其发生上皮-间质转化（emt），导致类器官形成率急剧下降。

5、（3）纤维化来源癌细胞的代谢重塑与缺氧适应性失配。长期生存于硬化微环境中的胆囊癌细胞，其代谢模式已发生显著重塑：一方面，致密基质导致的异常血管分布使癌细胞长期处于慢性缺氧状态，糖酵解途径被高度激活，线粒体氧化磷酸化功能受到抑制；另一方面，caf持续分泌乳酸、酮体等代谢副产物，进一步酸化微环境并改变营养竞争格局。标准类器官培养体系通常以常氧和富葡萄糖条件进行培养，这与纤维化肿瘤体内的缺氧、酸性、营养匮乏生态存在显著差异。在此条件下，如果不对培养体系进行针对性地优化，已适应体内缺氧微环境的胆囊癌细胞可能会因氧化应激骤增、代谢通路切换困难而发生大量凋亡，同时其干性维持信号（如hif-1α、notch通路）因氧张力不匹配而失调，导致类器官起始效率低下、传代稳定性差。

6、可以看出，纤维化胆囊癌类器官的培养困难是基质物理特性、细胞间竞争互作、代谢信号网络及细胞比例调控等多重因素交织导致的。而现有类器官培养技术多针对基质疏松、上皮细胞纯度较高的肿瘤类型（如结直肠癌）进行优化，对纤维化实体瘤的特殊需求缺乏针对性设计。因此，亟需开发一种专门针对纤维化胆囊癌组织特点设计的类器官构建试剂及方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本技术的首要目的在于提供一种用于构建胆囊癌类器官的试剂组合、试剂盒和方法，以解决纤维化胆囊癌样本来源的胆囊癌类器官培养所存在的成纤维及胶原污染严重、成活率低、形貌差的问题，通过本技术培养的胆囊癌类器官的生长状态好，得率高，能够为胆囊癌的基质靶向药物开发、个体化治疗策略筛选及肿瘤微环境机制研究提供高质量的体外模型平台。

2、为了实现上述目的，本技术采用以下技术方案：

3、第一方面，本技术公开了一种用于构建胆囊癌类器官的试剂组合，其包括酶解消化液和类器官培养基。

4、其中，酶解消化液用于将离体的胆囊癌组织解离为单细胞或小细胞团。类器官培养基则用于支持解离后的胆囊癌细胞在体外三维环境中增殖、生长并形成类器官结构。进一步的，类器官培养基按照培养阶段的不同又分为第一培养基和第二培养基，第一培养基用于原代培养初期（例如接种后的前2天），第二培养基用于后续的扩增培养阶段。下面将详述本技术中的试剂组合。

5、<酶解消化液>

6、本技术中酶解消化液的组分包括基础培养基、liberase dh、hyaluronidase、dnase ⅰ、y-27632、primocin和fbs。该酶解消化液能够在保证细胞活率的前提下，将质地硬韧的纤维化胆囊癌组织充分解离，显著提高细胞得率，为后续类器官培养提供充足且优质的细胞来源。

7、其中，基础培养基作为酶解消化液的溶剂体系，为消化过程中的细胞提供基本的渗透压环境和营养物质。作为具体的示例，基础培养基可以为advanced dmem/f12，其营养成分经过优化、内毒素水平低，且对多种原代细胞具有温和的支持作用，有利于维持消化过程中肿瘤细胞的活力；在实际应用中该基础培养基还可以选择dmem/f12、dmem（高糖型）、rpmi 1640等其它型号的基础培养基，可根据具体需要的细胞或组织类型进行选择，本技术对此不做限定。

8、在该酶解消化液中，设计了针对纤维化胆囊癌的特异性酶解消化体系，具体的说，liberase dh作为研究级胶原酶与中性蛋白酶的优化组合，能够高效降解致密胶原网络，而hyaluronidase则特异性分解caf分泌的主要糖胺聚糖成分透明质酸，双酶协同显著提升了癌细胞从纤维化基质中的释放效率，同时通过精确的浓度与作用时间控制，最大限度保护癌细胞膜完整性及增殖活性。

9、进一步的，dnase ⅰ用于降解组织消化过程中因细胞破损而释放的染色质dna。细胞破损释放的dna会使消化液变得黏稠，导致细胞聚团、计数困难并堵塞滤网；加入dnase ⅰ后可有效降低消化液黏度、减少细胞团块聚集、提高过滤回收效率，同时也减轻了游离dna诱发的细胞损伤。

10、y-27632作为rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（rock）抑制剂，其能够抑制解离过程中因失巢凋亡导致的细胞死亡。原代肿瘤细胞经酶解成为单细胞后脱离细胞外基质，极易发生失巢凋亡；y-27632可通过抑制rock信号通路可显著提高单细胞状态的存活率。

11、primocin是一类广谱抗微生物试剂，可有效抑制细菌、支原体及真菌污染，用于防范原代组织样本携带的病原微生物在后续长期培养中造成的污染风险。

12、fbs则用于提供蛋白保护，其含有的白蛋白等成分可在消化过程中缓冲蛋白酶对细胞膜的过度损伤，并为细胞提供生长因子和营养支持。应当理解的是，在实际应用中也可以根据需要选用其它等级或来源的血清，本技术对此不做限定。

13、可以理解的是，酶解消化液中各组分的浓度可根据胆囊癌的纤维化程度进行调整或优化，本领域技术人员具备这样的能力，故而没有特别的限定。在一些具体的示例中，酶解消化液中各组分终浓度如下：

14、liberase dh为0.05-0.5 u/ml，例如可以是0.05 u/ml、0.1 u/ml、0.15 u/ml、0.2u/ml、0.25 u/ml、0.3 u/ml、0.35 u/ml、0.4 u/ml、0.45 u/ml、0.5 u/ml中的任意数值或任两个数值间的范围值；

15、hyaluronidase为0.5-5 mg/ml，例如可以是0.5 mg/ml、1 mg/ml、1.5 mg/ml、2mg/ml、2.5 mg/ml、3 mg/ml、3.5 mg/ml、4 mg/ml、4.5 mg/ml、5 mg/ml中的任意数值或任两个数值间的范围值；

16、dnase ⅰ为0.05- 0.5 mg/ml，例如可以是0.05 mg/ml、0.1 mg/ml、0.15 mg/ml、0.2 mg/ml、0.25 mg/ml、0.3 mg/ml、0.35 mg/ml、0.4 mg/ml、0.45 mg/ml、0.5 mg/ml中的任意数值或任两个数值间的范围值；

17、y-27632为10 μm；

18、primocin为100 µg/ml；

19、fbs为2%（体积百分比，v/v）。

20、<类器官培养基>

21、本技术中的类器官培养基包括第一培养基和第二培养基。针对性设计了适配纤维化微环境的培养基配方，通过调整生长因子配比、添加caf静息化诱导因子，有效抑制caf过度生长，重建癌细胞的优势扩增条件，从而显著提高纤维化胆囊癌类器官的形成率、传代稳定性及与原发肿瘤的病理-遗传一致性。通过本技术类器官培养基所培养的纤维化胆囊癌类器官，生长状态好、得率高，能够为胆囊癌的基质靶向药物开发、个体化治疗策略筛选及肿瘤微环境机制研究提供高质量的体外模型平台。

22、进一步的，本技术中，第一培养基与第二培养基的组分相同，区别仅在于第二培养基不含y-27632，这是由于原代接种初期（例如前2天），刚经历酶解消化胁迫的细胞存活能力弱，需要y-27632抑制失巢凋亡、帮助细胞度过恢复期；而一旦细胞进入基质胶并启动增殖，持续添加y-27632反而可能干扰细胞正常的骨架重构与增殖分化行为，因此后续培养切换为不含y-27632的第二培养基，更有利于类器官的长期扩增和形态学特征的稳定维持。

23、具体的说，第一培养基的组分包括基础培养液、营养添加剂和特异性因子。

24、所述基础培养液包括基础培养基、glutamax、青霉素-链霉素和hepes：其中，基础培养基为advanced dmem/f12，其既含有还原剂和微量元素等优化组分，又降低了碳酸氢钠含量、支持低血清条件下的细胞生长，与类器官培养中大量添加特异性因子的体系兼容性好；在实际应用中该基础培养基还可以选择dmem/f12等其它型号，本技术对此不做限定。glutamax作为l-谷氨酰胺的稳定替代物，其在培养基中可缓慢释放谷氨酰胺，既保证氮源供应又避免了氨的蓄积。青霉素-链霉素为常规抗生素添加剂，用于防控细菌污染。hepes是氢离子缓冲剂，用于在换液间隔期间（脱离二氧化碳培养箱气体环境时，如换液操作过程中）维持培养基ph的稳定。

25、所述营养添加剂包括y-27632、n2、不含维生素a的b27、primocin、n-acetylcysteine和nicotinamide，其中：

26、y-27632的作用如上文所述，通过抑制rhoa/rock/myosin ii通路阻断应力纤维形成，缓解细胞收缩与基质硬化，作为经典类器官添加因子抑制anoikis促进单细胞存活，显著提高起始细胞接种效率与类器官形成率。

27、n2和不含维生素a的b27为无血清添加剂，为细胞提供胰岛素、转铁蛋白、孕酮、腐胺、硒等微量营养因子，b27去除维生素a是为了避免视黄酸诱导的上皮终末分化，维持增殖态与干性特征；应当理解的是，在实际应用中n2和b27还可以选择其它厂商的等效神经添加剂产品，本技术对此不做限定。

28、primocin是广谱抗支原体/细菌抗生素复合物，预防培养体系微生物污染，保障长期培养的稳定性与可重复性。

29、n-acetylcysteine为抗氧化剂，是细胞内重要抗氧化物谷胱甘肽（gsh）的前体分子，清除培养过程中活性氧（ros）爆发，保护线粒体功能，防止氧化应激诱导的细胞凋亡；在纤维化微环境中，氧化应激是tgf-β激活成纤维细胞的关键驱动因素，nac通过抑制ros-dependent tgf-β1活化间接减轻胶原沉积，优化类器官生长微环境。

30、nicotinamide是nad+前体及sirtuin家族激活剂，通过增强sirt1去乙酰化酶活性促进上皮基因程序维持；同时作为hdac抑制剂，抑制emt及间充质表型获得，维持胆囊癌细胞上皮身份与增殖能力。

31、所述特异性因子包括a83-01、fgf-10、gastrin i、dexamethasone、egf、noggin、forskolin和imatinib。

32、其中，a83-01为tgf-βr i/alk5、alk4和alk7抑制剂，通过阻断smad2/3磷酸化抑制tgf-β1/smad经典通路。在胆囊癌类器官培养中，其主要作用是抑制tgf-β诱导的上皮-间充质转化（emt），维持肿瘤细胞上皮表型与干性特征，促进细胞增殖并防止分化衰老；同时兼具抑制成纤维细胞活化及胶原基因（col1a1、col3a1）转录的功能，减少培养过程中基质过度沉积对类器官生长的物理束缚。

33、fgf-10为上皮特异性间充质生长因子，通过激活fgfr2-iiib受体维持胆囊癌细胞增殖、存活与分支形态发生，是促进癌上皮成分选择性扩增的核心生长因子；其上皮偏向性信号可竞争性稀释成纤维细胞主导的促纤维化微环境，间接优化类器官生长空间。

34、gastrin i为胃泌素受体（cckbr）配体，通过自分泌/旁分泌环路激活pi3k/akt和mapk通路，促进胆囊癌细胞增殖、存活与克隆形成，是维持类器官形成潜能（ofp）的胆囊癌特异性营养因子。

35、dexamethasone为糖皮质激素受体激动剂，通过上调mkp-1（dusp1）抑制p38mapk和jnk应激通路，稳定细胞膜结构，缓解穿刺样本机械损伤导致的细胞死亡；同时下调nf-κb驱动的炎症因子表达，优化类器官培养微环境稳定性。

36、egf为egfr配体，通过激活ras/raf/mek/erk和pi3k/akt通路驱动胆囊癌细胞持续增殖与自我更新，是类器官基础扩增的必需核心生长因子。

37、noggin为bmp2/4/7拮抗剂，阻断smad1/5/8磷酸化介导的上皮分化和凋亡，维持干细胞未分化状态与长期扩增能力；在纤维化背景下，bmp信号可协同tgf-β促进胶原合成，noggin通过此途径间接抑制基质硬化对类器官生长的抑制作用。

38、forskolin为腺苷酸环化酶激活剂，升高细胞内camp水平，激活pka-creb信号轴，促进胆囊癌细胞极化与囊腔形成，是胆道来源类器官腔化结构建立的关键诱导因子；camp/pka通路可交叉抑制tgf-β/smad3驱动的胶原转录，兼具抗纤维化旁效应。

39、imatinib为bcr-abl/c-kit/pdgfr多靶点酪氨酸激酶抑制剂。在本技术的胆囊癌类器官培养中，其发挥双重靶向的作用：一方面通过抑制pdgfr-β介导的成纤维细胞募集、活化及向肌成纤维细胞转化，阻断致密基质的过度沉积，解除物理屏障对类器官生长的空间限制；另一方面，imatinib对c-kit阳性肿瘤相关成纤维细胞（cafs）的清除作用可减少cafs对上皮细胞的旁分泌抑制，间接释放癌上皮细胞的增殖潜能。imatinib在类器官培养基中是实现“促上皮生长-抑基质过度”平衡调控的关键组分。

40、本技术中类器官培养基中的各组分相互配合，实现纤维化胆囊癌组织样本来源的胆囊癌类器官的构建。具体的说，a83-01 + imatinib + fgf-10构成核心的上皮优选-基质调控组分，其是针对纤维化亚型的肿瘤微环境特征进行精准微环境重塑。纤维化胆囊癌的原代组织具有致密的促结缔组织增生的基质结构，传统培养中cafs过度增殖导致类器官形成率极低（<10%）且结构紊乱。fgf-10作为上皮选择性生长因子，通过fgfr2-iiib受体优先驱动癌上皮成分增殖与形态发生，奠定类器官形成的细胞基础；a83-01阻断tgf-β/smad2/3通路，维持上皮干性并抑制emt，防止培养过程中上皮表型丢失；imatinib则负责精准靶向pdgfr-β+/c-kit+ cafs，抑制其活化、收缩与胶原过度分泌，解除物理屏障对上皮扩增的空间限制。三者协同实现“促上皮-抑基质”的动态平衡：fgf-10正向驱动上皮生长，a83-01维持上皮身份，imatinib负向调控基质过度反应，使癌上皮成分获得选择性扩增优势，类器官形成率显著提升，并保持清晰的囊腔-上皮极性结构。

41、进一步的，egf + gastrin i + forskolin配合作为胆囊癌特异性增殖-腔化关键组分，维持胆囊癌类器官生物学特征与功能成熟度。其中，egf通过egfr激活基础增殖信号，gastrin i通过cckbr提供胆囊癌特征性营养支持，forskolin通过camp/pka驱动腔化与极化建立。三者协同构建增殖-存活-结构成熟的完整发育程序：egf保障细胞数量扩增，gastrin i增强胆囊癌细胞的克隆形成效率，forskolin诱导特征性囊腔结构形成。

42、进一步的，noggin + a83-01配合作为tgf-β超家族双通路干性维持关键组分，其中，noggin阻断bmp/smad1/5/8介导的分化与凋亡，a83-01抑制tgf-β/smad2/3驱动的emt与生长抑制，两者协同覆盖tgf-β超家族两大分支，构建抗分化-抗emt-抗纤维化的三重防护，维持胆囊癌干细胞样特性与长期扩增能力，防止培养过程中因微环境信号失衡导致的功能丧失；

43、进一步的，y-27632 + n-acetylcysteine配合作为应激防护-接种效率提升关键组分，y-27632从细胞骨架层面抑制anoikis与机械损伤导致的细胞死亡，n-acetylcysteine从代谢层面清除ros爆发，两者形成机械-氧化双重应激防护网，显著提高原代组织消化后单细胞或微小细胞团的存活率与类器官起始效率，保障a83-01 +imatinib + fgf-10的核心组合发挥效应。

44、进一步的，可以理解的是，本技术中具体的第一培养基的各组分浓度可根据研究目的和实际需要进行调整或优化，故而没有具体的限定。

45、在一些具体的示例中，第一培养基中各组分的终浓度具体如下：

46、基础培养基为advanced dmem/f12；

47、glutamax为1-5 mm，例如可以是1 mm、2 mm、3 mm、4 mm、5 mm中的任意数值或任两个数值间的范围值；

48、青霉素-链霉素为50-100 u/ml，例如可以是50 u/ml、60 u/ml、70 u/ml、80 u/ml、90 u/ml、100 u/ml中的任意数值或任两个数值间的范围值；

49、hepes为10-25 mm，例如可以是10 mm、12 mm、15 mm、18 mm、20 mm、22 mm、25 mm中的任意数值或任两个数值间的范围值；

50、a83-01为1-10 μm，例如可以是1 μm、2 μm、3 μm、4 μm、5 μm、6 μm、7 μm、8 μm、9 μm、10 μm中的任意数值或任两个数值间的范围值；

51、fgf-10为20-200 ng/ml，例如可以是20 ng/ml、50 ng/ml、80 ng/ml、100 ng/ml、120 ng/ml、150 ng/ml、180 ng/ml、200 ng/ml中的任意数值或任两个数值间的范围值；

52、gastrin i为1-10 nm，例如可以是1 nm、2 nm、3 nm、4 nm、5 nm、6 nm、7 nm、8 nm、9 nm、10 nm中的任意数值或任两个数值间的范围值；

53、dexamethasone为1-10 nm，例如可以是1 nm、2 nm、3 nm、4 nm、5 nm、6 nm、7 nm、8nm、9 nm、10 nm中的任意数值或任两个数值间的范围值；

54、egf为10-100 ng/ml，例如可以是10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml中的任意数值或任两个数值间的范围值；

55、noggin为20-200 ng/ml，例如可以是20 ng/ml、50 ng/ml、80 ng/ml、100 ng/ml、120 ng/ml、150 ng/ml、180 ng/ml、200 ng/ml中的任意数值或任两个数值间的范围值；

56、forskolin为1-20 µm，例如可以是1 μm、2 μm、5 μm、8 μm、10 μm、12 μm、15 μm、18μm、20 μm中的任意数值或任两个数值间的范围值；

57、imatinib为1-10 μm，例如可以是1 μm、2 μm、3 μm、4 μm、5 μm、6 μm、7 μm、8 μm、9μm、10 μm中的任意数值或任两个数值间的范围值；

58、y-27632为5-30 µm，例如可以是5 μm、8 μm、10 μm、12 μm、15 μm、18 μm、20 μm、22μm、25 μm、28 μm、30 μm中的任意数值或任两个数值间的范围值；

59、n2或不含维生素a的b27分别为1-2×，例如可以是1×或2×，其中，×表示推荐的终浓度倍数；

60、primocin为100-200 μg/ml，例如可以是100 μg/ml、110 μg/ml、120 μg/ml、130 μg/ml、140 μg/ml、150 μg/ml、160 μg/ml、170 μg/ml、180 μg/ml、190 μg/ml、200 μg/ml中的任意数值或任两个数值间的范围值；

61、n-acetylcysteine为1-2 mm，例如可以是1 mm、1.1 mm、1.2 mm、1.3 mm、1.4 mm、1.5 mm、1.6 mm、1.7 mm、1.8 mm、1.9 mm、2 mm中的任意数值或任两个数值间的范围值；

62、nicotinamide为4-16 mm，例如可以是4 mm、5 mm、6 mm、7 mm、8 mm、9 mm、10 mm、11 mm、12 mm、13 mm、14 mm、15 mm、16 mm中的任意数值或任两个数值间的范围值。

63、上述各成分的浓度除特别说明外，均指其在第一培养基中的终浓度。

64、进一步的，第二培养基的组分与第一培养基相同，唯一区别在于不含y-27632。即，第二培养基由基础培养液、营养添加剂（不含y-27632）和特异性因子构成，各组分的种类和浓度范围参见上文针对第一培养基的描述，这里不再赘述。

65、第二方面，本技术公开了一种用于构建胆囊癌类器官的试剂盒，该试剂盒含有上述试剂组合，即含有酶解消化液以及由第一培养基和第二培养基构成的类器官培养基。可以理解的是，各组分可以独立包装，使用时按需要分别配制或稀释。

66、在一些具体的实施方式中，该试剂盒还含有样本保存液和样本清洗液。

67、其中，样本保存液用于离体胆囊癌组织样本从手术室转运至实验室过程中的暂存。其组分包括：dmem培养基、2×青霉素-链霉素-两性霉素（即2倍常规工作浓度的三抗）和10 µm y-27632。其中，dmem培养基提供基本的营养环境与渗透压；2×双抗强化了抑菌防线，防止转运期间组织样本中的微生物增殖；10 µm y-27632则保护组织切缘处的细胞在离体缺血应激下减少凋亡。通过样本保存液的低温暂存（例如置于冰上或4℃），可显著延长组织样本的可利用时间窗口、保障细胞活力。

68、样本清洗液用于对离体组织样本的反复清洗，以去除组织表面的血液、胆汁、坏死碎屑及可能的污染物。其组分包括：dpbs缓冲液和2×青霉素-链霉素-两性霉素。dpbs提供与细胞等渗的磷酸盐缓冲体系，不含钙镁离子时还可在一定程度上弱化细胞间连接，利于后续消化；2×三抗在清洗环节提供抗微生物保护。

69、进一步的，试剂盒还可根据需要包含基质胶（如matrigel）、滤网（例如70 μm或100μm细胞滤网）、离心管等耗材，本技术对试剂盒的具体组成形式不做限定，只要其含有上述试剂组合即可。

70、第三方面，本技术公开了一种构建胆囊癌类器官模型的方法，该方法使用上述试剂组合或试剂盒实施，主要包括以下步骤：

71、（1）提供试剂

72、提供上述试剂组合，该试剂组合包括酶解消化液和类器官培养基，类器官培养基包括第一培养基和第二培养基。

73、（2）组织处理与分段式酶解消化

74、获得具有纤维化特征的胆囊癌组织。作为具体的示例，胆囊癌组织样本可以来源于胆囊癌患者手术切除标本或活检标本，样本离体后尽快（例如30分钟内）置于样本保存液中低温转运。是否具有纤维化特征可以通过大体观察（组织质地硬韧、切面呈灰白色纤维样）和/或病理学检查（masson染色、天狼星红染色显示胶原沉积，免疫组化显示α-sma阳性的肿瘤相关成纤维细胞富集）予以确认。

75、对组织进行清洗：将组织置于样本清洗液中反复清洗（例如清洗3-5次），直至洗液澄清，以去除血液、胆汁和坏死组织。

76、对清洗后的组织进行机械剪切，剪碎至边长≤500 μm的组织碎块。作为具体的示例，可以使用无菌眼科剪或手术刀在含有少量清洗液的培养皿中将组织剪碎，剪切过程中保持组织湿润。需要说明的是，对于重度纤维化组织，机械剪切至足够小（≤500 μm）非常重要，因为纤维化组织的致密基质会限制酶的渗透深度。剪切越小，酶接触面积越大，消化效率越高。

77、将组织碎块置于酶解消化液中进行至少两轮分段式酶解消化。由于纤维化组织基质致密，一次性长时间消化需要高酶浓度或长消化时间，容易造成先释放出来的细胞在消化液中长时间暴露而损伤；分段式消化则将总消化时长切分为若干短时段，每段消化结束后立即收集已释放的细胞，未消化组织进入下一轮消化，从而在保证消化充分性的同时最大限度保护细胞活力。

78、对于重度纤维化通常需2-3轮消化才能充分释放肿瘤细胞。可根据组织残留量判断是否需要进行第三轮消化。在一些具体的实施方式中，分段式酶解消化的轮次为三轮；每轮消化期间辅助以宽口枪头吹打10-15次，吹打强度以不产生气泡为宜，吹打产生的机械剪切力与酶解作用协同，促进细胞从基质中释放；其中第一轮消化时间为20-30分钟，第二轮为15-20分钟，第三轮为10-15分钟。消化轮次递进、时间递减的设计与组织碎块逐轮变小、可消化基质逐轮减少的进程相匹配，避免过度消化。消化过程可以在37℃条件下进行，例如置于37℃恒温摇床或水浴中低速振荡消化。应当理解的是，轮次和各轮时间还可以根据组织纤维化程度适当调整，例如纤维化程度特别严重的组织可以增加至四轮消化，本技术对此不做限定。

79、每轮消化结束后静置使未消化组织自然沉降，分别收集上清液并合并。自然沉降利用未消化的组织碎块与已释放细胞/小细胞团之间的沉降速度差异实现快速分离，操作温和、无需额外离心，避免了反复离心对细胞的机械损伤。消化终点的判断可通过取10 µl消化悬液滴于载玻片上，显微镜下观察。当组织碎块基本消失，视野中可见大量单个细胞和小细胞团（5-20个细胞/团）时，判定消化完成。

80、（3）过滤与离心收集细胞

81、将合并的上清液过滤，例如依次通过100 μm和70 μm细胞滤网过滤，以去除未消化完全的组织碎片和纤维团块；需要说明的是，对于纤维化组织，筛网极易被纤维蛋白团堵塞。优选使用倒置筛网法，具体的说，先将悬液通过100 µm筛网，收集滤液；若筛网堵塞，可将筛网倒置，用预冷培养基从背面冲洗，回收截留的细胞。

82、过滤后进行离心（例如200×g，4℃，离心5 min），弃上清，收集样本沉淀。

83、（4）接种与培养

84、将细胞沉淀重悬于第一培养基中，并与基质胶混合接种。作为具体的示例，可以将细胞沉淀重悬于预冷的第一培养基中，再与预冷的基质胶混合，将混合物以液滴形式接种于培养板孔板底部。

85、将接种后的培养板置于培养箱中静置使基质胶凝固（例如37℃静置30分钟），待基质胶完全凝固后沿孔壁缓慢加入预温的第一培养基进行培养，培养条件例如为37℃、5%co2。

86、培养2天后，更换为第二培养基继续培养，即撤除体系中的y-27632，此后每2-3天换液一次（例如每2天或每3天），持续培养（例如培养5-14天），即可获得纤维化胆囊癌类器官。培养过程中可于显微镜下观察类器官的形成与生长情况。

87、在类器官生长至一定大小（例如直径100-300 μm）后，可进行传代：用基质胶降解酶（例如dispase）或低温冷凝法消化基质胶，收集类器官，机械吹打或酶解传代，按适当比例分配后重新接种于新鲜基质胶中，传代培养使用第二培养基。

88、采用本方法构建纤维化胆囊癌的类器官，通过—机械剪切预碎+多轮分段式酶解+每轮沉降收集—的组合策略，解决了纤维化胆囊癌组织难以充分解离、细胞得率低的问题；通过基质胶包埋加第一培养基/第二培养基的分阶段培养策略，提高了原代成活率与扩增稳定性。所构建的胆囊癌类器官能够忠实保留原代肿瘤组织的组织病理学特征与遗传异质性，可在体外长期传代培养。

89、第四方面，本技术公开了本技术构建的胆囊癌类器官在药物敏感性检测或药物筛选中的应用。

90、作为具体的示例，药物敏感性检测可以包括以下步骤：

91、（1）将培养成熟的胆囊癌类器官消化为大小均一的小细胞团，与基质胶混合接种于培养板（例如96孔板或384孔板）；

92、（2）待类器官恢复生长后，加入含有不同浓度的待测药物的培养基进行处理，待测药物例如可以是化疗药物、靶向药物或候选化合物，作为典型的示例可以是克唑替尼、培美曲塞、恩曲替尼中的任意一种。具体的实验组可以设置多个浓度梯度和多个复孔，并设置阴性对照和阳性对照。

93、（3）培养一定时间（例如3-7天）后，采用细胞活力检测方法（如celltiter-glo 3d发光法、cck-8法或活死细胞染色法）检测类器官活力，计算药物处理的相对抑制率等药敏评价参数。

94、由于本技术的类器官忠实保留了原代胆囊癌组织的异质性和纤维化微环境相关特征，其药敏检测结果能够较好地反映患者个体对药物的真实响应情况，可为临床个体化用药方案的制定提供参考依据。

95、第五方面，本技术公开了试剂组合/试剂盒在构建胆囊癌类器官模型中的应用。上述试剂组合或试剂盒可用于构建胆囊癌类器官模型，其中所构建的胆囊癌类器官的原始样本为具有纤维化特征的胆囊癌组织。具体的应用实施过程如上文方法部分所述，此处不再赘述。由于试剂组合和试剂盒的组分是针对纤维化胆囊癌组织的消化与培养特性专门设计的，其应用于该类组织样本时能够取得显著优于常规类器官构建试剂的成功率与扩增稳定性。

96、本技术至少具有以下有益效果：

97、（1）通过多酶复配的酶解消化液，有效解除纤维化基质的物理屏障，显著提高细胞得率与活率。本技术的酶解消化液以基础培养基为溶剂，复配liberase dh与透明质酸酶：liberase dh能够高效降解致密胶原网络，透明质酸酶则特异性分解caf分泌的主要糖胺聚糖成分透明质酸，二者协同作用，可瓦解包绕癌巢的胶原-透明质酸结构性囚笼，使消化酶有效渗透至癌巢内部，克服了常规单一胶原酶或胰蛋白酶难以渗透纤维化组织的缺陷。由此，在无需延长消化时间或提高酶浓度的前提下，即可实现纤维化组织的充分解离，兼顾了消化效率与细胞活率，缓解了现有技术中—消化不充分则得率低、消化过度则细胞失活的两难困境。

98、（2）通过第一培养基与第二培养基的分阶段培养体系，帮助细胞顺利度过原代恢复期并实现类器官的长期稳定扩增。在培养基中添加imatinib，使其发挥双重靶向作用，一方面通过抑制pdgfr-β介导的成纤维细胞募集、活化及向肌成纤维细胞转化，阻断致密基质的过度沉积，解除物理屏障对类器官生长的空间限制；另一方面，imatinib对c-kit阳性肿瘤相关成纤维细胞（cafs）的清除作用可减少cafs对上皮细胞的旁分泌抑制，间接释放癌上皮细胞的增殖潜能；使得该培养基能够调控促上皮生长和抑基质过度的平衡。同时配合其他组分，有效抑制caf过度生长，重建癌细胞的优势扩增条件，显著提高纤维化胆囊癌类器官的形成率和传代稳定性。

99、（3）所构建的纤维化胆囊癌类器官成功率高、可长期传代，且忠实保留原代组织的病理学特征，具有显著的转化应用价值。采用本技术的试剂组合与方法，能够将以往因纤维化而难以建系的胆囊癌组织成功构建为类器官模型，扩大了可建模患者的覆盖范围。所构建的类器官可长期传代培养，可用于药物敏感性检测：通过将类器官暴露于不同浓度的待测药物并检测其活力变化，可获得反映患者个体真实用药响应的药敏数据，为胆囊癌个体化治疗方案的制定提供体外预测工具，弥补了胆囊癌临床前研究模型匮乏的现状。

100、本文中试剂组合中的术语说明如表1所示：

101、表1 术语说明

102、