检测α-地中海贫血的引物组合、方法、试剂盒与流程

本申请涉及基因检测，特别涉及一种检测α-地中海贫血的引物组合、方法、试剂盒。

背景技术：

1、α-地中海贫血（α-thalassemia）是由于α-珠蛋白基因缺失或点突变导致α-珠蛋白肽链合成减少或缺失的常染色体隐性遗传性血液病。目前α-地中海贫血缺失型突变的检测方法主要有以下几类：跨越缺失断裂点pcr（gap-pcr）配合琼脂糖凝胶电泳的检测方法；荧光标记gap-pcr配合毛细管电泳的检测方法；多重连接依赖式探针扩增（mlpa）；高通量测序（ngs）。其中，琼脂糖凝胶电泳的检测方法成本低但分辨率较低，另外三种方法分辨率高但成本过高。因此亟须一种兼具低成本和高分辨率的α-地中海贫血检测方法。

技术实现思路

1、本申请的主要目的是提出一种检测α-地中海贫血的引物组合、方法、试剂盒，旨在解决现有的α-地中海贫血检测方法无法兼顾低成本和高分辨率的问题。

2、为实现上述目的，第一方面，本申请提出了一种检测α-地中海贫血的引物组合，所述引物组合包括seq id no:1~8所示的引物；

3、所述引物组合用于非荧光多重跨越缺失断裂点pcr，所述引物不带有荧光基团标记。

4、在一些实施方式中，seq id no:1和2所示的引物组成用于扩增野生型等位基因的引物对，seq id no:3和4所示的引物组成用于扩增-α3.7缺失型等位基因的引物对，seq idno:5和6所示的引物组成用于扩增-α4.2缺失型等位基因的引物对，seq id no:7和8所示的引物组成用于扩增--sea缺失型等位基因的引物对。

5、第二方面，本申请提出一种检测α-地中海贫血的试剂盒，所述试剂盒包括本申请第一方面提供的引物组合。

6、在一些实施方式中，所述试剂盒还包括多重pcr扩增试剂、dna结合染料和分子量内标。

7、在一些实施方式中，所述多重pcr扩增试剂包括dntp、dmso、q-solution、缓冲液和dna聚合酶。

8、在一些实施方式中，所述试剂盒还包括用于分离100 bp~5000 bp双链dna片段的预封装已灌胶芯片。

9、第三方面，本申请还提出一种检测α-地中海贫血的方法包括以下步骤：

10、以离体基因组dna样本为模板，采用本申请第一方面提出的引物组合进行跨越缺失断裂点pcr扩增，获得pcr扩增产物；

11、将所述pcr扩增产物与dna结合染料和分子量内标混合，进行后置染色；

12、将后置染色所得混合液上样至核酸片段分析仪的预封装已灌胶芯片中进行电泳分离和荧光检测，获得各pcr扩增产物的片段长度信息；

13、根据所述片段长度信息，确定所述离体基因组dna样本中是否存在--sea、-α3.7和-α4.2缺失型等位基因中的至少一种。

14、在一些实施方式中，所述核酸片段分析仪为nanalyzer 96核酸片段分析仪，所述预封装已灌胶芯片为dna 5 k芯片，片段分析范围为100 bp~5000 bp。

15、在一些实施方式中，所述后置染色的步骤包括：将所述pcr扩增产物与含有所述dna结合染料和所述分子量内标的上样缓冲液混合，于室温孵育3 min~5 min；并将孵育所得混合液上样至所述预封装已灌胶芯片。

16、在一些实施方式中，根据所述核酸片段分析仪获得的电泳图谱中与野生型等位基因、--sea缺失型等位基因、-α3.7缺失型等位基因和-α4.2缺失型等位基因分别对应的扩增峰的存在情况，进行基因型判定，其中：

17、当检测到与野生型等位基因对应的扩增峰以及与一种缺失型等位基因对应的扩增峰时，判定所述离体基因组dna样本含有相应缺失型杂合基因型；

18、当未检测到与野生型等位基因对应的扩增峰，且仅检测到与一种缺失型等位基因对应的扩增峰时，判定所述离体基因组dna样本含有相应缺失型纯合基因型；

19、当未检测到与野生型等位基因对应的扩增峰，且检测到与两种不同缺失型等位基因对应的扩增峰时，判定所述离体基因组dna样本含有相应缺失型复合杂合基因型；

20、当未检测到与野生型等位基因及任一种缺失型等位基因对应的扩增峰时，判定该次检测无效。

21、本申请提出的引物组合中的引物均为未标记荧光基团的普通寡核苷酸引物，使用该引物组合对基因组dna样本进行gap-pcr，pcr产物经后置dna结合染料染色后上样至核酸片段分析仪，利用可配套使用的预封装已灌胶芯片进行自动化电泳分离和荧光检测，实现高分辨率片段分析与基因型判读。与现有技术相比，本申请的引物组合无需进行荧光标记，同时获得了优于琼脂糖凝胶检测的分辨率以及数字化结果输出，兼顾了低成本和高分辨率。

1.一种检测α-地中海贫血的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括seq id no:1~8所示的引物；

2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，seq id no:1和2所示的引物组成用于扩增野生型等位基因的引物对，seq id no:3和4所示的引物组成用于扩增-α3.7缺失型等位基因的引物对，seq id no:5和6所示的引物组成用于扩增-α4.2缺失型等位基因的引物对，seq id no:7和8所示的引物组成用于扩增--sea缺失型等位基因的引物对。

3.一种检测α-地中海贫血的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组合。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重pcr扩增试剂、dna结合染料和分子量内标。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述多重pcr扩增试剂包括dntp、dmso、q-solution、缓冲液和dna聚合酶。

6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于分离100 bp~5000 bp双链dna片段的预封装已灌胶芯片。

7.一种检测α-地中海贫血的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述核酸片段分析仪为nanalyzer 96核酸片段分析仪，所述预封装已灌胶芯片为dna 5 k芯片，片段分析范围为100 bp~5000 bp。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述后置染色的步骤包括：

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，根据所述核酸片段分析仪获得的电泳图谱中与野生型等位基因、--sea缺失型等位基因、-α3.7缺失型等位基因和-α4.2缺失型等位基因分别对应的扩增峰的存在情况，进行基因型判定，其中：