一种基于磁珠法直接裂解全血的RNA提取试剂盒及RNA提取方法与流程

本技术涉及生物化学与分子生物学的，尤其涉及一种基于磁珠法直接裂解全血的rna提取试剂盒及rna提取方法。

背景技术：

1、血液是一种信息含量丰富、易获取且近乎无创的生物样本，其rna提取在分子生物学基础研究、生物标志物发现、基因表达研究及新药研发等领域具有重要意义。随着分子生物学技术的快速发展，科研与工业界对rna的质量（包括纯度、完整性、无dna残留）和提取效率提出了更高要求。

2、目前，血液rna提取方法主要分为三类：其一，基于酚-胍盐裂解的trizol法，该方法需要使用酚、氯仿等有毒有机试剂进行抽提与沉淀，对实验人员健康和环境造成危害，且操作繁琐、耗时久，无法实现高通量自动化；其二，基于吸附柱膜的提取方法，该方法依赖离心操作，耗费大量人力，同样难以实现自动化；其三，基于磁珠的提取方法，该方法虽具备自动化潜力，但现有技术存在明显缺陷：对于大体积血液样本，需先进行红细胞去除步骤，增加了操作复杂度和样本损失风险；或需先裂解细胞释放rna，再单独加入结合液使rna结合磁珠，提取过程需要暂停，自动化程度低；且结合液多采用易挥发的无水乙醇或异丙醇，导致提取结果重复性差，同时乙醇/异丙醇与胍盐、表面活性剂相溶性有限，会抑制裂解效果，且难以溶解血液中的脂类、脂蛋白杂质，最终影响rna的得率和纯度。

3、因此，开发一种操作方便快捷、自动化程度高的血液rna提取试剂盒及方法，成为本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中需去除红细胞、需暂停加结合液、使用有毒试剂、rna得率低、纯度差、重复性不佳、难以自动化的缺陷，本技术提供一种基于磁珠法直接裂解全血的rna提取试剂盒及rna提取方法。本技术提供的方法不需要去除红细胞，直接加入全血样本即可进行自动化提取，整个过程不涉及酚、氯仿有机试剂，无需加热、无需暂停，所得rna无dna残留，得率高、纯度佳，完整性好，可以适用于rt-qpcr，rt-ddpcr，ngs等多种下游分子生物学实验。

2、第一方面，本技术提供一种基于磁珠法直接裂解全血的rna提取试剂盒，采用如下技术方案：

3、一种基于磁珠法直接裂解全血的rna提取试剂盒，所述rna提取试剂盒包括裂解结合液、磁珠悬浮液、去蛋白液；

4、所述裂解结合液包括以下组分，余量为无核酸酶水：3-4m异硫氰酸胍；10-15mmedta螯合剂；50-200mm、ph 6.5-7.5的3-吗啉丙磺酸（mops）缓冲液；1-5%（w/v）聚乙二醇单十二烷醚；1-3%（w/v）n-月桂酰肌氨酸钠；10-20%（v/v）2-甲基-1,3-丙二醇。

5、上述裂解结合液中，异硫氰酸胍为强离液盐，可高效裂解变性蛋白质，抑制核酸酶活性，使白细胞破裂并完整释放rna；edta螯合剂通过螯合金属离子，抑制全血中的rnase，保护rna不被降解；mops缓冲液维持体系ph稳定，保证rna提取效果以及完整性；聚乙二醇单十二烷醚为非离子型表面活性剂，具有优异的裂解能力，其分子结构由十二烷基疏水链和聚乙二醇亲水链组成（环氧乙烷平均聚合度n=23），可充分溶解和解离血液中的脂类与脂蛋白，防止脂蛋白包裹聚集阻碍rna释放；与triton x-100、tween 20等含苯环的非离子表面活性剂相比，其具有低紫外吸收及适合荧光检测的特性，不会影响下游实验；n-月桂酰肌氨酸钠为阴离子型表面活性剂，对热、酸、碱稳定，可渗透细胞膜，解离血液中的蛋白质，使rna释放更充分，同时具有一定的核酸酶抑制作用。

6、2-甲基-1,3-丙二醇为本技术的核心结合组分，其分子结构为两端伯羟基、中心碳原子带一个甲基支链，具有低黏度、低毒性、高沸点和良好的溶剂相溶性，作为结合组分具有三大不可替代的优势：（1）与裂解液中的盐、表面活性剂可以充分溶解，在裂解释放核酸的同时促进rna结合于磁珠表面，实现裂解结合一体化，无需单独加入结合液和暂停提取过程；优化的浓度配比（10-20%）既不会抑制核酸解离与释放，又能显著提高rna得率和完整性；（2）沸点高（约230℃）、稳定性好，在提取过程中不会挥发，保证了提取结果的批间重复性；（3）强极性可更好地溶解脂类和脂蛋白杂质，使杂质悬浮于裂解结合液中，磁吸后与核酸-磁珠复合物分离，显著提高rna纯度，且无残留抑制下游酶促反应的问题。

7、现有技术中常用的无水乙醇和异丙醇无法替代2-甲基-1,3-丙二醇：首先，二者易挥发，导致提取结果不稳定；其次，与胍盐及表面活性剂相溶性有限，若与裂解组分同时加入会抑制裂解效果，降低提取得率；第三，无法有效溶解血液中的脂类和脂蛋白杂质，导致rna纯度低，且残留的无水乙醇或异丙醇会显著抑制下游rt-qpcr、rt-ddpcr等酶促反应。

8、在一个具体的实施方式中，所述mops缓冲液ph为6.5、7.0、7.5。

9、在一个具体的实施方式中，所述mops缓冲液ph为7.0。

10、可选地，所述裂解结合液包括以下组分，余量为无核酸酶水：3.5m异硫氰酸胍；12mm edta螯合剂；100mm、ph 7的mops缓冲液；1.5%（w/v）聚乙二醇单十二烷醚；1%（w/v）n-月桂酰肌氨酸钠；15%（v/v）2-甲基-1,3-丙二醇。

11、可选地，所述磁珠悬浮液中的磁珠为表面具有不规则结构的磁性微球，磁珠粒径为200nm-1μm，悬浮液浓度为50-200mg/ml。

12、上述磁珠悬浮液中，磁珠为表面具有不规则结构的磁性微球，易于分散和重悬，不易团聚，特别适用于血液等粘稠样本的核酸提取。

13、可选地，所述去蛋白液包括以下组分，余量为无核酸酶水：1-2m异硫氰酸胍；0.5-1m尿素；50-200mm、ph 6.5-7.5的3-吗啉丙磺酸缓冲液；0.1-0.5%（w/v）聚乙二醇单十二烷醚；0.1-0.5%（w/v）n-月桂酰肌氨酸钠；20-25%（v/v）2-甲基-1,3-丙二醇。

14、上述去蛋白液中，异硫氰酸胍稳定rna与磁珠的结合并保护rna不被降解，浓度严格控制在1-2m，可避免过多dna结合磁珠导致的基因组dna污染；尿素抑制核酸酶活性，保证rna完整性；低浓度的聚乙二醇单十二烷醚和n-月桂酰肌氨酸钠可洗涤去除杂质，此外，n-月桂酰肌氨酸钠在一定程度上会抑制核酸酶活性；2-甲基-1，3-丙二醇与胍盐组合，提供核酸结合于磁珠上的疏水环境，同时溶解与洗涤部分杂质。上述组分共同作用下，保证了rna的得率与纯度以及下游检测实验的顺利进行。

15、与无水乙醇、异丙醇相比，2-甲基-1,3-丙二醇具有不可替代的技术优势。无水乙醇和异丙醇虽可在一定程度上实现rna结合，保证基本提取得率，但易挥发特性会导致体系浓度波动，造成提取结果稳定性与重复性差；同时，二者对血液中脂类、脂蛋白等杂质的溶解与洗涤能力较弱，难以充分去除杂质，导致所得核酸纯度较低；此外，残留的无水乙醇或异丙醇会显著抑制下游酶促反应与检测实验，而2-甲基-1,3-丙二醇无此类残留抑制问题，更有利于获得高纯度、高适用性的rna产物。

16、可选地，所述去蛋白液包括以下组分，余量为无核酸酶水：1.5m异硫氰酸胍、0.5m尿素、100mm、ph 7.5的mops缓冲液；0.5%（w/v）聚乙二醇单十二烷醚、0.5%（w/v）n-月桂酰肌氨酸钠、25%（v/v）2-甲基-1,3-丙二醇。

17、去蛋白液中mops缓冲液ph选择7.5，具有更加优异的杂质洗涤效果。

18、可选地，所述rna提取试剂盒还包括dnase i消化液；所述dnase i消化液包括dnase i消化缓冲液和浓度为1-20u/μl的dnase i工作液。

19、可选地，所述rna提取试剂盒还包括漂洗液i；所述漂洗液i包括质量体积比为12-18%的聚乙二醇6000和0.8-1.2m氯化钠。

20、可选地，所述rna提取试剂盒还包括漂洗液ii；所述漂洗液ii包括体积比为65-75%的乙醇。

21、可选地，所述rna提取试剂盒还包括洗脱液；所述洗脱液为无核酸酶水。

22、第二方面，本技术提供一种基于磁珠法直接裂解全血的rna提取方法，采用如下技术方案：

23、一种基于磁珠法直接裂解全血的rna提取方法，采用上述rna提取试剂盒，包括以下步骤：将全血样本与裂解结合液混合使rna释放并结合磁珠，磁吸弃上清，经去蛋白液洗涤及漂洗液漂洗后，洗脱得到rna。

24、在一个具体的实施方式中，一种基于磁珠法直接裂解全血的rna提取方法，采用上述rna提取试剂盒，包括以下步骤：

25、（1）样本裂解与核酸结合：取全血样本直接加入裂解结合液中，混匀后加入磁珠悬浮液，充分混匀使释放的rna结合于磁珠表面，磁吸弃上清；

26、（2）第一次去蛋白洗涤：加入去蛋白液洗涤磁珠，磁吸弃上清；

27、（3）dnase i消化：加入dnase i消化缓冲液和dnase i工作液，混匀消化后磁吸弃上清；

28、（4）第二次去蛋白洗涤：加入去蛋白液再次洗涤磁珠，磁吸弃上清；

29、（5）漂洗：依次用漂洗液i和漂洗液ii洗涤磁珠，磁吸弃上清；

30、（6）洗脱：晾干磁珠后加入洗脱液洗脱rna，磁吸收集上清即得。

31、可选地，所述全血样本与所述裂解结合液的体积比为1:(2-5)。

32、可选地，所述全血样本与所述裂解结合液的体积比为1:(3-5)。

33、可选地，所述全血样本与所述裂解结合液的体积比为1:4.5。

34、可选地，所述全血样本的体积为200μl-1ml。

35、可选地，所述步骤（1）中，所述全血样本与所述裂解结合液混合后颠倒混匀1-2min，加入所述磁珠悬浮液后颠倒混匀5-10min，静置10-30s后磁吸2-5min。

36、可选地，所述步骤（3）中，所述dnase i工作液的用量为10-15u，室温消化10-20min。

37、可选地，所述步骤（1）中还加入核酸保护剂，所述核酸保护剂与所述裂解结合液的体积比为1:（10-20）。

38、可选地，所述步骤（1）中还加入核酸保护剂，所述核酸保护剂与所述裂解结合液的体积比为1:15。

39、可选地，整个提取过程无需加热，全程无需暂停，可在自动化核酸提取仪上完成。

40、可选地，所得rna的基因组dna残留量ct值>33，rin值≥8.0，适用于rt-qpcr、rt-ddpcr、ngs下游实验。

41、综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：

42、（1）操作简便快捷：无需进行繁琐的红细胞去除步骤，全血样本可直接加入裂解结合液进行提取，实现裂解结合一体化，全程无需暂停，单批次96样本提取时间仅需约60min。

43、（2）自动化程度高：可匹配天根sl16（tguide sl16全自动核酸提取纯化仪），s24（tguide s24全自动核酸提取纯化仪）、赛默飞（kingfisher flex自动核酸提取仪）等多种主流自动化核酸提取仪，实现无人值守的高通量样本处理，省时省力，实验结果批间重复性好（cv<5%）。

44、（3）安全环保：全程不使用酚、氯仿等有毒有害有机试剂，对实验人员和环境友好。

45、（4）rna质量优异：

46、得率高：1ml全血样本rna得率可达50-55ng/μl（洗脱体积100μl），比传统异丙醇结合法提高30-50%；

47、纯度好：260/280比值稳定在1.9-2.1，260/230比值稳定在1.8-2.1，无盐、表面活性剂和醇类残留，对下游rt-qpcr、rt-ddpcr等酶促反应无抑制；

48、完整性好：rna的rin值≥8.0，可满足ngs、全长转录组测序等对rna完整性要求极高的下游实验；

49、无dna残留：通过优化的去蛋白液组分和dnase i原位消化步骤，基因组dna残留量低于检测下限（ct>33）；

50、（5）适用范围广：所得rna可直接用于rt-qpcr、rt-ddpcr、ngs、northern blot、基因芯片等多种下游分子生物学实验。