基于时珍法鉴定刺盘孢属物种的物种特异序列、引物对、试剂盒及应用

本公开涉及分子检测，具体涉及一种基于时珍法鉴定刺盘孢属物种的物种特异序列、引物对、试剂盒及应用。

背景技术：

1、刺盘孢(colletotrichum，又称炭疽菌)属真菌是一类影响广泛的世界性植物病原体群体，可侵染约2000余种植物，被认为是不同农业生态系统中毁灭性植物炭疽病的病原体。因其广泛的寄主范围和适应性侵害机制每年造成全球粮食和经济作物产量严重损失。同时，该属部分菌种甚至整个属被中国、美国、俄罗斯等多个国家和地区列为进出口检疫对象，面临着严格的检疫鉴定需求。然而，现有的鉴定方法存在操作繁琐、耗时久、易与近缘物种混淆等弊端，无法满足现代农业高效防控、快速检疫的需求。

技术实现思路

1、有鉴于此，本公开的目的在于提出一种基于时珍法鉴定刺盘孢属物种的物种特异序列、引物对、试剂盒及应用。

2、1.本发明涉及一种基于时珍法的刺盘孢属物种鉴定方法，包括：

3、(1)自ncbi网站上获取刺盘孢属已公开发表的物种基因组；随后通过自研的age1.0软件(软件著作权登记号为：2025sr0250433，http：//58.247.16.28：30080/wholegenome/)生成刺盘孢属物种特异序列库。这些物种特异序列的特点为长度均为25bp，均含有“tttv”(其中，v指a/c/g)样的pam序列，且在基因组数据集的基础上除pam序列外与任一非目标物种相比至少存在3个及以上碱基差异或1个及以上碱基的插入或缺失。

4、(2)从上述物种特异序列库中依据序列在不同基因组中出现的频次筛选高频次物种特异序列，若频次相同则任意选择。随后将选中的物种特异序列在ncbi中进行blast比对，选择与其他物种序列除pam区域外存在3个及以上碱基或1个及以上碱基的插入或缺失差异的序列进行实验验证，可用于区分目标刺盘孢属物种与其他任何物种。

5、2.如段落1所述，本发明公开提供的刺盘孢属物种特异序列如下：

6、ctr_target：5’-tttccacgcattggcccggttacca-3’，seq id no：1；

7、cfi_target：5’-tttcttcaatggggttcaacaatgg-3’，seq id no：5。

8、其中seq id no：1为colletotrichum truncatum的物种特异序列，seq id no：5为c.fioriniae的物种特异序列。在一些实施方式中，可用于鉴定刺盘孢属物种的物种特异序列不限于此，应包括基于时珍法筛选出的所有符合条件的物种特异序列。

9、3.针对如段落2所述的物种特异序列，本发明设计了用于扩增采集样品基因组dna的引物对，以便于后续检测。所述用于刺盘孢属物种特异序列扩增的引物对具体如下：

10、ctr_f：5’-cctgcttcttcgattggcacgattc-3’，seq id no：2；

11、ctr_r：5’-ggtgcgaagattcccattggtcata-3’，seq id no：3；

12、cfi_f：5’-cgttgaacgattagacttactgggt-3’，seq id no：6；

13、cfi_r：5’-tgtaagtcatcccgcttaacgattg-3’，seq id no：7；

14、seq id no：2和seq id no：3用于扩增核苷酸序列为seq id no：1的物种特异序列；seq id no：6和seq id no：7用于扩增核苷酸序列为seq id no：5的物种特异序列。

15、4.如段落3所述的引物，适用于任何类型的dna扩增方法，包括但不限于聚合酶链式反应(pcr)、重组酶聚合酶扩增(rpa)、实时定量pcr(qpcr)、环介导等温扩增(lamp)等。

16、5.本发明提出物种特异序列的检测系统包括sanger测序系统和crisrp-cas12a系统，但不限于上述两种方法。对于所述sanger测序系统，仅目标物种检测到与物种特异序列100％匹配，则表明待测样品与目标的刺盘孢属物种具有同一性；反之，则表明两者不具有同一性。对于所述crisrp-cas12a系统，若仅目标物种在蓝光照射下检测到荧光现象或侧流试纸条呈现阳性条带，则所述待检测样品与指定的刺盘孢属物种具有同一性，反之则没有。

17、6.如段落5中所述的方法，设计刺盘孢属物种鉴定的crrna引物，其序列如下：

18、ctr_crrna：5’-uaauuucuacuaaguguagaucacgcauuggcccgguuacca-3’，seq id no：4；

19、cfi_crrna：5’-uaauuucuacuaaguguagauuucaaugggguucaacaaugg-3’，seq id no：8。

20、其中，seq id no：4是作用于物种特异序列seq id no：1的crrna引物序列；seq idno：8为物种特异序列seq id no：5的crrna引物序列。

21、7.如段落5所述的方法，本公开实施例提供了一种物种鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括引物序列和crrna引物；所述引物序列针对物种特异序列设计；所述物种特异序列选自seq id no：1和seq id no：5中的至少一者。

22、8.本公开实施例还提供了一种物种特异序列在物种鉴定中的应用，所述物种特异序列选自seq id no：1和seq id no：5中的至少一者。需要说明的是，本公开实施例提供的应用可以鉴定所有能够获得物种特异序列的样品，包括但不限于菌丝、受病害植物样本和其他携带该病菌的物质基础等。

23、采用本文所述方法进行刺盘孢属物种鉴定时，可有效区分待鉴定物种与其近缘物种，实现对待检样品中刺盘孢属真菌的物种水平准确判定，适用于田间早期预警、植物检疫、食药品供应链中的真菌检测和医学诊断等应用场景。基于所筛选的物种特异序列及配套引物体系，该方法具有高特异性，可为该属物种精准鉴定提供可靠的技术支撑，并在食药品安全保障和守护公共健康方面具有积极意义。

24、本发明所列实施例仅作为优选示例，其目的在于更清晰地阐释本发明的技术原理及其应用方式。需要强调的是，在不背离本发明技术原理的前提下，可根据实际应用场景对实施方案进行适当调整，以达成最优技术效果。因此，本发明的保护范围不应局限于本文所示的具体实施例，而应涵盖所有基于本发明原理与创新点所做出的等效替换、变更及改进。

1.用于鉴定刺盘孢(colletotrichum)属物种的物种特异序列，包括用于鉴定c.truncatum的物种特异序列ctr_target以及用于鉴定c.fioriniae的物种特异序列cfi_target.

2.权利要求1所述的物种特异序列在对刺盘孢属物种或感染刺盘孢属物种的材料进行物种鉴定、或者区分刺盘孢属物种的应用；优选地，所述刺盘孢属物种选自c.truncatum和c.fioriniae。

3.用于对刺盘孢属物种或遭受刺盘孢属物种侵染的材料进行物种鉴定的引物对，包括：

4.如权利要求3所述的正反向引物对和crrna引物，其中，所述刺盘孢属物种选自c.truncatum和c.fioriniae。

5.一种物种鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求3所述的引物对和crrna引物。

6.权利要求3或4所述的引物对和crrna引物，或权利要求5所述的试剂盒在以下任一种应用中的用途：鉴定待检样品中是否存在刺盘孢属物种；对刺盘孢属物种或感染刺盘孢属物种的材料进行物种鉴定；区分刺盘孢属近缘物种等。

7.权利要求5所述的试剂盒或权利要求6所述的应用，其特征在于，所述seq id no：1用于鉴定c.truncatum；所述seq id no：5用于鉴定cfioriniae。