一种肾上腺皮质束状带类器官及其制备方法和应用

本发明涉及类器官培养，尤其涉及一种肾上腺皮质束状带类器官及其制备方法和应用。

背景技术：

1、在高血压患者群体中，继发性高血压具有较高的患病率，而肾上腺疾病则是其核心病因之一。特别是在难治性高血压患者中，由肾上腺疾病引起的继发性高血压占比尤为显著。其中，原发性醛固酮增多症、库欣综合征、嗜铬细胞瘤及相关副神经节瘤，以及先天性肾上腺皮质增生症等，均是临床常见的病理类型。这些疾病往往伴随激素的过量分泌，对患者的心血管、肾脏等靶器官造成严重且持续的损害，甚至危及生命。随着影像学技术的普及，肾上腺偶发瘤的检出率逐年上升，但针对此类疾病的良恶性鉴别、分子机制解析以及个体化治疗策略仍面临严峻挑战。

2、目前，针对肾上腺疾病及相关激素分泌肿瘤的治疗手段相对局限，且手术治疗后患者常面临激素水平紊乱、生活质量下降及肾上腺功能恢复困难等问题。在药物研发与病理研究领域，现有的评价体系主要依赖于特定细胞系、动物模型及原代细胞的二维培养。然而，细胞系往往难以模拟患者肿瘤的异质性；动物模型由于种属差异而无法完全等效于人体生理过程；传统的二维培养体系则因缺乏三维空间结构，无法重现体内复杂的肿瘤微环境，导致细胞原有的基因表达与生理功能逐渐丢失。因此，建立一种更贴近人体临床病理特征的可靠模型体系，已成为该研究领域的迫切需求。

3、类器官技术作为一种新兴的生物医学手段，通过将组织干细胞在体外进行三维培养，形成在空间结构、基因表达及生理功能上与来源器官高度相似的微型组织。相较于传统培养模式，类器官作为不同类型功能细胞的有机结合体，能够更真实地模拟体内细胞的生存空间与生长状态，在药物筛选、疾病建模及组织工程领域展现出显著的应用价值。尽管行业内已出现关于肾上腺皮质类器官的初步探索，但在培养体系的稳定性、结构功能的完整性以及细胞组成的复杂程度方面仍存在明显局限，这极大地限制了其在基础研究与临床转化中的广泛应用。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的技术问题，本发明提供一种肾上腺皮质束状带类器官及其制备方法和应用。

2、第一方面，本发明提供一种肾上腺皮质类器官培养基，所述肾上腺皮质类器官培养基在基础培养基的基础上，包括：

3、烟酰胺 4-6 mm、 促肾上腺皮质激素10-30 nm、表皮生长因子 40-60 ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子30-50 ng/ml和佛司可林10-30 μm。

4、本发明在研究过程中尝试配置过多种含有不同生长因子或细胞信号分子的肾上腺皮质束状带类器官培养基的配方。例如采用wnt3a、rspo1和noggin时，无论如何优化用量，经过长时间培养，类器官培养成功率极低，并且未见明显三维结构。本发明进一步采用了无促肾上腺皮质激素、无碱性成纤维细胞生长因子、无表皮生长因子和无佛司可林的生长因子和细胞信号组合，结果发现在所构建的类器官培养体系中，佛司可林是类器官形成和生长必要成分。在无佛司可林的条件培养体系中，类器官无法形成和增殖；而添加了佛司可林的培养体系中可以看到类器官的结构形成与发育显著增强，其可以有效促进类器官的功能成熟及激素分泌能力的提升。经过反复探索，最终构建得到的肾上腺皮质类器官与原代组织在形态结构和生理特征上表现出了超出预期的高度相似性，并且在激素分泌、蛋白表达方面均表现出了高度一致性。此外，该肾上腺皮质类器官还表现出了较高的传代稳定性，多次传代后形态结构无实质性变化。

5、本发明所述培养基中各组分的用量均是以基础培养基为基准。

6、进一步地，所述肾上腺皮质类器官培养基在基础培养基的基础上，包括：

7、烟酰胺 4.5-5.5 mm、 促肾上腺皮质激素15-25 nm、表皮生长因子 45-55 ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子35-45ng/ml和佛司可林15-25 μm。

8、本发明优选的生长因子和各细胞信号通路调控因子的用量，可以培养得到与原代组织一致性更高的肾上腺皮质类器官。

9、进一步地，所述肾上腺皮质类器官培养基还包括：血清替代物、谷氨酰胺二肽、缓冲剂、抗氧化剂或抗生素中的一种或多种；

10、优选地，所述肾上腺皮质类器官培养基还包括：b27添加剂、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、hepes缓冲液、n-乙酰-l-半胱氨酸和青霉素-链霉素双抗。

11、进一步地，所述肾上腺皮质类器官培养基还包括：b27添加剂0.5-5 v/v%、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺0.2-4 v/v%、hepes缓冲液0.2-4 v/v%、n-乙酰-l-半胱氨酸0.2-4 mm和青霉素-链霉素双抗0.05-0.5 v/v%；

12、优选地，所述培养基还包括：b27添加剂1-4 v/v%、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺0.5-3 v/v%、hepes缓冲液0.5-3 v/v%、n-乙酰-l-半胱氨酸0.5-3 mm和青霉素-链霉素双抗0.1-0.4v/v%。

13、本发明优选如上营养维持成分，其可以有利于肾上腺皮质类器官结构和功能的完整性，并且在培养过程中保证较高的细胞存活率。

14、进一步地，所述基础培养基选自 dmem、dmem/f12、advanced dmem/f12 或 rpmi1640 培养基中的一种；

15、优选地，所述基础培养基为dmem/f12。

16、进一步地，所述肾上腺皮质类器官培养基为在dmem/f12培养基的基础上还包括：

17、b27添加剂1-3 v/v%；

18、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺0.5-2 v/v%；

19、hepes缓冲液0.5-2 v/v%；

20、n-乙酰-l-半胱氨酸0.5-2 mm；

21、青霉素-链霉素双抗0.1-0.3 v/v%；

22、烟酰胺 4.5-5.5 mm；

23、促肾上腺皮质激素15-25 nm；

24、表皮生长因子 45-55 ng/ml；

25、碱性成纤维细胞生长因子35-45 ng/ml；

26、佛司可林15-25 μm。

27、第二方面，本发明提供一种构建肾上腺皮质类器官的方法，包括：

28、将肾上腺原代细胞置于前述的肾上腺皮质类器官培养基和基质胶的混合液中进行种胶和固化，在所述混合液中，所述肾上腺皮质类器官培养基和基质胶的质量比为1:（0.5-2），所述固化的条件包括：在35-40℃的条件下处理20-45 min；

29、置于前述的肾上腺皮质类器官培养基进行肾上腺皮质类器官的培养。

30、进一步地，所述肾上腺原代细胞通过如下方法制备得到：

31、剪碎肾上腺组织，通过ⅱ型胶原酶消化之后过滤、离心、重悬沉淀。

32、进一步地，所述ⅱ型胶原酶的浓度为0.5-4 mg/ml，优选为1-3 mg/ml。

33、进一步地，所述消化在水浴摇床中进行，转速为100-300 rpm，水浴温度为30-40℃，消化时间为30-50 min。优选地，转速为150-250 rpm，水浴温度为32-38℃，消化时间为35-45 min。

34、进一步地，所述过滤采用的滤网孔径为40-80 μm。

35、进一步地，所述重悬沉淀在0-10℃条件下进行，重悬后接种的培养皿提前在35-40℃条件下预热。

36、进一步地，所述培养的条件包括：在35-40℃的条件下培养6-10天。

37、进一步地，所述肾上腺原代细胞来源于人。

38、进一步地，所述肾上腺原代细胞来源于肾上腺肿瘤组织，或肾上腺肿瘤旁正常组织。

39、本发明提供的培养方法搭配前述的培养基，构建得到的肾上腺皮质类器官能够高度模拟真实肾上腺皮质的生理微环境和组织特异性，可以进一步应用于肾上腺皮质相关疾病的研究，具有重要的应用价值。

40、第三方面，本发明提供一种肾上腺皮质类器官，所述肾上腺皮质类器官由前述的方法构建得到。

41、第四方面，本发明提供前述的肾上腺皮质类器官在如下任一中的应用：

42、（1）构建肾上腺皮质类器官异种移植模型；

43、（2）构建肾上腺皮质类器官基因编辑模型；

44、（3）构建肾上腺皮质类器官疾病模型；

45、（4）构建肾上腺皮质类器官样本库；

46、（5）肾上腺发育及再生医学研究；

47、（6）肾上腺皮质肿瘤研究；

48、（7）研究肾上腺发育及再生的分子机制；

49、（8）研究库欣综合征/皮质醇腺瘤的发生发展机制；

50、（9）制备或筛选治疗库欣综合征/皮质醇腺瘤的药物；

51、（10）筛选库欣综合征/皮质醇腺瘤的相关生物标志物。

52、本发明制备得到的肾上腺皮质类器官能够广泛应用于基础医学与转化医学各相关领域，其在三维空间中自组装，重现了体内肾上腺皮质复杂的多层级组织结构，为研究细胞间相互作用及微环境提供了真实的研究平台；同时，该类器官不仅表达特异性的皮质标志物，更具备完整的类固醇激素合成酶系及多种激素分泌功能；此外，该类器官能够在体外长期稳定扩增而不丢失原始细胞的遗传特征。上述类器官在组织形态、内分泌功能以及遗传背景三个维度上的高度仿生特性，共同构成了其在下游多领域应用的可行性基础。

53、基于上述原理，本发明的类器官可作为高度还原的体外模型应用于疾病建模与药物筛选，通过使用携带致病突变的患者来源干细胞构建类器官，或在体外对健康类器官施加特定病理刺激，能够在体外重构皮质醇增多症或皮质腺瘤的病理表型。以此为基础，研究人员可通过多组学测序对比筛查全新的疾病相关生物标志物；更重要的是，将候选药物加入培养体系后，通过检测类器官结构和功能的表型变化，能够高通量且高精确度地筛选和评估治疗库欣综合征或皮质醇腺瘤的靶向药物。

54、在活体应用及机制研究层面，本发明的类器官为异种移植及发育再生研究提供了优异的载体。将本发明制备的类器官移植至免疫缺陷动物（如小鼠肾包膜下）后，其能够快速聚集宿主微血管实现血管化并长期存活。利用该异种移植模型，一方面可以动态追踪皮质前体细胞在体内的定植与组织再生过程，深入解析肾上腺发育的分子机制；另一方面，该模型能够真实模拟皮质肿瘤在活体内的侵袭特征及对内分泌轴的系统性影响，为临床前机制研究及药效评估提供最接近人体的活体测试环境。

55、此外，得益于本发明优化的培养体系，该类器官展现出极佳的体外可操作性与存活稳定性。技术人员可利用基因编辑技术（如crispr/cas9）对类器官进行特定基因的精准修饰，从而构建用于靶点验证的基因编辑模型。同时，本发明制备的类器官具有良好的冻存与复苏耐受性，支持将不同遗传背景（涵盖正常供体及各类肾上腺疾病患者）的类器官进行标准化处理，从而构建具备多维表型和基因组注释的肾上腺皮质类器官活体样本库，实现珍贵生物医学资源的长期保存与共享应用。

56、本发明具有如下有益效果：

57、本发明针对肾上腺皮质束状带的细胞起源与组织稳态维持机制，提供了一种特定的肾上腺皮质类器官培养基。基于该培养基可以在基质胶中成功构建肾上腺皮质束状带类器官，并且在较短时间内即可形成在形态结构与生理功能上高度接近真实肾上腺皮质束状带的三维类器官。此外，制备所得的肾上腺皮质束状带类器官还具备较高醛固酮分泌能力。

58、使用本发明提供的培养基和培养方法得到的肾上腺皮质三维类器官能够高度模拟真实肾上腺皮质的生理微环境，有效维持细胞的组织特异性，并在组织结构形态及基因与蛋白表达谱方面与真实肾上腺皮质保持高度一致。其具有多方面的应用价值：一方面可以作为可遗传操作的疾病模型，用于肾上腺皮质相关疾病（如库欣综合征）的机制研究，另一方面为类器官移植导向的肾上腺组织再生与功能重建提供了实验路径，进一步为肾上腺功能不全患者的内分泌稳态恢复奠定了兼具转化潜力与平台功能的策略基础。