一种细胞三维迁移能力高通量高含量检测方法与流程

本发明属于细胞迁移能力检测，具体是一种细胞三维迁移能力高通量高含量检测方法，该方法将细胞迁移的真实三维微环境纳入细胞迁移的评价指标，将微观尺度的细胞迁移转换为宏观尺度的水凝胶收缩率，具有细胞消耗量小、稳健性高、无需标记、可实时动态分析、高通量高含量的优势。

背景技术：

1、在生物医学研究的众多领域中，细胞迁移能力的检测一直占据着关键的地位。细胞迁移是许多重要生理过程的核心环节，如胚胎发育过程中细胞的定向移动、组织修复与再生时细胞向受损部位迁移以恢复组织结构与功能、免疫细胞穿越血管内皮迁移到炎症部位发挥免疫防御作用等。深入探究细胞迁移机制，对于理解这些生理现象的本质以及疾病发生发展过程具有不可估量的价值。

2、在疾病研究方面，肿瘤细胞的迁移和侵袭能力是导致肿瘤转移的关键因素。肿瘤转移是大多数癌症患者死亡的主要原因，一旦肿瘤细胞从原发灶迁移并定植到其他组织器官，治疗难度将呈指数级上升。因此，准确检测肿瘤细胞的三维迁移能力，有助于评估肿瘤的恶性程度、预测肿瘤转移风险，为临床制定精准治疗方案提供关键依据。

3、传统的细胞迁移能力检测方法存在诸多局限性。例如，二维细胞迁移模型虽然操作相对简便，但与体内细胞实际所处的三维生理环境相差甚远。在体内，细胞被三维细胞外基质网络所包围，其迁移行为受到三维结构的物理和化学信号的复杂调控。二维模型无法真实反映细胞在三维空间中的迁移路径、速度、方向改变等关键特征，导致实验结果与体内真实情况存在较大偏差。而一些早期的三维细胞迁移检测方法，往往面临通量低的问题。它们通常需要大量的细胞样品和较长的检测时间，难以同时对多种细胞类型、多个实验条件进行大规模筛选。这对于高通量药物筛选、大规模基因功能研究等应用场景来说，效率极为低下，严重制约了相关研究的进展。

4、高含量检测也是现有技术的一大挑战。单纯的细胞迁移距离或速度等参数已无法满足深入研究的需求。研究人员需要获取细胞迁移过程中更丰富的信息，如细胞形态变化、细胞骨架重组、细胞表面标志物表达动态变化等。这些信息对于揭示细胞迁移的分子机制至关重要，但传统检测手段难以在同一实验平台上同步实现多种信息的高含量获取。

技术实现思路

1、鉴于细胞迁移能力检测在生物医学研究中的重要地位以及现有检测技术存在的缺陷，本发明的主要目的在于提供一种细胞三维迁移能力高通量高含量检测方法，以弥补现有技术的不足，为细胞迁移相关研究提供更精准、高效、全面的解决方案，从而推动癌症研究、药物研发、组织工程和再生医学等多个领域的发展。

2、为达到上述目的，本发明提供了一种细胞三维迁移能力高通量高含量检测方法，该方法包括以下步骤：

3、s1：载细胞水凝胶微球的制备；

4、s2：计算水凝胶微球的收缩率；

5、s3：采用水凝胶微球的收缩率表征细胞的迁移能力。

6、上述方案中，步骤s1中所述载细胞水凝胶微球的制备，包括：步骤s11：制备基于pdms的超疏水抗粘附界面；步骤s12：制备载细胞胶原水凝胶微球。

7、上述方案中，步骤s11中所述制备基于pdms的超疏水抗粘附界面，包括：利用匀胶机将pdms前驱体（a液）与交联剂（b液）充分混合，抽真空除泡后，均匀涂覆在常规的商用培养皿或孔板表面，然后将孔板放入电热鼓风干燥箱内，80℃固化12小时；固化好的孔板使用强紫外灯直射1h灭菌。

8、上述方案中，步骤s12中所述制备载细胞胶原水凝胶微球，包括：

9、在冰上预冷超纯水、10×dpbs、1m naoh、i型胶原蛋白溶液；其中超纯水、10×dpbs、1m naoh提前用0.22μm滤器过滤灭菌；

10、细胞准备：选择融合度在80%到90%的细胞，用pbs缓冲液冲洗一次，用胰蛋白酶消化1min，加入相应的完全培养基终止消化，反复吹打后收集细胞悬浮，离心，弃上清液，重悬细胞，调整细胞密度为1×106 cells/ml，置于冰上预冷；

11、依次在离心管中加入适当体积的超纯水、10×dpbs、1m naoh、i型胶原蛋白溶液、细胞悬液；其中1m naoh溶液的体积应为胶原储液体积的1/40；10×dpbs的体积为除去细胞悬液外总溶液体积的1/10；胶原蛋白溶液和细胞悬液的添加量根据目标浓度（密度）计算；此操作在冰上进行；

12、迅速震荡使“胶原预凝液”混合均匀，插于冰上备用；

13、用移液枪或自动滴液系统将“胶原预凝液”滴入疏水处理后的孔板内；对于48孔板，8μl/滴/孔；对于96孔板，4μl/滴/孔；

14、置于37℃细胞孵箱内凝胶50min；

15、加入完全培养基；对于48孔板，300μl/孔；对于96孔板，150μl/孔；加入完全培养基后，包埋有细胞的胶原液滴会自发悬浮于培养基中。

16、上述方案中，在步骤s12中，待测细胞三维培养于水凝胶内部，该水凝胶为模拟细胞微环境的三维水凝胶，该水凝胶需要含有细胞粘附配体；该水凝胶使用细胞外基质水凝胶，包括胶原蛋白、纤连蛋白、基质胶、透明质酸这些天然细胞外基质材料或其混合物；或者在水凝胶大分子骨架上修饰整合素或其他细胞粘附配体，包括修饰含rgd序列的多肽作为整合素α5β1配体，或修饰含redv序列的多肽作为整合素α4β1配体。

17、上述方案中，在步骤s12中，待测细胞三维培养于水凝胶内部，是利用细胞外基质类材料的温敏特性，包括生理ph和离子强度条件下的胶原溶液、基质胶在0-4℃低温条件下为液态，能够与细胞均匀混合，然后置于37℃细胞培养箱中升温凝胶；或者

18、在步骤s12中，待测细胞三维培养于水凝胶内部，是利用温和的、生物相容性良好的化学手段凝胶；包括点击化学、紫外引发的自由基聚合；使用甲基丙烯酰化的胶原、甲基丙烯酰化的透明质酸钠，在加入光引发剂lap(苯基（2,4,6-三甲基苯甲酰基）磷酸锂)的条件下，用405 nm波长的紫外光（30mw）辐照30s凝胶；

19、将细胞均匀混合在水凝胶预凝液中，同时利用微流控技术或超疏水界面将水凝胶制备成球形，以确保水凝胶均匀收缩，并方便体积收缩率的计算。

20、上述方案中，步骤s2中计算水凝胶微球的收缩率，包括：采用体积、面积来表征水凝胶微球的收缩率。

21、上述方案中，在采用体积表征水凝胶微球的收缩率时，通过记录不同时间点的载细胞水凝胶体积，包括但不限于使用普通明场显微镜对水凝胶的体积进行检测；对于制备的球形载细胞水凝胶，直接通过明场显微镜检测水凝胶直径，进而反算出水凝胶体积；将“载细胞水凝胶”的初始体积定义为v0，t时刻的体积定义为vt，将定义为水凝胶微球的收缩率。

22、上述方案中，在采用面积表征水凝胶微球的收缩率时，使用显微镜记录胶原凝胶微液滴的明场图片，水凝胶微球的收缩率（ratio of collagen gel contraction）按照以下公式计算：

23、

24、其中为刚加入培养基时胶原肿瘤微球的赤道面面积，为时刻胶原肿瘤微球的赤道面面积。

25、上述方案中，步骤s3中采用水凝胶微球的收缩率表征细胞的迁移能力，包括： “载细胞水凝胶”在培养过程中会发生体积收缩，宏观的“载细胞水凝胶收缩”能够反应“细胞在该凝胶中的三维迁移”；本实施例推荐采用悬浮于培养基中的方式培养“载细胞水凝胶”，防止水凝胶粘附在培养皿（板）底部产生摩擦力影戏水凝胶收缩的均匀性。

26、从上述技术方案可以看出，本发明提供的细胞三维迁移能力高通量高含量检测方法，相对于现有技术具有以下有益效果：

27、（1）为细胞提供了模拟其真实生理基质的三维迁移微环境。

28、（2）将不易测量的微观尺度的细胞运动转换为方便测量的宏观水凝胶尺寸。

29、（3）高含量分析，一次检测可反映大量细胞的平均迁移能力。

30、（4）操作简便、通量高、文件性好。

31、（5）细胞消耗量小，无需标记，可实时动态分析。

32、（6）与常规的细胞迁移能力检测技术（如划痕实验、transwell）等技术相比，该方法的优势为：为细胞提供了模拟其真实生理基质的三维迁移微环境，将不易测量的微观尺度的细胞运动转换为方便测量的宏观水凝胶尺寸，高通量高含量分析，细胞消耗量小，无需标记，可实时动态分析。