使用新型合成寡核苷酸的等温扩增的制作方法

本发明一般涉及核酸扩增领域，尤其是等温扩增。特别地，本发明涉及新型合成寡核苷酸用于核酸扩增的用途。

背景技术：

1、核酸扩增在分子诊断和其他应用（诸如核酸测序）中起核心作用。聚合酶链式反应（pcr）是最常见和广为人知的扩增方法，而等温扩增是另一种选择。pcr依赖于热循环，而等温扩增反应在单一温度下发生，这使其更适合用于即时检测（point-of-care）装置。然而，等温扩增通常不如pcr灵敏和/或特异，并且等温扩增的出结果时间可能比pcr更长。等温方法面临的一个挑战是脱靶引发，这导致非靶核酸的扩增。

2、pcr使用加热使dna双链体变性，而等温扩增在设定的温度下进行，因此不能使用加热来使扩增子变性。为了解决这一问题，可使用内切核酸酶切割引物，留下3'-oh残基。该部分可用于通过链置换聚合酶来启动聚合，该聚合酶侵入、延伸并置换被扩增的链。现有的等温技术采用一系列产生切口或切割的酶。本公开描述了rna酶h1作为切割酶的首次使用。另外，本公开首次在等温技术中采用含有n3'-p5'核糖氨基磷酸酯的合成寡核苷酸，这些寡核苷酸本身具有一个或两个3'末端天然核糖核苷酸或散布有天然核糖核苷酸。

技术实现思路

1、在各个实施方案中，本文所描述的核酸扩增测定以几种方式增强等温扩增的特异性。首先，可通过用内切核酸酶（例如rna酶h1）进行序列特异性切割在高温下激活3'封闭的引物。高温激活提高了被切割引物的保真度，因为错配的双链体在高温下较不稳定。rna酶h1提供了额外的序列特异性，因为仅完美的rna/dna杂交体被识别并被切割以释放3'-oh用于引物激活。其次，扩增测定可采用一类新的合成寡核苷酸，其含有抗核酸酶降解的n3'-p5'核糖氨基磷酸酯核心。这种抗核酸酶降解的核心有助于控制引物中发生切割的位置。第三，“循环探针”可为扩增测定提供额外的灵敏度和序列特异性。循环探针可被设计为内切核酸酶（例如rna酶h1）的底物。循环探针还可含有核酸酶抗核酸酶降解的n3'-p5'核糖氨基磷酸酯核心，以提供对探针切割的更大控制。可设计采用同一种内切核酸酶（例如rna酶h1）来激活封闭的引物以及切割循环探针的测定法。

2、本文涵盖的各个实施方案可包括但不必限于以下中的一项或多项。

3、实施方案1：一种寡核苷酸，其包含与至少一个3'修饰的核糖核苷酸相邻的至少一个核糖核苷酸，其中所述3'修饰的核糖核苷酸在3'位置处包含抑制rna酶h1水解的水解稳定修饰。

4、实施方案2：如实施方案1所述的寡核苷酸，其中所述至少一个3'修饰的核糖核苷酸包含3'-氨基核糖核苷酸。

5、实施方案3：如实施方案1或实施方案2所述的寡核苷酸，其中所述至少一个3'-氨基核糖核苷酸包含非天然核苷酸碱基。

6、实施方案4：如实施方案3所述的寡核苷酸，其中所述非天然核苷酸碱基选自由以下组成的组：胸腺嘧啶、肌苷、黄苷、异鸟苷、异胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-硫代胸腺嘧啶、次黄嘌呤、n4-乙基胞嘧啶、6-氨基-5-硝基-3-(1’-β-d-2’-呋喃核糖基)-2(1h)-吡啶酮和2-氨基-8-(1’-β-d-2’-呋喃核糖基)-咪唑并[1,2-a]-1,3,5-三嗪-4(8h)-酮。

7、实施方案5：如实施方案1-4中任一项所述的寡核苷酸，其中所述3'-氨基核糖核苷酸包含3'-氨基核糖胸苷核苷酸、3'-氨基核糖腺嘌呤核苷酸或其组合。

8、实施方案6：如实施方案1-5中任一项所述的寡核苷酸，其中所述至少一个核糖核苷酸包含天然核糖核苷酸碱基。

9、实施方案7：如实施方案2-6中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含切割盒，所述切割盒包含所述至少一个核糖核苷酸和所述至少一个3'-氨基核糖核苷酸，其中所述切割盒包含：连接至5'核苷酸序列的5'端；和连接至3'核苷酸序列的3'端。

10、实施方案8：如实施方案7所述的寡核苷酸，其中所述切割盒包含总共至少五个核糖核苷酸和3'-氨基核糖核苷酸的组合，可选地总共至少七个核糖核苷酸和3'-氨基核糖核苷酸。

11、实施方案9：如实施方案1-8中任一项所述的寡核苷酸，其中所述核糖核苷酸位于所述切割盒的3'端。

12、实施方案10：如实施方案9所述的寡核苷酸，其中所述切割盒在所述切割盒的3'端包含至少两个核糖核苷酸。

13、实施方案11：如实施方案1-10中任一项所述的寡核苷酸，其中所述3'-氨基核糖核苷酸位于所述核糖核苷酸的5'。

14、实施方案12：如实施方案1-11中任一项所述的寡核苷酸，其中所述切割盒包含多个核糖核苷酸和多个3'-氨基核糖核苷酸。

15、实施方案13：如实施方案12所述的寡核苷酸，其中所述切割盒在3'端包含两个核糖核苷酸，所述两个核糖核苷酸连接至包含多个3'-氨基核糖核苷酸的区段。

16、实施方案14：如实施方案13所述的寡核苷酸，其中所述多个3'-氨基核糖核苷酸包含至少四个3'-氨基核糖核苷酸，可选地至少五个3'-氨基核糖核苷酸。

17、实施方案15：如实施方案12或实施方案13所述的寡核苷酸，其中所述多个3'-氨基核糖核苷酸彼此相邻。

18、实施方案16：如实施方案7-15中任一项所述的寡核苷酸，其中所述切割盒包含至少rn-rn-arn-arn。

19、实施方案17：如实施方案12所述的寡核苷酸，其中所述切割盒在3'端包含两个核糖核苷酸，所述两个核糖核苷酸连接至包含散布有多个核糖核苷酸（rn）的多个3'-氨基核糖核苷酸（arn）的区段。

20、实施方案18：如实施方案17所述的寡核苷酸，其中所述区段包含至少rn-arn-rn-arn。

21、实施方案19：如实施方案7-18中任一项所述的寡核苷酸，其中所述切割盒包含多个3'-氨基核糖核苷酸，所述多个3'-氨基核糖核苷酸包含多于一种类型的碱基，可选地选自胸腺嘧啶和腺嘌呤的组合。

22、实施方案20：如实施方案7-18中任一项所述的寡核苷酸，其中所述切割盒包含多个3'-氨基核糖核苷酸，所述多个3'-氨基核糖核苷酸包含一种类型的碱基，可选地选自胸腺嘧啶或腺嘌呤。

23、实施方案21：如实施方案7-20中任一项所述的寡核苷酸，其中所述切割盒包含多个核糖核苷酸，所述多个核糖核苷酸包含多于一种类型的碱基。

24、实施方案22：如实施方案7-20中任一项所述的寡核苷酸，其中所述切割盒包含多个核糖核苷酸，所述多个核糖核苷酸包含一种类型的碱基。

25、实施方案23：如实施方案7-22中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含含有3'封闭基团的可切割引物。

26、实施方案24：如实施方案7-20中任一项所述的寡核苷酸，其中5'核苷酸序列和3'核苷酸序列均包含脱氧核糖核苷酸。

27、实施方案25：如实施方案7-23中任一项所述的寡核苷酸，其中所述切割盒在5'端包含一个或多个2’-o-甲基核糖核苷酸。

28、实施方案26：如实施方案7-25中任一项所述的至少两个寡核苷酸的组合，其中一个寡核苷酸是正向引物，并且一个寡核苷酸是反向引物，用于扩增靶核酸。

29、实施方案27：如实施方案26所述的组合，其中至少一个寡核苷酸包含如实施方案13所述的寡核苷酸，并且另一个寡核苷酸包含切割盒，所述切割盒在3'端包含两个核糖核苷酸，所述两个核糖核苷酸连接至包含散布有多个核糖核苷酸（rn）的多个3'-氨基核糖核苷酸（arn）的区段，其中所述切割盒还包含：与5'核苷酸序列连接的5'端；和与3'核苷酸序列连接的3'端。

30、实施方案28：如实施方案27所述的组合，其中至少一个寡核苷酸包含如实施方案14所述的寡核苷酸，并且另一个寡核苷酸包含切割盒，所述切割盒在3'端包含两个核糖核苷酸，所述两个核糖核苷酸连接至包含至少rn-arn-rn-arn的区段，其中所述切割盒还包含：与5'核苷酸序列连接的5'端；和与3'核苷酸序列连接的3'端。

31、实施方案29：如实施方案27或实施方案28所述的组合，其中所述至少一个寡核苷酸包含切割盒，所述切割盒在3'端具有至少两个核糖核苷酸，所述至少两个核糖核苷酸连接至包含至少arn-arn-arn-arn的区段。

32、实施方案30：如实施方案27-29中任一项所述的组合，其中所述3'-氨基核糖核苷酸包含一种类型的碱基。

33、实施方案31：如实施方案27-29中任一项所述的组合，其中所述3'-氨基核糖核苷酸包含多于一种类型的碱基。

34、实施方案32：如实施方案26-31中任一项所述的组合，其中所述组合包含多个包含所述正向引物和所述反向引物的所述至少两个寡核苷酸，其中每对正向引物和反向引物检测不同的靶核酸。

35、实施方案33：如实施方案1-25中任一项所述的寡核苷酸或如实施方案26-32中任一项所述的组合，其中所述寡核苷酸或组合被容纳在用于检测样品中的一种或多种靶核酸的卡盒内，所述卡盒包括：卡盒主体，其内部包含多个室，其中所述多个室包括：样品室，其至少具有与所述多个室中的另一个室流体连通的流体出口；可选的裂解室，其与所述样品室流体连通，可选地其中所述样品室和所述裂解室是同一室；试剂室，其包含所述寡核苷酸中的一者或多者和/或所述组合中的一者或多者；和反应容器，其与所述卡盒主体的所述多个室流体耦接，并被配置用于：i)扩增核酸，以及可选地，ii)检测和鉴定一种或多种扩增产物；以及过滤器，其设置在如果存在的所述裂解室或所述样品室与所述反应容器之间的流体路径中。

36、实施方案34：一种用于扩增靶核酸的方法，其中所述方法包括使样品核酸与以下物质：包含如实施方案7-25中任一项所述的寡核苷酸的引物，和另一种引物；或如实施方案26-31中任一项所述的组合，其中每种寡核苷酸用作引物；在适合于引物延伸的条件下在反应混合物中接触。

37、实施方案35：如实施方案34所述的方法，其中所述方法包括如果在所述样品核酸中可检测到的话，检测所述靶核酸。

38、实施方案36：如实施方案34或35所述的方法，其中所述方法包括等温方法。

39、实施方案37：如实施方案34-36中任一项所述的方法，其中：所述寡核苷酸包含含有3'封闭基团的可切割引物；或者所述组合包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含含有3'封闭基团的可切割引物；并且所述方法包括使所述可切割引物与其靶核苷酸序列退火，并用rna酶h1切割所述可切割引物以释放所述封闭基团。

40、实施方案38：如实施方案37所述的方法，其中所述rna酶h1在所述切割盒的3'端切割。

41、实施方案39：如实施方案37或38所述的方法，其中所述rna酶h1是热稳定的rna酶h1，可选地来自嗜热栖热菌（thermus thermophilus）或大肠杆菌（echerichia coli）。

42、实施方案40：如实施方案34-39中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含探针。

43、实施方案41：如实施方案40所述的方法，其中所述探针包含线性探针，并且生成所述探针能够结合的核苷酸序列的所述引物以超过另一种引物的量被包含在所述反应混合物中。

44、实施方案42：如实施方案40或41所述的方法，其中所述探针包含荧光染料和猝灭剂分子。

45、实施方案43：如实施方案40-42中任一项所述的方法，其中所述探针包含循环探针。

46、实施方案44：如实施方案43所述的方法，其中所述循环探针包含不超过三个核糖核苷酸。

47、实施方案45：如实施方案44所述的方法，其中所述三个核糖核苷酸包含位于所述循环探针的5'端附近的核糖核苷酸核心。

48、实施方案46：如实施方案44所述的方法，其中所述不超过三个核糖核苷酸在任一端侧接有含2’-o-甲基碱基的序列。

49、实施方案47：如实施方案34-46中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为100mu/µl至600mu/µl的聚合酶，可选地其中所述聚合酶包含bst 3.0。

50、实施方案48：如实施方案37-47中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为700mu/µl至1300mu/µl的所述rna酶h1。

51、实施方案49：如实施方案34-48中任一项所述的方法，其中所述方法包括多重扩增。

52、实施方案50：如实施方案37-49中任一项所述的方法，其中所述方法在卡盒内进行。

53、实施方案51：如实施方案50所述的方法，其中所述卡盒包括：卡盒主体，其内部包含多个室，其中所述多个室包括：样品室，其至少具有与所述多个室中的另一个室流体连通的流体出口；可选的裂解室，其与所述样品室流体连通，可选地其中所述样品室和所述裂解室是同一室；试剂室，其包含所述寡核苷酸中的一者或多者和/或所述组合中的一者或多者；和反应容器，其与所述卡盒主体的所述多个室流体耦接，并被配置用于：i)扩增核酸，以及可选地，ii)检测和鉴定一种或多种扩增产物；以及过滤器，其设置在如果存在的所述裂解室或所述样品室与所述反应容器之间的流体路径中。

54、实施方案52：一种试剂盒，其包含如实施方案1-25中任一项所述的寡核苷酸或如实施方案26-32中任一项所述的组合，其中所述试剂盒包含链置换聚合酶。

55、实施方案53：如实施方案52所述的试剂盒，其中所述试剂盒另外包含rna酶h1。

56、实施方案54：如实施方案52或53所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸或组合其中所述寡核苷酸或组合被容纳在用于检测样品中的一种或多种靶核酸的卡盒内，所述卡盒包括：卡盒主体，其内部包含多个室，其中所述多个室包括：样品室，其至少具有与所述多个室中的另一个室流体连通的流体出口；可选的裂解室，其与所述样品室流体连通，可选地其中所述样品室和所述裂解室是同一室；试剂室，其包含所述寡核苷酸中的一者或多者和/或所述组合中的一者或多者；和反应容器，其与所述卡盒主体的所述多个室流体耦接，并被配置用于：i)扩增核酸，以及可选地，ii)检测和鉴定一种或多种扩增产物；以及过滤器，其设置在如果存在的所述裂解室或所述样品室与所述反应容器之间的流体路径中。

57、实施方案55：如实施方案33所述的寡核苷酸或组合、如实施方案51所述的方法或如实施方案54所述的试剂盒，其中链置换聚合酶被设置在所述多个室中的一个室内。

58、实施方案56：如实施方案33所述的寡核苷酸或组合、如实施方案51所述的方法或如实施方案54所述的试剂盒，其中rna酶h1被设置在所述多个室中的一个室内。

59、实施方案57：如实施方案33所述的寡核苷酸或组合、如实施方案51所述的方法或如实施方案54所述的试剂盒，其中链置换聚合酶被设置在所述多个室中的一个室内，并且rna酶h1被设置在所述多个室中的一个室内。

60、实施方案58：如实施方案33所述的寡核苷酸或组合、或如实施方案51所述的方法、或如实施方案54所述的试剂盒，其中所述卡盒是《临床实验室改进修正案》（clia）合规卡盒。

61、实施方案59：如实施方案33所述的寡核苷酸或组合、或如实施方案51所述的方法、或如实施方案54所述的试剂盒，其中所述方法是即时检测方法。

62、实施方案60：如实施方案33所述的寡核苷酸或组合、或如实施方案51所述的方法、或如实施方案54所述的试剂盒，其中所述卡盒包含与外源对照和/或内源对照选择性杂交的引物对，其中所述外源对照是样品处理对照，并且其中所述内源对照是样品充分性对照。

63、实施方案61：如实施方案33所述的寡核苷酸或组合、或如实施方案51所述的方法、或如实施方案54所述的试剂盒，其中所述卡盒有助于在将所述样品放入卡盒的时间起30分钟内、20分钟内或10分钟内检测所述样品中的靶核酸。