用于测定的扰动珠的制作方法

本公开提供了一种独特地标记的扰动珠，其单独使用或与捕获珠组合使用。这些扰动珠可用于药物发现，例如在映射测定装置中进行的测定。技术背景针对在珠的集合上生成的化合物组合文库所进行的测定，通常采用高通量测定装置，其中珠群体被用于测定装置，单个珠与一个或多个细胞在检测区域中组合。此类测定可使用具有多达5,000,000个或更多个体扰动珠的组合库进行，所述各珠都结合有多个相同的独特可释放扰动元件。每个检测区域中的测定通常包括从扰动珠释放的扰动元件，所述元件随后扰动该检测区域中的一个或多个细胞。测定完成后，依惯例通过评估细胞响应扰动而表达的核酸变化，来确定该扰动对细胞产生的影响。也可以使用dna条形码抗体来评估蛋白质表达变化，从而通过响应于扰动的总核酸变化来标识基因组和蛋白质组的变化（“扰动组分”）。扰动珠还包含可释放的寡核苷酸，所述寡核苷酸编码该珠上的特定扰动元件（“扰动寡核苷酸”），这使得技术人员能够将基因和蛋白质表达的变化与引起这些变化的扰动元件回溯关联起来。在某些情况下，检测区域内还可以包含捕获珠。该捕获珠可以捕获从扰动珠释放的扰动寡核苷酸以及细胞裂解后从细胞中释放的核酸。测定结束时，优选将每个检测区域的捕获珠合并，然后对捕获的扰动寡核苷酸和核酸进行测序。通过这种方法，技术人员可以了解哪些扰动化合物与从裂解细胞中回收的核酸相联系。本文将这种信息称为下文定义的“静态功能”的变化，因为它衡量了测定完成后扰动的影响。然而，由于捕获珠被合并，这种方法无法提供将静态功能变化与测定在其中进行的测定装置中特定检测区域回溯关联起来的信息。如果能够做到这一点，就可以将关于单个测定的更有实质意义的信息与静态功能的变化结合起来。这些变化将包括（但不限于）给定扰动元件在测定过程中引起的细胞功能变化。为此，必须找到一种方法，使捕获珠裂解细胞后回收的产物包含编码特定扰动珠和含有该珠的特定检测孔的信息。换言之，将仅从测定中获取的信息仅限于扰动元件的结构以及响应该扰动而产生的核酸（包括经由dna条形码抗体的基因组和蛋白质组变化），则只能在测定结束时提供采集的捕获时的静态变化信息。然而，如果技术人员还能分析测定过程中由扰动引起的细胞功能动态变化，例如细胞形态的变化、细胞表面标志物的变化（包括新标志物的出现或现有标志物的改变或消失）以及其他此类相关信息，则可以将这些信息与静态功能变化相结合，从而提供扰动元件对细胞的影响的更全面的理解。因此，目前仍然需要从多样化化合物文库的测定中发现的一个或多个检测区域中，增加可获取的信息量。这些额外信息将丰富每次测定所获得的知识，并有助于药物发现。

背景技术：

技术实现思路

1、本公开提供了独特标记的扰动珠。本公开还提供了独特标记的扰动珠与捕获珠的组合。无论哪种情况，如本文所述的扰动珠，无论单独使用还是与捕获珠组合使用，均被配置为可用于分析在细胞暴露于扰动元件后在测定期间产生的细胞功能变化，以及可提供必要的静态信息，以提供扰动元件对细胞的影响的更全面的分析。

2、在一些实施方案中，提供了一种标记的扰动珠，其包含：

3、可释放地附接于该珠的相同扰动元件的多个拷贝，其对于该珠是独特的；

4、光学可检测标记或标记集合，其对于该扰动珠是独特的；和

5、可释放地附接于所述扰动珠的独特扰动寡核苷酸的多个拷贝，其编码所述扰动元件以及扰动珠上的独特标记或标记的组合。

6、在一些实施方案中，所述扰动寡核苷酸还包含：

7、第一结合元件和任选的第二结合元件或其前体，其中所述第一结合元件与可释放地结合在捕获珠上的互补捕获结合元件互补并与其相联系；和

8、所述第二结合元件与来自裂解细胞的一种或多种扰动组分上存在的互补结合元件互补并与其相联系。

9、在一些实施方案中，提供了扰动寡核苷酸上第二结合组分或其前体，所述第二结合组分或其前体与裂解细胞释放的一种或多种扰动组分互补并与之相联系，前提是所述第一结合元件与捕获珠结合，则所述第二结合元件存在并与扰动组分结合。

10、在一个实施方案中，提供了扰动珠的群体，每个珠包含：

11、a)可释放地附接于该珠的相同扰动元件的多个拷贝，其对于该珠是独特的；

12、b) 光学可检测标记或标记集合，其对于所述群体中的每个所述扰动珠是独特的；和

13、c)可释放地附接于所述扰动珠的独特扰动寡核苷酸的多个拷贝，其编码所述扰动元件以及扰动珠上的独特标记或标记的组合。

14、其中所述扰动寡核苷酸还包含第一结合组分和任选的第二结合组分或其前体，其中所述第一结合元件与可释放地结合在捕获珠上的互补功能部分或从裂解细胞释放的扰动组分互补并与之相联系，并且

15、其中所述任选的第二结合组分或其前体与裂解细胞释放的一种或多种扰动组分互补并与之相联系，前提是所述第一结合元件与捕获珠结合，则所述第二结合元件存在并与扰动组分结合。

16、在一些实施方案中，所述扰动寡核苷酸还包含第一结合元件和第二结合元件或其前体，其中所述第一结合元件与可释放地结合在捕获珠上的互补功能部分或从裂解细胞释放的扰动组分互补并相联系，且其中所述第二结合元件或其前体与由裂解细胞释放的一种或多种扰动组分互补并相联系。

17、在一些实施方案中，扰动寡核苷酸编码扰动元件和与扰动珠相联系的独特标记或标记集合。

18、在一些实施方案中，扰动寡核苷酸包含两个不同的组分。一个组分编码珠上的扰动元件，另一个组分编码所述扰动珠上的独特标记或标记集合。在一些实施方案中，这两个组分彼此附接以形成单个扰动寡核苷酸。

19、在一些实施方案中，提供式i的扰动珠：

20、                            (i)

21、其中：

22、w是光学可检测标记或光学可检测标记的集合，所述标记独特标识扰动珠；

23、pb是扰动珠；

24、pe是扰动元件；

25、l是可释放的接头；

26、l1是可释放的接头，其可与l相同或不同，并且不同时，l和l1可以用相同的刺激或不同的刺激进行切割；

27、q是扰动寡核苷酸，其编码扰动元件和独特标记或标记集合；

28、q1是结合元件；

29、x是键或结合元素，其中，当x是结合元件时，它可以与q1相同或不同；

30、

m是1至100的整数（或更大，例如取决于珠和/或标记的尺寸），其中m代表与扰动珠结合的可区分的光学可检测标记的数量；

31、n表示与扰动珠结合的此类(l-x-q-q1)组的数量（例如，多个）；并且

32、p表示与扰动珠结合的此类(pe)组的数量（例如，多个）。

33、在一些实施方案中，l和l1使用相同的刺激切割。当两者都被切割时，测定溶液将含有多个pe和多个式ii所表示的组：

34、x-q-q1                                          (ii)

35、其中x、q和q1的定义如上所述。在一些实施方案中，本文提供了由式ii表示的寡核苷酸。

36、在一些实施方案中，提供了一种可用于测定的捕获珠，其具有如式iii所示的结构：

37、cb-(l2-ce)s                                     (iii)

38、其中，cb为捕获珠，ce为cb上的捕获元件，l2为可释放的接头，其连接多个捕获元件ce至cb，

s表示该多个组的数量。在这种情况下，x和q1其中之一是ce的互补结合元件，而x和q1其中另一者可以结合从裂解细胞中回收的扰动组分(pc)。如此结合后所得的捕获珠的结构由式iv和v表示：

39、cb-(l2-ce-x-q-q1)s’                                           (iv)

40、以及

41、cb-(l2-ce-q1-q-x)s’                                          (v)

42、基于x和q1中哪一个与ce互补，并且s'是s的结合分数。

43、在一些实施方案中，x是结合元件，其可与q1的结合元件不同。

44、在一些实施方案中，q1是捕获珠结合元件ce的互补功能部分，且x是从裂解细胞释放的扰动组分的结合元件。在其他实施方案中，x是捕获珠结合元件ce的互补功能部分，且q1是从裂解细胞释放的扰动组分的结合元件。

45、在一些实施方案中，x具有扰动组分的互补功能部分。

46、在某些实施方案中，

n、

p、s和

s’的范围为1 x 105至6.02 x 1017。

47、在一些实施方案中，对于n个l-x-q-q1组中的每一个，q1可以是相同的捕获元件或不同的捕获元件。在一些实施方案中，对于n个l-x-q-q1组中的每一个，x可以是相同的捕获元件或不同的捕获元件。此类相同或不同的捕获元件可包括（仅举例而言）：互补寡核苷酸链、亲和素、链霉亲和素、生物素、抗体、抗体的结合部分、酶、酶结合结构域、酶或酶结合结构域的底物等。

48、在一些实施方案中，当x是结合元件且在没有捕获珠的情况下从扰动珠释放x-q-q1时，提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸是通过裂解可释放接头l并裂解细胞后获得的，且由式vi表示：

49、pc1-x-q-q1-pc2 (vi)

50、其中x、q和q1如上所述，pc1和pc2是独立的扰动组分，pc如上所述，它们可以彼此相同或不同。

51、在一些实施方案中，上述实施方案的每一个中的扰动元件是多种相同化合物，所述化合物对于各珠是独特的。

52、在一些实施方案中，扰动寡核苷酸在其相对于扰动珠的远端和/或近端包含x和q1组，其包含链状多核苷酸，该多核苷酸具有最多2,000个重复单元，这些重复单元可以是鸟嘌呤单元、胞嘧啶单元、腺嘌呤单元或胸腺嘧啶单元。在一些实施方案中，x和q1是不同的。

53、在一些实施方案中，扰动寡核苷酸在其近端包含链状多核苷酸，该多核苷酸具有至多2,000个单元的胞嘧啶或鸟嘌呤，在其相对于珠的远端具有至多2,000个单元的胸腺嘧啶。

54、在一些实施方案中，扰动寡核苷酸包含多聚胸腺嘧啶（poly-t），其相对于扰动珠的远端或近端具有亲和素、链霉亲和素或生物素基团。

55、在一些实施方案中，提供了一种扰动珠和捕获珠的组合，其中所述组合包含：

56、如上文公式i所述的扰动珠；以及

57、一种捕获珠，其包含可释放地结合其上的相同捕获元件的多个拷贝；

58、其中，所述扰动珠和所述捕获珠的所述组合被包含在记忆该组合的注册表中；

59、前提是：

60、a) 如果所述扰动珠包含独特标记或标记集合，则所述标记由独特寡核苷酸编码，该寡核苷酸被整合到所述扰动寡核苷酸中或上；以及

61、b)如果扰动寡核苷酸不编码所述标记，则扰动珠还包含编码所述标记的标记寡核苷酸，并且所述标记寡核苷酸可释放地附接到所述扰动珠上，并且所述释放的标记寡核苷酸和所述扰动寡核苷酸可彼此附接。

62、在一些实施方案中，标记寡核苷酸可逆地结合到扰动珠上，其任一端终止于带有poly-g或poly-c寡核苷酸的捕获元件；而扰动寡核苷酸可逆地结合到珠上，其一端终止于poly-t寡核苷酸捕获元件，另一端终止于poly-c或poly-g寡核苷酸，使得当两个寡核苷酸及其结合元件释放后，标记寡核苷酸将与扰动寡核苷酸杂交，从而形成连续的寡核苷酸，该寡核苷酸在单链上具有标记寡核苷酸和扰动寡核苷酸，同时保留poly-t寡核苷酸以捕获从裂解细胞中释放的核酸。

63、在一些实施方案中，捕获的核酸是mrna。

64、在一些实施方案中，捕获的核酸是mrna和核酸条形码，其附接于与固定或裂解细胞中的蛋白质结合的抗体上。

65、在一些实施方案中，提供了一种组合，该组合包含本文所述的单个扰动珠和映射测定装置的至少多个检测区域中的单个捕获珠；

66、其中，每个所述单个扰动珠均包含标记或标记集合，所述标记对该珠是独特的，其中该珠由可释放地结合其上的寡核苷酸编码，并且，所述捕获珠包含可释放地结合其上的相同捕获元件的多个拷贝，并且

67、此外，其中已记录位于各已填充检测区域中的所述特定扰动珠的注册表，以将该特定扰动珠记忆至该特定检测区域。

68、在一些实施方案中，光学可检测标记或光学可检测标记集合选自图像、代码、形状、颜色、可诱导颜色、文字、数字、符号、条形码、通用产品代码(upc)代码、量子点(qd)、发光二极管(led)和引入到扰动珠上的材料，或它们的组合。

69、在一些实施方案中，扰动寡核苷酸编码用于本文所述分池方案中扰动化合物合成的每个反应步骤。在一些实施方案中，在分池合成的每个步骤中，将独特标记附接到每个反应容器中的每个珠上，使得完全延伸的寡核苷酸既编码附接到该珠上的化合物，也编码与该珠联系的独特代码。

70、在一些实施方案中，每个容器中编码反应步骤的每个寡核苷酸链包含约6至约2,000个单独的核苷酸；优选约100至约2,000个核苷酸；更优选约800至约1,500个核苷酸。

71、在一些实施方案中，捕获元件是寡核苷酸。

72、在一些实施方案中，捕获珠上的寡核苷酸捕获元件通过杂交与扰动寡核苷酸上的互补捕获元件附接。

73、在一些实施方案中，扰动寡核苷酸包含一个或多个捕获元件，或者可被修饰为包含额外的捕获元件。在一些实施方案中，扰动寡核苷酸上的捕获元件之一与捕获珠上的捕获元件互补。在一些实施方案中，扰动寡核苷酸上的其他捕获元件与捕获珠上的捕获元件正交。

74、在一些实施方案中，包含捕获元件的扰动寡核苷酸的附接可以是直接的或通过接头。

75、在一些实施方案中，接头是可释放的接头。

76、在一些实施方案中，捕获元件不是寡核苷酸。在一些实施方案中，捕获元件是待捕获的扰动组分的受体或配体。此类受体包括扰动化合物的抗体或抗体结合片段；扰动组分的酶或酶受体；特定细胞因子或趋化因子的受体等等。

77、在一些实施方案中，捕获珠上的捕获元件是亲和素/链霉亲和素，用于捕获扰动组分或经修饰含有亲和素基团的扰动寡核苷酸。例如，扰动寡核苷酸的远端末端可以包含生物素，其近端末端可以包含poly-t寡核苷酸捕获元件；而捕获珠可具有亲和素或链霉亲和素作为其捕获元件的部分。当生物素-扰动寡核苷酸-poly-t从扰动珠上释放后，扰动寡核苷酸一端的亲和素和生物素之间会形成紧密复合物，而另一端则保留poly-t结合元件，可用于与核酸结合。

78、在一些实施方案中，捕获元件是poly-t。

79、在一些实施方案中，提供了库或注册表，其包含对每个标记或可检测标记集合的列举，所述标记编码特定的扰动珠和测定装置中对每个扰动珠的特定检测区域。

80、在一些实施方案中，提供了用于将映射测定装置中单个检测区域内发现的每个扰动珠关联起来的方法，该映射测定装置具有多个检测区域，每个检测区域包含单个扰动珠，该方法包括：

81、a)用光学可检测标记或光学可检测标记集合对每个所述扰动珠进行编码，所述标记对该珠是独特的，并且其中每个所述扰动珠包含多种扰动化合物，其中扰动化合物的结构和独特标记的结构都被编码到扰动寡核苷酸上或内部；

82、b)将各独特标记的扰动珠与所述装置中的各检测区域联系起来；以及

83、c)将各扰动珠的各位置记忆到映射测定装置上的特定检测区域。

84、在一些实施方案中，相关性是通过图像进行的，该图像将每个光学可检测的捕获珠与映射上的一个位点对齐。

85、在一些实施方案中，光学可检测标记可以是嵌入和/或附接于扰动珠和/或检测区域中的微组分。该微组分可包括与该检测区域内待进行的测定相关的附加信息。这些附加信息包括（仅作示例）：测定条件、测定期间细胞功能的变化、化合物合成中至少一个步骤所用的合成反应、合成过程中所用的一种或多种反应条件的标识、执行测定的技术人员、测定日期、测定溶液的ph值，或其组合。每个检测区域中每个所述扰动珠上的独特光学可检测标记可以通过摄影、摄像、条形码、二维码等方式记录。

86、在一些实施方案中，可以通过添加到检测区域的微组分将此类附加信息包含在扰动珠上。此类编码有此类附加信息的微组分在以下项中进行了描述：2023年5月9日提交的美国专利申请序列号18/195,049，题为“用于捕获基因组信息以进行功能和成像分析的高通量单细胞测定及其使用方法”，该专利申请要求享有2024年5月9日提交的美国临时专利申请序列号63/339,782的优先权；国际专利申请序列号pct/us24/23594，题为“用于多孔板测定装置的细胞转移组件”，申请日为2024年4月8日；和/或美国临时专利申请序列号63/494,621、63/494,628和63/494,636，均于2023年4月6日提交。上述每项申请的全部内容均以引用方式并入本文。

87、在一些实施方案中，微组分可以是不同的形状，也可以是相同形状但颜色不同，或者在置于其上不同的图像，例如不同的描述、条形码、信息、二维码等。在一些实施方案中，不同的微组分组合使用。在一些实施方案中，不同的图像包含在同一微组分上，使得这些图像的组合构成一个独特的微组分。参见，例如，图5c，其中该微组分含有4个象限，每个象限含有一个图像，例如图画、文字信息等；这些图像的组合对于该微组分而言是独特的。

88、在一些实施方案中，独特的微组分或独特微组分的组合可提供与给定检测区域独特地相联系的独特图像。在一些实施方案中，每个使用的微组分都具有与其相联系的多个相同的独特寡核苷酸链。在一些实施方案中，该独特链可逆地附接到微组分上。

89、在一些实施方案中，接头与独特的扰动珠组合使用。在一些实施方案中，接头可逆地附接于微组分，且该接头以与用于扰动珠上的接头正交的释放方式释放。

90、在一些实施方案中，扰动珠上的扰动寡核苷酸仅编码由其合成的化合物的结构。在一些实施方案中，扰动寡核苷酸在其远端包含结合元件。在一些实施方案中，微组分上的寡核苷酸链可具有结合至其的互补的寡核苷酸结合元件，从而允许与扰动寡核苷酸上的结合元件杂交。

91、在一些实施方案中，具有其上的独特标记或标记组合的单个微组分具有编码该标记的独特寡核苷酸链，该寡核苷酸链通过可切割的接头附接到微组分上，该可切割接头以与珠上使用的接头正交的方式进行切割。在优选实施方案中，编码此类微组分的寡核苷酸链包含结合元件，该结合元件与扰动寡核苷酸远端上的结合元件互补，使得在释放时，来自微组分的寡核苷酸链将与扰动寡核苷酸远端的结合元件杂交。

92、在一些实施方案中，使用多个微组分，使得这些微组分的组合对于测定装置上的检测是独特的。在一些实施方案中，微组分上的寡核苷酸链能够通过利用各组件上结合元件的独特组合，或者通过利用正交切割接头，与扰动寡核苷酸杂交，从而使所述寡核苷酸链能够被释放并依序与扰动寡核苷酸杂交。

93、在一些实施方案中，上述微组分可与标记或部分标记的扰动珠组合使用，该扰动珠编码或部分编码其上合成的化合物。在一些实施方案中，用于合成化合物的反应序列中的一个或多个步骤由微组分或微组分的组合进行编码。在一些实施方案中，独特的微组分的集合提供如上所述有关反应条件等的信息。

94、在一些实施方案中，通过拍照或录像记录独特的微组分或微组分组合，以使这些独特的微组分或微组分组合被发现的检查区域相关联。在一些实施方案中，摄影或摄像以数字方式记录。

95、此外，所述扰动珠上的独特标记或独特标记集合可以进一步汇编到所述库中，从而提供一套完整的信息，使技术人员将扰动珠与特定的检测区域相关联。此外，由珠捕获的扰动组分，将通过编码该扰动元件和独特标记的扰动寡核苷酸，被标识为源自特定的扰动珠。反过来，通过映射将可检测标记与检测区域关联起来，可标识与该捕获珠一起使用的检测区域。这使得能够追踪捕获的扰动组分，追溯到扰动寡核苷酸，进而追溯到其编码的标记，该标记标识扰动组分来源的特定检测区域，以及标识引起扰动的扰动元件。

96、在一些实施方案中，捕获珠可以用式vii表示：

97、(v)r-cb-(l4-x1-q2)b                                    (vii)

98、其中cb是捕获珠，l4是可释放的接头，

b表示与珠结合的多个此类(l4-x1-q2)组，q2是捕获元件，x1是键或第二捕获元件，其可与q2相同或不同，且v是任选的独特标记或独特标记集合，且

r是0至100的整数（或更大，例如基于标记和cb的尺寸）。

99、当r为零且x1为键时，捕获珠由公式viii表示：

100、cb-(l4-q2)b                                   (viii)

101、在一些实施方案中，在式viii中，当x1为结合元件时，q2与x1的附接可以是彼此直接的，也可以是通过接头（未示出）进行的。捕获元件q2和x1（如果存在）的每一个可以相同或不同。在一些实施方案中，q2和x1之一为寡核苷酸，其包含与扰动寡核苷酸上的互补功能部分互补的官能团。在一些实施方案中，q2和x1中的另一者是与裂解细胞的一个或多个扰动组分互补的官能团。

102、在一些实施方案中，对于

b的每个实例，q2可以是与其他实例中相同或不同的捕获元件。在一些实施方案中，捕获珠上的捕获元件q2可以含有poly-c链，且扰动寡核苷酸可以含有poly-g链。在一些实施方案中，捕获珠上的捕获元件能够捕获扰动寡核苷酸上的互补功能部分，而该扰动寡核苷酸在其相反的一端具有其他捕获元件。

103、在一些实施方案中，

b的范围为1 x 105至6.02 x 1017。

104、在一些实施方案中，扰动寡核苷酸仅编码扰动元件，而标记寡核苷酸仅编码独特定义扰动珠的标记或标记集合。这两个标记中的每一个在珠上彼此附接，或分别附接于扰动珠。在一些实施方案中，扰动寡核苷酸的一端可以具有捕获元件，该捕获元件设计用于捕获具有互补捕获元件的标记核苷酸；另一端可以具有与扰动组分互补的捕获元件。 在这种情况下，扰动珠可以用式ix和/或式x表示：

105、                             (ix)

106、和/或

107、                            (x)

108、其中l、l1、pe、q、q1、x、

m、n和

p的定义如上。lo是标记寡核苷酸，x2是q1或x的互补功能部分，l3是可释放的接头，且

k表示多个相同l3-lo-x2组，范围为1 x 105至6.02 x 1017。

109、在一希望实施方案中，l3与l和l1均正交，使得lo-x2可以释放，同时pe和l-x-q-q1仍保留在珠上。在本实施方案中，lo-x2的x2基团将附接到和q1上，从而通过形成(l-x-q-q1-lo-x2)寡核苷酸，实现标记寡核苷酸与扰动寡核苷酸q的原位附接。

110、在一些实施方案中，l和l3用相同的刺激释放（和任选地l1），从而使得x2附接于x或q1，形成x-q-q1-x2-lo或lo-x2-x-q-q1。当x、x2和q1是寡核苷酸，并且扰动组分也是寡核苷酸时，则任一组整体都是可测序的寡核苷酸。

111、在上述式的一些实施方案中，第一结合元件可以是扰动寡核苷酸上的poly-c基团，捕获珠上的结合元件可以是通过可切割基团与捕获珠连接的poly-g基团。扰动寡核苷酸上的第二结合元件可以是poly-t基团。因此，当扰动寡核苷酸被释放时，其上的poly-c基团将与捕获珠上的poly-g基团杂交，从而在扰动寡核苷酸的远端留下正交的poly-t结合元件。该poly-t基团随后将与细胞裂解释放的核酸上发现的poly-a功能部分杂交，从而得到寡核苷酸，该寡核苷酸经测序后将提供有关扰动元件结构、扰动珠上的独特标记以及细胞裂解释放的核酸的标识的相关信息。。在一些实施方案中，捕获珠上的poly-t结合基团可以被与细胞内的目的核酸互补的序列所替代，例如，与t细胞受体序列（tcr）或b细胞受体序列（bcr）中的特定区域互补的序列。

112、在一些实施方案中，可以通过对包含以下式xi和xii的所得核酸进行测序来确定扰动珠上的独特标记或标签集合的标识：

113、pc1-x1-q-q1-pc2                                           (xi)

114、pc1-x2-lo-x-q-q1-pc2                                    (xii)

115、其中，lo、x、q、q1的定义如上所述， 且x1和x2是独立结合元件。pc1和pc2代表从细胞释放的不同类型的扰动组分，例如mrna或蛋白质。在一些实施方案中，pc1和pc2可以代表相似/相同的扰动组分。

116、在一些实施方案中，式xi是以下过程的产物：式i中的可切割基团l和l1在适当时机释放，随后进行杂交，接着裂解细胞以释放扰动组分pc1和/或pc2（例如mrna），这些组分被q1捕获。在一些实施方案中，式xii是以下过程的产物：式ix或x中的可切割基团l、l1和l3在适当时机释放，随后进行杂交，接着裂解细胞以释放扰动组分pc1和/或pc2（例如mrna），这些组分再次通过杂交被q1和/或x1/x2捕获。在式xi中，就结合pc1和/或pc2而言，q1和x1是可互换的。在式xii中，q1和x2也是类似可互换的。

117、这样，技术人员就可以评估与所述标记对应的特定扰动珠，然后利用上述注册表，确定该珠所位于的精确检测区域。结合该检测区域中测定的可视化（视频或图片），可以将扰动前和/或后在可视化中观察到的细胞动态功能、特征和效应与通过测序确定的静态功能（例如，表达的mrna和被捕获元件捕获的）关联起来。

118、此外，由于各测序的寡核苷酸都能自身标识特定的扰动珠和特定的检测区域，技术人员只需将测定中使用的所有捕获珠合并即可。合并后，切割捕获珠与附接其上的捕获元件之间的可释放键，即可释放捕获元件，其中许多元件将含有上述寡核苷酸（部分捕获元件则不含此类寡核苷酸）。由于与捕获珠杂交后，再由扰动核酸的杂交形成的寡核苷酸是可自身标识的，因此合并所有捕获珠的操作已成为常规步骤。

119、在一些实施方案中，提供了一种捕获珠，其能够从扰动珠群体中自身标识出独特的扰动珠，该捕获珠包含多个捕获元件，其中至少部分捕获元件结合有扰动寡核苷酸，该扰动寡核苷酸编码扰动元件和与特定扰动珠相联系的独特标记，且所述编码能够从独特标记的扰动珠群体中自身标识出所述独特扰动珠。

120、在一些实施方案中，提供了一种用于标识与测定装置的特定检测区域中受扰动裂解细胞释放的扰动组分相联系的所述检测区域的方法，所述测定装置包含多个所述检测区域，该方法包括：

121、a)在映射测定装置中的多个检测区域的每一个中进行测定，其中所述检测区域的每一个均包含测定溶液中的细胞；

122、b)在所述检测区域的每一个中包含：

123、i) 一种扰动珠，其包含可释放地结合其上的多个扰动元件、附接于该珠的光学可检测标记或光学可检测标记集合，所述标记独特标识该珠，其中所述珠包含多个相同的扰动寡核苷酸，该扰动寡核苷酸对于所述扰动珠而言是独特的，并通过可释放的接头连接其上，其中所述扰动寡核苷酸编码所述珠上的扰动元件的结构和与该珠相联系的独特标记，此外其中所述扰动寡核苷酸包含一个或多个捕获元件；以及

124、ii) 一种捕获珠，其包含多个可释放地结合到所述珠上的一种或多种捕获元件，其中至少一种捕获元件与扰动寡核苷酸上的至少一种捕获元件互补，前提是所述扰动寡核苷酸或捕获珠上包含至少两种捕获元件，或者可被修饰以包含第二捕获元件；

125、c)通过将所述捕获珠上的独特光学可检测标记与所述映射的测定装置联系起来，从而关联和记录每个检测区域中的独特光学可检测标记或标记集合，从而在每个检测区域的捕获珠之间提供1:1的关系；

126、d)通过从扰动珠中释放至少一部分扰动元件在所述细胞上诱发扰动，从而诱导所述细胞的功能变化，所述功能变化至少包括由所述细胞表达的一种或多种扰动组分所证明的变化；

127、e)从扰动珠上释放至少一部分扰动寡核苷酸，以便被捕获珠上的捕获元件捕获；

128、e)裂解所述细胞，将所述扰动组分释放到所述测定溶液中，并将所述成分中的至少一种捕获到所述扰动寡核苷酸的捕获元件或所述捕获珠上；

129、g)对包含捕获元件、扰动寡核苷酸和一种或多种扰动组分的寡核苷酸进行测序；

130、h)确定扰动元件的结构和标识独特扰动珠的独特标记或标记集合；

131、i)通过参考各独特标记的珠的记忆的位置，将所述标记与所述映射测定装置中的特定检测区域关联起来，从而确定从中回收扰动组分的特定检测区域。

132、在一些实施方案中，上述方法还包括：

133、j)在测定期间中获取每个检测区域的图像；

134、k)将图像与上文g)中定义的特定检测区域相关联；

135、l) 评估测定期间由于细胞受到扰动而引起的细胞形态的变化；和

136、m)将从上述h)的测序获得的信息与上述l)中的信息结合起来，提供上述l)的详细分析。

137、在一些实施方案中，单个独特标记与扰动珠相联系。

138、在一些实施方案中，使用标记集合，所述集合包含多个成员，这些成员组合起来独特地标识它们最初结合到的扰动珠。

139、在一些实施方案中，提供了一种如上所述的扰动珠群体，其中所述群体中的各扰动珠都通过附接其上的标记或标记集合以及与所述扰动珠关联的寡核苷酸进行独特关联。在一些实施方案中，标识该标记的寡核苷酸也标识所述珠上扰动元件的结构。在一些实施方案中，标识该独特标记的寡核苷酸附接于扰动寡核苷酸或整合到扰动寡核苷酸中。

140、在一些实施方案中，扰动元件选自化合物、抗体、免疫细胞、sirna、病毒、细菌、真菌，以及测定条件中一项或多项的变化（包括但不限于缓冲液、盐、ph值、温度、营养物质、氧气水平、氧化剂、物理应激等）。在一些实施方案中，扰动元件是从扰动珠释放的化合物。

141、在一些实施方案中，捕获珠在测定完成之前、期间或之后被定位在检测区域内。

142、在一些实施方案中，在从珠上移除寡核苷酸之前，先将上述捕获珠从检测区域分离。

143、在一些实施方案中，在测定之前将捕获珠添加到检测区域。在一些实施方案中，在测定期间将捕获珠添加到检测区域。

144、在一些实施方案中，为给定的测定装置提供了注册表，该注册表含有以下项的记录：各扰动珠的各独特标记集合、所述扰动珠在测定装置中所位于的特定检测区域以及独特的扰动寡核苷酸（包括那些具有标记信息附接其上或并入其中的寡核苷酸）。

145、在一些实施方案中，注册表包含一张或多张数字照片，用于记录与每个检测区域联系的代码以及扰动珠上的光学可检测标记。

146、在一些实施方案中，数字摄影采用百万像素，其中每个检测区域的记录包含与其他检测区域不同的像素集合。