用于从复杂基质中选择性提取寡核苷酸的组合物和方法与流程

本发明总体上涉及分子生物学领域。在某些实施方案中，本发明提供了与核酸的分离和检测有关的装置、试剂盒和方法。

背景技术：

1、一些现有的核酸样本制备方法涉及使用自动化或半自动化盒来处理和移动所使用的样本和试剂。通常，在生物样本裂解后，核酸与盒中的过滤材料结合，可选地洗涤，并洗脱以供检测。通常，盒中使用的缓冲液含有诸如peg、胍或其他离液剂的物质，这些物质携会携带进入最终检测反应中，即使当这些物质以低浓度存在时也影响最终检测反应的功效。期望避免此类物质共洗脱到洗脱液中，并且特别期望首先消除在盒中使用此类物质的需要。

2、另外，期望对用于分离核酸的过滤材料的性质（例如密度或结合能力）具有增强的控制。迄今为止，通常通过改变用于制备这种材料的液相或气相方法的化学条件来实现对材料表面性质的控制。然而，这些方法在制造规模上实施起来可能是繁琐且昂贵的，并且所允许的定制程度受到制造复杂性增加的限制。本文所述的本发明的某些实施方案满足了这些和其他需求。本文所述的本发明的其他实施方案提供了可用于从样本中分离核酸的装置和试剂盒。本发明的另一些实施方案提供了样本中核酸的检测。

技术实现思路

1、本文描述了用于从样本中分离和纯化核酸的组合物、方法和装置。该组合物、方法和装置利用可选地经修饰的固体载体、包含固体载体结合部分和dna结合部分的亲和试剂。另外，提供了用于修饰和控制用于核酸提取和分离的固体支持材料的性质的方法。该方法利用对测定和固体载体化学的改变，允许在测定开发期间具有更大的灵活性，并且在制造中提供大的成本节省，因为单个固体载体可用于许多不同的测定。

2、在一些方面，公开了从样本中分离核酸的方法，其包括：使固体载体与亲和试剂和样本接触，其中亲和试剂包含与固体载体相互作用的第一部分和与样本中的核酸相互作用的第二部分，以及将核酸浓缩到固体载体上。亲和试剂还可包含与溶剂相互作用并增加亲和试剂的溶解度的接头。固体载体可包含与亲和试剂的第一部分相互作用的官能性表面基团。在某些实施方案中，官能性表面基团可以与亲和试剂的第一部分共价地（例如，点击/spaac反应）或非共价地（例如，诸如离子键合或极性相互作用的带电荷的相互作用、疏水或范德华相互作用、生物素-链霉亲和素相互作用）相互作用或它们的组合。在一些实例中，官能性表面基团包括疏水性结合基团、带负电荷的结合基团（例如，磺酸基、硫酸基、磷酸基、膦酸基或羧基）、带正电荷的结合基团（例如，伯胺、仲胺、叔胺和季铵、杂环胺，诸如吡啶、嘧啶、吡啶鎓、哌嗪）、极性结合基团（例如，包含极化化学键的化学部分，例如c—o、c═o、c—n、c═n、c═n、n—h、o—h、c—f、c—cl、c—br、c—s、s—h、s—o、s═o、c—p、p—o、p═o、p—h，更具体地羧基、醇、硫醇、酰胺、卤化物、胺、酯、醚或硫酯）或它们的组合。在某些实例中，官能性表面基团包括选自烷基基团、环烷基基团、卤代烷基基团（例如，氟代烷基）、芳基基团或它们的组合的疏水性结合基团，用于与亲和试剂相互作用。在更具体的实例中，疏水性结合基团可包括直链烷基基团，可选地其中直链烷基基团选自c4-c20烷基基团、c4-c12烷基基团或c4-c10烷基基团。在一个实施方案中，官能性表面基团和亲和试剂的第一部分包含叠氮基基团（例如，叠氮基硅烷）和环炔（例如，环辛炔），并且其中叠氮基基团和环炔反应以形成含氮杂环。

3、官能性表面基团可以通过任何合适的方式与固体载体结合，诸如共价地（例如，点击/spaac反应）或非共价地（例如，诸如离子键合或极性相互作用的带电荷的相互作用、疏水或范德华相互作用、生物素-链霉亲和素相互作用）或它们的组合。在一些中，官能性表面基团可以经由三唑基团、三嗪基团、咪唑、吲哚、硅烷基团、杂氮硅三环基团、硅氧烷基团、环状硅氧烷基团、倍半硅氧烷基团、硅氮烷基团或它们的组合与固体载体结合。在一个实施方案中，官能性表面基团可以经由硅烷基团与固体载体结合。

4、固体载体可以衍生自用于在核酸提取和分离期间捕获细胞或核酸的任何合适的材料。在一些实施方案中，固体载体可以是多孔材料，诸如纤维状多孔材料。多孔材料可以衍生自二氧化硅、玻璃（例如，玻璃珠或玻璃过滤器）、纤维素（例如，纤维素过滤器）、乙烯基骨架聚合物、云母、聚碳酸酯（例如，聚碳酸酯过滤器）、沸石、二氧化钛、磁性材料（例如，磁珠）、聚醚砜（例如，聚醚砜过滤器）、聚四氟乙烯（例如，聚四氟乙烯过滤器）、聚乙烯吡咯烷酮（例如，聚乙烯吡咯烷酮过滤器），或组合。在实施方案中，固体载体是衍生自玻璃纤维过滤器的多孔材料。玻璃纤维过滤器可以用如本文所述的官能性表面基团修饰，可选地其中官能性表面基团包括疏水性硅烷化合物。

5、如本文所述，该方法包括使固体载体与亲和试剂和样本接触，其中亲和试剂包含与固体载体相互作用的第一部分和与样本中的核酸相互作用的第二部分。亲和试剂的第一部分可以通过任何合适的方式与固体载体相互作用，诸如共价地（例如，点击/spaac反应）或非共价地（例如，诸如离子键合或极性相互作用的带电荷的相互作用、疏水或范德华相互作用、生物素-链霉亲和素相互作用）或它们的组合。在一些实施方案中，亲和试剂的第一部分可经由疏水基团、带负电荷的结合基团、带正电荷的结合基团、极性基团或它们的组合与固体载体相互作用。例如，亲和试剂的第一部分可包含用于与固体载体相互作用的疏水基团，其中疏水基团选自烷基基团、环烷基基团、卤代烷基基团（例如，氟代烷基）、芳基基团或它们的组合。在一些实施方案中，亲和试剂的第一部分包含直链烷基基团，可选地其中直链烷基基团选自c4-c20烷基基团、c4-c12烷基基团或c4-c10烷基基团。在一些实施方案中，亲和试剂的第一部分包含支链烷基基团，可选地其中支链烷基基团选自c6-c20烷基基团、c8-c12烷基基团或c8-c10烷基基团。

6、亲和试剂的第二部分可以通过任何合适的方式与核酸相互作用，诸如共价地（例如，点击/spaac反应）或非共价地（例如，诸如离子键合或极性相互作用的带电荷的相互作用、疏水或范德华相互作用、生物素-链霉亲和素相互作用）或它们的组合。例如，亲和试剂的第二部分可包含胺、杂环（诸如三唑、咪唑或吲哚）、嵌入剂、dna沟结合剂、肽、氨基酸、蛋白质或它们的组合，用于与核酸相互作用。在一个实施方案中，亲和试剂的第二部分包含胺，可选地其中胺选自烷基胺、环烷基胺、支链胺、烷氧基胺、多胺部分、芳基胺或它们的组合，用于与核酸相互作用。在另一个实施方案中，亲和试剂的第二部分包含烷基胺、咪唑、双苯甲亚胺小沟结合剂、多环嵌入剂或它们的组合，用于与核酸相互作用。在一些实例中，亲和试剂的第二部分包含精胺、甲胺、乙胺、丙胺、乙二胺、二亚乙基三胺、1,3-二甲基二亚丙基二胺、3-(2-氨基乙基)氨基丙基、(2-氨基乙基)三甲基氯化铵、三(2-氨基乙基)胺或它们的组合，用于与核酸相互作用。

7、亲和试剂还可包含与溶剂相互作用并增加亲和试剂的溶解度的接头。在一些实施方案中，接头可包含亲水基团，该亲水基团选自聚乙二醇接头、基于酯的接头（诸如支链基于酯的接头）、基于酰胺的接头（诸如支链基于酰胺的接头，包括n,n-二己基-3-咪唑-2-氧代胺接头）、基于胺的接头（诸如3-二丁基氨基丙胺接头、n,n-二己基-3-氨基丙胺接头）、基于有机磷的接头（诸如基于有机膦的接头、基于有机氧化膦的接头、基于有机次膦酸酯的接头、基于有机磷酰胺的接头、基于有机磷酸酯的接头、基于有机膦酰胺的接头或基于有机膦酸酯的接头）、基于葡糖醛酸的接头、二硫键接头、组织蛋白酶b接头或它们的组合。

8、亲和试剂还可包含用于释放浓缩在固体载体上的核酸的可光解基团。

9、如本文方法中所述，使固体载体与样本和亲和试剂接触可以在有效允许a）核酸与亲和试剂之间以及b）固体载体与亲和试剂之间的相互作用的条件下进行。该条件可包括小于7的ph。该方法还可包括在使固体载体与样本接触之前或与之同时使样本与裂解缓冲液接触。裂解缓冲液可包含离液剂、盐、缓冲剂、表面活性剂、消泡剂和结合剂中的一者或多者。

10、该方法可还包含释放浓缩在固体载体上的核酸。

11、该方法包括释放浓缩在固体载体上的核酸，其可以在洗脱剂、热、超声处理、光化学裂解条件或它们的组合的存在下进行。在一些实施方案中，释放浓缩在固体载体上的核酸可以在洗脱剂的存在下进行，可选地其中洗脱剂具有大于约7、大于约8、大于约9的ph和/或高于样本的盐浓度。在一些实施方案中，释放浓缩在固体载体上的核酸可以在热的存在下进行，可选地其中将核酸、亲和试剂和固体载体加热至35°c或更高、45°c或更高、55°c或更高、65°c或更高、75°c或更高、85°c或更高、95°c或更高或高达100°c或更高的温度。在一些实施方案中，释放浓缩在固体载体上的核酸可以在超声处理的存在下进行。在一些实施方案中，释放浓缩在固体载体上的核酸可以在亲和试剂的光化学裂解条件的存在下进行，可选地其中光化学裂解条件包括将亲和试剂暴露于uv光。

12、本文所述的方法还可包括用洗涤溶液洗涤固体载体。洗涤溶液可具有小于7的ph。

13、还描述了用于检测生物样本中的核酸的方法。用于检测生物样本中的核酸的方法可包括（a）使用如本文所公开的方法从样本中分离核酸；（b）用洗脱剂从固体载体释放核酸；以及（c）检测核酸。

14、所公开的方法可以在盒中进行，可选地在自动化盒中进行。本文描述了样本盒和自动化盒。

15、用于从生物样本中分离和检测核酸的样本盒可包括：盒体，该盒体中具有多个腔室，其中多个腔室包括被构造成接收生物样本的样本腔室；反应容器，该反应容器与多个腔室流体联接并且被构造用于扩增核酸和检测多种扩增产物；过滤器，该过滤器设置在多个腔室与反应容器之间的流体路径中，其中该过滤器包括具有能够结合亲和试剂的表面的固体载体，该亲和试剂设置在多个腔室中的一个腔室中，该亲和试剂包含与固体载体相互作用的第一部分和与来自生物样本的核酸相互作用的第二部分；和引物和/或探针，该引物和/或探针设置在多个腔室中的一个或多个腔室或反应容器中，用于检测核酸。引物和/或探针可以固定在多个腔室中的一个或多个腔室或反应容器中的表面（例如，生物传感器表面）上，用于检测核酸。亲和试剂还可包含与溶剂相互作用并增加亲和试剂的溶解度的接头。

16、样本盒中的多个腔室可包括与样本腔室流体连通的裂解腔室，其中裂解腔室包括用于释放核酸的裂解试剂。在一些实例中，样本腔室和裂解腔室是相同的。多个腔室还包含结合试剂、过滤缓冲液、洗涤试剂、洗脱缓冲液或它们的组合。

17、如样本盒中所述，过滤器包括具有能够结合亲和试剂的表面的固体载体。固体载体如本文所述，并且包含与亲和试剂的第一部分相互作用的官能性表面基团，可选地，其中官能性表面基团与亲和试剂的第一部分共价地（例如，点击/spaac反应）或非共价地（例如，诸如离子键合或极性相互作用的带电荷的相互作用、疏水或范德华相互作用、生物素-链霉亲和素相互作用）相互作用或它们的组合。固体载体可以是多孔材料，诸如玻璃纤维过滤器。

18、基于固体载体，亲和试剂可以以10 nmol/cm2或更大、20 nmol/cm2或更大、35nmol/cm2或更大或30-100 nmol/cm2的表面密度存在于盒内的固体载体上。在一些实施方案中，基于固体载体，亲和试剂可以以3,000 nmol/cm2或更小、2,500 nmol/cm2或更小、2,000nmol/cm2或更小、1,000 nmol/cm2或更小、500 nmol/cm2或更小、400 nmol/cm2或更小、300nmol/cm2或更小、200 nmol/cm2或更小，或100 nmol/cm2或更小的表面密度存在。固体载体与亲和试剂一起具有至少10 µg/cm2、20 µg/cm2或更大、35 µg/cm2或更大或30-100 µg/cm2的dna结合能力。

19、样本盒内的固体载体可具有0.2 µm至3 µm、0.2 µm至2 µm、0.5 µm至1.0 µm或0.6µm至0.8 µm的孔径。固体载体（例如，玻璃纤维过滤器）还可包含珠粒以促进机械裂解，其中珠粒选自玻璃珠、二氧化硅珠粒或它们的组合。固体载体（例如，玻璃纤维过滤器）可具有35g/m2至100 g/m2，优选地50 g/m2至85 g/m2或70 g/m2至85 g/m2的基重。固体载体（例如，玻璃纤维过滤器）可具有1 µm至100 µm，优选地1 µm至50 µm或1 µm至25 µm的纤维直径。固体载体（例如，玻璃纤维过滤器）可具有250 µm至2,000 µm、300 µm至1,500 µm、300 µm至1,000 µm、300 µm至750 µm或350 µm至500 µm的厚度。

20、样本盒与试剂一起允许流速高达每秒约100 µl，诸如约10 µl至约100 µl。在一些实施方案中，样本盒与试剂一起允许压力低于100 psi、低于80 psi或低于60 psi。如本文所述，样本盒可以是自动化盒。

21、提供了用于在本文所公开的样本盒中检测从受试者获得的生物样本中的核酸的方法。该方法可包括a）使来自生物样本的核酸与如本文所公开的样本盒中的一组引物和可选探针接触；b）使核酸、引物对和可选探针经受扩增条件；c）可选地经由实时pcr、解链曲线分析或它们的组合来检测扩增产物的存在，以及d）基于扩增产物的检测来检测生物样本中核酸的存在。在一些实施方案中，该方法不包括利用离液剂、裂解缓冲液或结合剂。

22、本公开的某些方面总体上涉及用于确定病毒（诸如冠状病毒）的组合物、装置和方法。例如，一些方面涉及使用本文所公开的用于分离和纯化核酸的装置对包含病毒和游离核酸的生物样本进行分配，以及在装置内确定病毒。在一些情况下，至少95%的游离核酸分配在装置的固体载体上。

23、生物样本可以选自血液、血液培养物、血浆、血清、精液、脊髓液、组织、泪液、尿液、粪便、唾液、涂片制剂、呼吸道样本、鼻咽拭子样本、前鼻样本、中鼻甲鼻样本、口咽样本、阴道拭子、阴道粘液样本、阴道组织样本、阴道细胞样本、细菌培养物、哺乳动物细胞培养物、病毒培养物、人细胞、细菌、细胞外液、胰液、细胞裂解物、pcr反应混合物或体外核酸修饰反应混合物，优选地其中所述生物样本是血液、血浆、呼吸道样本或阴道拭子。在一些实例中，生物样本包含选自以下的核酸：基因组dna、总rna、短dna、小dna、肿瘤来源的核酸、甲基化dna、微生物核酸、细菌核酸、病毒核酸、无细胞核酸或它们的组合。

24、本文所公开的方法和样本盒中的核酸的扩增可以经由巢式pcr、梯度pcr、等温pcr、qpcr或rt-pcr进行。在一个实施方案中，扩增通过实时pcr多重测定进行。