用于检测污染物酶的组合物和方法与流程

背景技术：

1、抗体疗法已成为一类重要的疗法，在治疗如癌症等疾病方面兼具疗效和安全性。截至2021年，已有超过125种抗体获批，并且2019年十大畅销药物中有五种是抗体，另外两种药物是融合蛋白。生物治疗蛋白制剂需要非离子去污剂来稳定其配制。最常见的非离子去污剂是聚山梨醇酯-20和聚山梨醇酯-80，通常称为tween-20和tween-80。尽管聚山梨醇酯可稳定配制，但也已知这些非离子去污剂会发生化学和酶促降解，从而对生物治疗蛋白的产品质量和/或保存期产生不利影响。聚山梨醇酯的酶促水解已被鉴定为生物治疗制剂中的显著问题。已鉴定出负责生物治疗制剂中聚山梨醇酯的酶促降解的主要酶为一系列脂肪酶和酯酶。这些酶通常在极低浓度下也具有高活性，这给生物制药行业带来了重大的分析挑战。因此，检测这些酶的存在对于确定生物治疗剂的稳定性和保存期至关重要。用于检测这些污染酶的当前可用方法可能成本高昂且耗时耗力，包括以下中的一种或多种：蛋白质组学分析、高效液相色谱法（hplc）、反相高效液相色谱法（rp-hplc）、酶联免疫吸附测定（elisa）、质谱法（ms）、二喹啉甲酸测定（bca），以及使用基于荧光胶束的方法或硫氰酸盐络合的测定。

技术实现思路

1、提供了在其3'端处与阻断部分缀合的寡核苷酸引物。阻断部分包含酶的切割位点，其中切割位点处的切割使阻断部分释放并在寡核苷酸引物上产生3'羟基。在一些实施例中，阻断部分包含结构i：

2、（i）

3、其中r包含磷脂或烃链。在一些实施例中，酶的切割位点包含脂肪酶切割位点、磷脂酶切割位点或酯酶切割位点。在一些实施例中，寡核苷酸引物通过酯键与阻断部分缀合。在一些实施例中，阻断部分包含聚乙二醇。在某些实施例中，阻断部分包含胆固醇-三乙二醇（teg）。在一些实施例中，寡核苷酸引物进一步包含寡核苷酸尾部。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含10-100个核苷酸或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含30-50个核苷酸或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含dna或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含rna或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含非标准碱基。在一些实施例中，寡核苷酸尾部在其5'端处包含第一捕获部分。在一些实施例中，第一捕获部分包含第一亲和标签。在某些实施例中，第一亲和标签包含生物素、脱硫生物素或链霉亲和素。在一些实施例中，阻断部分在其3'端处包含第二捕获部分。在一些实施例中，第二捕获部分包含第二亲和标签。在某些实施例中，第二亲和标签包含生物素、脱硫生物素或链霉亲和素。

4、还提供了一种反应混合物，其包含靶核酸和寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物在其3'端处与阻断部分缀合。在一些实施例中，寡核苷酸尾部包含不与靶核酸互补的核酸序列，并且寡核苷酸引物包含与靶核酸互补的核酸序列。在一些实施例中，反应混合物包含所公开的寡核苷酸引物中的两种或更多种，其中所述两种或更多种寡核苷酸引物中的至少一种包含第一污染物酶的切割位点，并且其中所述两种或更多种寡核苷酸引物中的至少一种包含第二污染物酶的切割位点。

5、还提供了用于检测样品中的污染物酶的方法。所述方法包含：

6、提供具有或怀疑具有所述污染物酶的样品；

7、通过将所述样品与靶核酸和寡核苷酸混合来产生反应混合物，所述寡核苷酸引物在其3'端处与阻断部分缀合，其中所述寡核苷酸引物在其5'端处包含不与所述靶核酸互补的第一核酸序列，并且在其3'端处包含与所述靶核酸的一部分互补的第二核酸序列，其中所述阻断部分包含所述污染物酶的切割位点，其中所述切割位点处的切割使所述阻断部分释放并产生具有3'羟基的寡核苷酸引物，并且其中所述阻断部分包含结构i：

8、（i）其中r为磷脂或烃链；

9、使用所述靶核酸作为模板，用聚合酶延伸所述寡核苷酸引物，以形成包含所述寡核苷酸引物以及所述靶核酸的反向互补序列的第一链产物，并延伸与所述靶核酸的所述反向互补序列退火的反向引物，以产生第二链产物；

10、使用正向引物和所述反向引物扩增所述第一链产物和所述第二链产物，其中所述正向引物包含所述寡核苷酸的所述第一核酸序列；以及

11、检测所述第一链产物或所述第二链产物的存在；

12、其中所述第一链产物或所述第二链产物的存在表明所述样品中存在所述污染物酶。

13、在一些实施例中，反应混合物包含寡核苷酸引物中的两种或更多种，其中所述两种或更多种寡核苷酸引物中的至少一种包含第一污染物酶的切割位点，并且其中所述两种或更多种寡核苷酸引物中的至少一种包含第二污染物酶的切割位点。在一些实施例中，污染物酶是脂肪酶、磷脂酶或酯酶。在一些实施例中，正向引物包含至少一个增加正向引物的tm的合成核苷酸。在一些实施例中，扩增反应中的正向引物的浓度高于寡核苷酸引物的浓度。在其它实施例中，正向引物包含至少一个增加正向引物的tm的合成核苷酸，并且扩增反应中的正向引物的浓度高于寡核苷酸引物的浓度。在一些实施例中，用探针检测第一链产物或第二链产物。在一些实施例中，用嵌入染料检测第一链产物或第二链产物。在一些实施例中，所述方法检测污染物酶的单个分子。在一些实施例中，扩增步骤包含pcr反应。在其它实施例中，扩增步骤包含等温扩增。在一些实施例中，扩增步骤在液滴中进行。在一些实施例中，酶的切割位点包含脂肪酶切割位点、磷脂酶切割位点或酯酶切割位点。在一些实施例中，寡核苷酸引物通过酯键与阻断部分缀合。在一些实施例中，阻断部分包含聚乙二醇。在某些实施例中，阻断部分包含胆固醇-三乙二醇（teg）。在一些实施例中，寡核苷酸引物进一步包含寡核苷酸尾部。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含10-100个核苷酸或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含30-50个核苷酸或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含dna或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含rna或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含非标准碱基。在一些实施例中，寡核苷酸尾部在其5'端处包含第一捕获部分。在一些实施例中，第一捕获部分包含第一亲和标签。在某些实施例中，第一亲和标签包含生物素、脱硫生物素或链霉亲和素。在一些实施例中，阻断部分在其3'端处包含第二捕获部分。在一些实施例中，第二捕获部分包含第二亲和标签。在某些实施例中，第二亲和标签包含生物素、脱硫生物素或链霉亲和素。

14、还提供了用于产生在其3'端处与阻断部分缀合的寡核苷酸引物的方法。所述方法包含：

15、提供寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物包含不与靶核酸互补的第一核酸序列以及与所述靶核酸的一部分互补的第二核酸序列；

16、将所述寡核苷酸引物与包含酶的切割位点的阻断部分缀合，其中所述切割位点处的切割使所述阻断部分释放并产生具有3'羟基的寡核苷酸引物，并且其中所述寡核苷酸引物的所述阻断部分包含结构i：

17、（i）

18、其中r为磷脂或烃链。

19、在一些实施例中，酶的切割位点包含脂肪酶切割位点、磷脂酶切割位点或酯酶切割位点。在一些实施例中，寡核苷酸引物通过酯键与阻断部分缀合。在一些实施例中，阻断部分包含聚乙二醇。在某些实施例中，阻断部分包含胆固醇-三乙二醇（teg）。在一些实施例中，寡核苷酸引物进一步包含寡核苷酸尾部。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含10-100个核苷酸或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含dna或由其组成。在其它实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含rna或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含非标准碱基。在所述方法的一些实施例中，缀合的寡核苷酸引物是从未缀合的寡核苷酸和未缀合的阻断部分中纯化的。在一些实施例中，寡核苷酸尾部在其5'端处包含第一捕获部分。在一些实施例中，第一捕获部分包含第一亲和标签。在某些实施例中，第一亲和标签包含生物素、脱硫生物素或链霉亲和素。在一些实施例中，阻断部分在其3'端处包含第二捕获部分。在一些实施例中，第二捕获部分包含第二亲和标签。在某些实施例中，第二亲和标签包含生物素、脱硫生物素或链霉亲和素。在一些实施例中，所述方法进一步包含通过以下各项来纯化缀合的寡核苷酸引物：在缀合步骤之后，添加与和第二捕获部分结合的第二结合部分缀合的珠粒，使第二结合部分和第二捕获部分结合，分离珠粒，以及释放与珠粒结合的具有或不具有捕获部分的寡核苷酸引物。在一些实施例中，所述方法进一步包含通过以下各项来纯化缀合的寡核苷酸引物：在缀合步骤之后，添加与和第一捕获部分结合的第一结合部分缀合的珠粒，使第一结合部分和第一捕获部分结合，去除未与珠粒结合的阻断部分，从反应混合物中去除珠粒，以及释放与珠粒结合的具有或不具有捕获部分的寡核苷酸引物。

20、还提供了一种在其5'端处与可切割部分缀合的寡核苷酸引物，其中可切割部分进一步与寡核苷酸尾部缀合。可切割部分包含酶的切割位点，其中切割位点处的切割使寡核苷酸引物从可切割部分释放。在一些实施例中，可切割部分包含脂肪酶切割位点、磷脂酶切割位点或酯酶切割位点。在一些实施例中，寡核苷酸尾部、寡核苷酸引物或两者通过酯键与可切割部分缀合。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含10-100个核苷酸或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含30-50个核苷酸或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含dna或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含rna或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含非标准碱基。在一些实施例中，寡核苷酸尾部在其5'端处包含第一捕获部分。在一些实施例中，第一捕获部分包含第一亲和标签。在某些实施例中，第一亲和标签包含生物素、脱硫生物素或链霉亲和素。在一些实施例中，寡核苷酸尾部通过将第一亲和标签与和珠粒缀合的结合部分结合而连接到珠粒。在一些实施例中，寡核苷酸引物在其3'端处包含第二捕获部分。在一些实施例中，第二捕获部分包含第二亲和标签。在某些实施例中，第二亲和标签包含生物素、脱硫生物素或链霉亲和素。

21、还提供了一种反应混合物，其包含靶核酸和寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物在其5'端处与可切割部分缀合，其中所述可切割部分进一步与寡核苷酸尾部缀合，并且其中所述寡核苷酸尾部连接到珠粒。在一些实施例中，寡核苷酸引物包含与靶核酸互补的核酸序列，并且寡核苷酸尾部包含不与靶核酸互补的核酸序列。

22、还提供了用于检测一个或多个样品中的污染物酶的方法。所述方法包含：

23、提供具有或怀疑具有所述污染物酶的一个或多个样品；

24、通过将所述样品与靶核酸和寡核苷酸引物混合来产生每个样品的第一反应混合物，所述寡核苷酸引物在其5'端处与可切割部分缀合，其中所述可切割部分进一步与寡核苷酸尾部缀合，其中所述寡核苷酸尾部连接到珠粒，其中所述寡核苷酸尾部包含不与所述靶核酸互补的核酸序列，其中所述寡核苷酸引物包含与所述靶核酸的一部分互补的核酸序列，其中所述可切割部分包含所述污染物酶的切割位点，其中所述切割位点处的切割使所述寡核苷酸引物释放；

25、使用所述靶核酸作为模板，用聚合酶延伸所述寡核苷酸引物，以形成包含所述寡核苷酸引物以及所述靶核酸的反向互补序列的第一链产物，从而产生连接到所述珠粒的双链靶核酸；

26、洗涤所述珠粒并丢弃上清液；

27、任选地通过将所述靶核酸添加到每种第一反应混合物中来产生第二反应混合物，并且如果所述寡核苷酸引物未在所述第一反应混合物中延伸，则使用所述靶核酸作为模板，用聚合酶延伸所述寡核苷酸引物，以形成包含所述寡核苷酸引物以及所述靶核酸的反向互补序列的第一链产物，从而产生连接到所述珠粒的双链靶核酸；洗涤所述珠粒并丢弃上清液；

28、针对一个或多个样品合并来自所述第一反应混合物或所述第二反应混合物的经洗涤的珠粒；

29、在所述切割位点处对切割部分进行切割，从而使所述双链靶核酸从所述珠粒释放；

30、使用正向引物和反向引物扩增所述双链靶核酸，从而产生扩增产物；以及

31、检测所述扩增产物的存在或浓度；其中所述扩增产物的存在或浓度低于对照样品表明所述样品中的一个或多个样品中存在所述污染物酶。

32、在一些实施例中，污染物酶是脂肪酶、磷脂酶或酯酶。在一些实施例中，用探针检测扩增产物。在一些实施例中，用嵌入染料检测扩增产物。在一些实施例中，所述方法检测污染物酶的单个分子。在一些实施例中，扩增包含pcr反应。在其它实施例中，扩增包含等温扩增。在一些实施例中，扩增在液滴中进行。在一些实施例中，酶的切割位点包含脂肪酶切割位点、磷脂酶切割位点或酯酶切割位点。在一些实施例中，寡核苷酸尾部、寡核苷酸引物或两者通过酯键与可切割部分缀合。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含10-100个核苷酸或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含30-50个核苷酸或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含dna或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含rna或由其组成。在一些实施例中，寡核苷酸引物、寡核苷酸尾部或两者包含非标准碱基。在一些实施例中，寡核苷酸尾部在其5'端处包含第一捕获部分。在一些实施例中，第一捕获部分包含第一亲和标签。在某些实施例中，第一亲和标签包含生物素、脱硫生物素或链霉亲和素。在一些实施例中，寡核苷酸尾部通过将第一亲和标签与和珠粒缀合的结合部分结合而连接到珠粒。在一些实施例中，寡核苷酸引物在其3'端处包含第二捕获部分。在一些实施例中，第二捕获部分包含第二亲和标签。在某些实施例中，第二亲和标签包含生物素、脱硫生物素或链霉亲和素。

33、还提供了用于产生在其5'端处与可切割部分缀合的寡核苷酸引物的方法，其中所述可切割部分进一步与寡核苷酸尾部缀合。所述方法包含：

34、提供寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物包含与靶核酸的一部分互补的核酸序列；

35、提供连接到珠粒的寡核苷酸尾部，其中所述寡核苷酸尾部包含不与靶核酸互补的核酸序列；

36、将寡核苷酸引物在其5'端处与包含酶的切割位点的可切割部分缀合；

37、将寡核苷酸尾部在其3'端处与可切割部分缀合，其中切割位点处的切割使寡核苷酸引物释放。

38、在一些实施例中，可切割部分包含脂肪酶切割位点、磷脂酶切割位点或酯酶切割位点。