多核苷酸变体和使用其生产L-缬氨酸的方法与流程

本公开要求2024年5月14日提交的韩国专利申请号10-2024-0063418和2024年10月15日提交的韩国专利申请号10-2024-0140452的优先权，并且相应韩国专利申请的文件中公开的全部内容通过引用的方式整体并入本文。在本公开中，引用了大量论文和专利文件，并指出其出处。所引用的论文和专利文件的公开内容通过引用的方式整体并入本公开，以更清楚地描述本发明所属的水平和本发明的内容。本公开涉及新型启动子和使用该启动子生产l-缬氨酸的方法，更具体地，涉及具有启动子活性的新型多核苷酸、包含该多核苷酸和与其可操作连接的目标基因的表达盒、包含该多核苷酸或该表达盒的载体、包含该多核苷酸或该表达盒的微生物以及使用该微生物生产l-缬氨酸的方法。

背景技术：

1、为了使用微生物以高滴度生产目标物质（例如氨基酸或可用于包括饲料、药物和食品在内的各种应用的其它有用物质），人们不断地进行诸如遗传操作和/或在生物合成途径中导入外源基因的努力。在这些方法中，一种方法包括在微生物中诱导目标基因的过表达，为此需要高效的基因表达系统。由于启动子是显著影响基因表达水平和调控的关键元件，因此开发有用的启动子对于建立这种表达系统至关重要。

2、已知棒状杆菌属(corynebacterium)的微生物能产生包括l-缬氨酸的氨基酸。然而，与其它工业微生物（如大肠杆菌(escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)）不同，棒状杆菌中用于基因表达的启动子序列的一般结构尚未被充分表征。因此，通过去除抗生素抗性基因的启动子区域（例如氯霉素的启动子区域），插入已经用合适的限制性内切酶消化的来自棒状杆菌的染色体dna片段，用所得的构建体转化棒状杆菌，然后测量所得转化体的抗生素抗性，已经开发了一些启动子。此外，已经研究了各种启动子以实现异源基因在芽孢杆菌属(bacillus)微生物中的过表达，并且这些启动子已经用于生产食品级、药物和其它工业酶。迄今为止，已经连续开发了许多利用启动子在各种芽孢杆菌属物种中表达编码α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的基因的载体系统(schumann，2007，adv.appl. microbiol., 153:813–821)。

3、随着对l-缬氨酸需求的增加，仍然需要在棒状杆菌属微生物中过表达与l-缬氨酸生产相关的基因，并且仍然需要开发强启动子。

4、[现有技术文献]

5、[专利文献]

6、（专利文献1）us 8465962 b2

技术实现思路

1、【技术问题】

2、本公开的一个方面提供了一种新型多核苷酸。

3、本公开的另一个方面提供了包含所述多核苷酸和目标基因的表达盒。

4、本公开的另一个方面提供了包含所述多核苷酸或所述多核苷酸和与其可操作地连接的目标基因的微生物。

5、本公开的另一个方面提供了生产l-缬氨酸的方法，其包括在培养基中培养所述微生物。

6、本公开的另一个方面提供了所述微生物用于生产l-缬氨酸的用途。

7、【技术方案】

8、其详细描述如下。同时，本公开中公开的每个描述和实施方案也可以应用于其他描述和实施方案。也就是说，本公开中公开的各种元件的所有组合都落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不应被认为受限于下文提供的具体描述。此外，本领域技术人员将会认识到，或者可以仅使用常规实验来确定，本公开中描述的本公开的具体方面的许多等同物。此外，这些等同物旨在包括在本公开中。

9、此外，在整个本公开中，引用了大量论文和专利文件，并指出其出处。所引用的论文和专利文件的公开内容通过引用的方式整体并入本公开，以更清楚地描述本公开所属技术领域的水平和本公开的内容。

10、本公开的一个方面提供了一种多核苷酸，其包含一种核苷酸序列，其中在seq idno: 138的核苷酸序列中，第130位的核苷酸被不同于原始核苷酸的核苷酸置换；

11、一种核苷酸序列，其中在seq id no: 139的核苷酸序列中，第71位的核苷酸被不同于原始核苷酸的核苷酸置换；或者

12、一种核苷酸序列，其中在seq id no: 140的核苷酸序列中，第150位的核苷酸被不同于原始核苷酸的核苷酸置换。

13、在本公开中，seq id no: 138、seq id no: 139或seq id no: 140的核苷酸序列可以在已知的数据库ncbi genbank中检索到，并且seq id no: 138、seq id no: 139或seqid no: 140的核苷酸序列可以各自来源于棒状杆菌属（corynebacterium sp.），并且具体地，可以是来源于谷氨酸棒状杆菌（corynebacterium glutamicum）的序列。seq id no:138、seq id no: 139或seq id no: 140的核苷酸序列可作为示例性序列，用于指定为制备本公开的多核苷酸而待导入的突变位点，并且显而易见的是，导入到本公开的多核苷酸中的突变也可以被导入到功能上对应于seq id no: 138、seq id no: 139或seq id no: 140的核苷酸序列的任何序列中。在一个实施方案中，功能上对应的序列可以是与seq id no:138、seq id no: 139或seq id no: 140的核苷酸序列具有至少70%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、或99%或更多、且小于100%同源性或同一性的核苷酸序列，或者其中部分序列被添加、缺失或修饰的具有所述同源性或同一性的核苷酸序列，但不限于此。

14、因此，在一个实施方案中，本公开的多核苷酸可以包含这样的核苷酸序列、基本上由或由这样的核苷酸序列组成，所述核苷酸序列中在seq id no: 138的核苷酸序列中第130位的核苷酸被不同于原始核苷酸的核苷酸置换，并且所述核苷酸序列与seq id no:138的核苷酸序列具有至少70%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、或99%、且小于100%的同源性或同一性，或者其中部分序列被添加、缺失或修饰的具有所述同源性或同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本公开的多核苷酸可以包含这样的核苷酸序列、基本上由或由这样的核苷酸序列组成，所述核苷酸序列中在seq id no: 139的核苷酸序列中第71位的核苷酸被不同于原始核苷酸的核苷酸置换，并且所述核苷酸序列与seq id no: 139的核苷酸序列具有至少70%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、或99%或更多、且小于100%的同源性或同一性，或者其中部分序列被添加、缺失或修饰的具有所述同源性或同一性的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本公开的多核苷酸可以包含这样的核苷酸序列、基本上由或由这样的核苷酸序列组成，所述核苷酸序列中在seq id no: 140的核苷酸序列中第150位的核苷酸被不同于原始核苷酸的核苷酸置换，并且所述核苷酸序列与seq id no: 140的核苷酸序列具有至少70%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、或99%或等多、且小于100%的同源性或同一性，或者其中部分序列被添加、缺失或修饰的具有所述同源性或同一性的核苷酸序列。

15、在本公开中，seq id no: 138的核苷酸序列可以是编码iclr家族转录调节蛋白的基因(cey17_07095基因)的启动子序列，或该启动子序列的一部分。

16、iclr家族转录调节蛋白是一种主要参与碳代谢调节的转录调节蛋白，其功能是调节与乙醛酸循环相关的基因的表达。

17、在一个实施方案中，seq id no: 138的核苷酸序列中第130位的核苷酸可以是胞嘧啶(c)，但不限于此。

18、在一个实施方案中，所述多核苷酸可以是其中seq id no: 138的核苷酸序列中第130位的核苷酸被腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)或胸腺嘧啶(t)置换（更具体地说是被胸腺嘧啶(t)置换）的多核苷酸，但不限于此。

19、在本公开中，seq id no: 139的核苷酸序列可以是编码三羧酸转运蛋白的基因(cey17_14380基因)的启动子序列，或该启动子序列的一部分。

20、三羧酸转运蛋白是一种负责转运三羧酸(如柠檬酸)的蛋白质，位于细胞膜中，在所述细胞膜中其功能是将三羧酸从细胞外输入细胞中用于代谢途径。

21、在一个实施方案中，在seq id no: 139的核苷酸序列中第71位的核苷酸可以是鸟嘌呤(g)，但不限于此。

22、在一个实施方案中，所述多核苷酸可以是其中seq id no: 139的核苷酸序列中第71位的核苷酸被腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)置换（更具体地说是被腺嘌呤(a)置换）的多核苷酸，但不限于此。

23、在本公开中，seq id no: 140的核苷酸序列可以是cey17_06565基因的启动子序列，或该启动子序列的一部分。

24、在一个实施方案中，在seq id no: 140的核苷酸序列中第150位的核苷酸可以是鸟嘌呤，但不限于此。

25、在一个实施方案中，所述多核苷酸可以是其中seq id no: 140的核苷酸序列中第150位的核苷酸被腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)置换（更具体地说是被腺嘌呤(a)置换）的多核苷酸，但不限于此。

26、在一个实施方案中，所述多核苷酸可以包含以下核苷酸序列、基本上由或由以下核苷酸序列组成：与seq id no: 138的核苷酸序列具有至少70%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多、99.1%或更多、99.2%或更多、99.3%或更多、或99.35%或更多，且小于100%的同源性或同一性的核苷酸序列。更具体地，所述多核苷酸可以是其中seq id no: 138的核苷酸序列的第130位的核苷酸被胸腺嘧啶(t)置换的多核苷酸，并且其包含以下核苷酸序列、基本上由或由以下核苷酸序列组成：与seq id no: 138的核苷酸序列具有至少70%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多、99.1%或更多、99.2%或更多、99.3%或更多、或99.35%或更多，且小于100%的同源性或同一性的核苷酸序列。

27、在一个实施方案中，所述多核苷酸可以包含以下核苷酸序列、基本上由或由以下核苷酸序列组成：与seq id no: 139的核苷酸序列具有至少70%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多、99.1%或更多、99.2%或更多、99.3%或更多、99.4%或更多、或99.5%或更多，且小于100%的同源性或同一性的核苷酸序列。更具体地，所述多核苷酸可以是其中seq id no: 139的核苷酸序列的第71位的核苷酸被腺嘌呤(a)置换的多核苷酸，并且其包含以下核苷酸序列、基本上由或由以下核苷酸序列组成：与seq id no: 139的核苷酸序列具有至少70%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多、99.1%或更多、99.2%或更多、99.3%或更多、99.4%或更多、或99.5%或更多，且小于100%的同源性或同一性的核苷酸序列。

28、在一个实施方案中，所述多核苷酸可以包含以下核苷酸序列、基本上由或由以下核苷酸序列组成：与seq id no: 140的核苷酸序列具有至少70%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多、99.1%或更多、99.2%或更多、99.3%或更多、99.4%或更多、或99.5%或更多，且小于100%的同源性或同一性的核苷酸序列。更具体地，所述多核苷酸可以是其中seq id no: 140的核苷酸序列的第150位的核苷酸被腺嘌呤(a)置换的多核苷酸，并且其包含以下核苷酸序列、基本上由或由以下核苷酸序列组成：与seq id no: 139的核苷酸序列具有至少70%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、95%或更多、96%或更多、97%或更多、98%或更多、99%或更多、99.1%或更多、99.2%或更多、99.3%或更多、99.4%或更多、或99.5%或更多，且小于100%的同源性或同一性的核苷酸序列。

29、在本公开中，所述多核苷酸可以包含seq id no: 18、seq id no: 20或seq idno: 25的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本公开的多核苷酸可以基本上由seq id no:18、seq id no: 20或seq id no: 25的核苷酸序列组成。在另一个实施方案中，本公开的多核苷酸可以由seq id no: 18、seq id no: 20或seq id no: 25的核苷酸序列组成。

30、在本公开中，术语“多核苷酸”可以指其中包括2个或更多、5个或更多、10个或更多、13个或更多、20个或更多、或30个或更多核苷酸单体，并且其中所述核苷酸单体可以共价连接形成链形式的多核苷酸。

31、本公开的多核苷酸可以具有启动子活性，并且可以用作通用启动子。

32、在一个实施方案中，所述多核苷酸可以具有在棒状杆菌属微生物中表达目标基因的启动子活性。

33、在本公开中，具有启动子活性的多核苷酸可以与“变体启动子”互换使用。

34、根据本公开一个实施方案的多核苷酸可以用作具有强诱导表达活性的合成启动子。

35、在本公开中，术语“启动子”可以指包含聚合酶结合位点并启动位于其下游的目标dna转录的dna区域。启动子可以位于转录起始位点的上游。启动子可以可操作地和/或可调节地(增强或减弱表达)连接在目标基因的上游。例如，启动子可以正向连接在目标基因的上游侧以增强(增加)基因的表达，或者可以反向连接在目标基因的下游侧以减弱(减少)基因的表达。当启动子以相反方向导入目标基因的下游时，例如，在终止密码子的下游，特别是在终止密码子和转录终止子的顶端之间，它可以通过诱导相应基因以与正常转录方向相反的方向转录来减弱基因的表达，从而导致rna聚合酶复合物在转录过程中与正常方向的rna聚合酶复合物碰撞。

36、聚合酶，也称为rna聚合酶或dna依赖性rna聚合酶，可以指从dna合成初级转录rna的酶。聚合酶可以是原核细胞的rna聚合酶或真核细胞的rna聚合酶(例如，rna聚合酶i、rna聚合酶ii、rna聚合酶iii、rna聚合酶iv或rna聚合酶v等)。根据一个实施方案的多核苷酸可以是天然的或非天然的，例如，可以是化学合成或重组合成的非天然多核苷酸。

37、在本公开中，术语“变异”指遗传或非遗传稳定的表型变化，并且在本公开中可以与“突变”互换使用。

38、与不包括变异的多核苷酸(野生型多核苷酸或突变前的多核苷酸)相比，本公开的多核苷酸(变体启动子)可能已经改变(增加或降低)了启动子活性。所述多核苷酸可以调节(增加或减少)与其可操作地连接的目标基因的表达，或由目标基因编码的蛋白质的表达或活性，此外，还可以调节除目标基因之外的其它基因的表达。

39、“目标基因”是指其表达受本公开多核苷酸调节的基因，在编码蛋白质的基因的情况下，可以与“编码目标蛋白质的基因”互换使用。由目标基因编码的蛋白质可被表述为“目标蛋白质”，编码“目标蛋白质”的基因可被表述为“目标基因”。

40、由于密码子的简并性或考虑到待表达目标基因的生物体中优选的密码子(密码子使用频率)，目标基因的氨基酸编码序列可以在不改变目标基因编码的蛋白质序列的范围内进行各种修饰。

41、当将本公开的多核苷酸与可操作地与其连接的目标基因一起导入合适的宿主细胞中时，该多核苷酸可以具有增加宿主细胞的目标物质的生产能力(生产量)(例如氨基酸的生产能力(生产量))的活性。

42、在一个实施方案中，所述多核苷酸可以用于增加氨基酸生产能力(生产量)，具体地，可以用于增加l-缬氨酸的生产能力(生产量)。

43、此外，多核苷酸的核苷酸序列可以通过常规已知的诱变方法进一步修饰，例如定向进化和定点诱变等，修饰到保持相应的生物活性(启动子活性)和/或所需活性(例如增加宿主细胞中目标物质产量的活性)的程度。

44、因此，本公开的多核苷酸可以由与seq id no: 18的核苷酸序列、seq id no: 20的核苷酸序列或seq id no: 25的核苷酸序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.7%或99.9%或更高同源性或同一性的核苷酸序列组成，或者其中部分序列被添加、缺失或修饰的具有所述同源性或同一性的核苷酸序列。

45、在本公开中，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定的氨基酸序列或核苷酸序列之间的相似程度，可以用百分比表示。术语同源性和同一性经常可以互换使用。

46、保守多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性由标准比对算法确定，并且可以一起使用由所用程序建立的默认空位罚分。基本上，同源或相同的序列通常可以在中度或高度严格的条件下与整个序列或其一部分杂交。显然，杂交也包括与含有通用密码子或考虑到多核苷酸中密码子简并性的密码子的多核苷酸的杂交。

47、任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性或同一性可以通过例如使用已知的计算机算法来确定，如“fasta”程序，使用如pearson等人, (1988) [proc. natl. acad.sci. usa 85]: 2444中的默认参数。或者，可以使用needleman-wunsch算法（needleman和wunsch, 1970, j. mol. biol. 48: 443-453）来确定，如在emboss软件包（emboss：欧洲分子生物学开放软件套件(the european molecular biology open software suite)，rice等人, 2000, trends genet. 16: 276-277）的needleman程序（5.0.0版本或更高版本）（包括gcg程序包（devereux, j.等人, nucleic acids research 12: 387 (1984)）、blastp、blastn、fasta（atschul, [s.] [f.,] [et al, j molec biol 215]: 403 (1990)； guideto huge computers, martin j. bishop, [编,] academic press, san diego,1994和[carillo eta/.](1988) siam j applied math 48: 1073））中所执行的。例如，同源性或同一性可以使用美国国家生物技术信息中心(ncbi)数据库的blast或clustalw来确定。

48、多核苷酸或多肽的同源性或同一性可以通过使用gap计算机程序比较序列信息来确定，例如needleman等人, (1970), j mol biol. 48:443，如在例如smith和waterman，adv. appl. math (1981) 2:482中所知。总之，gap程序可以定义为通过将相似排列的符号（即核苷酸或氨基酸）的数量除以两个序列中较短序列的符号总数而获得的值。gap程序的默认参数可以包括(1)二元比较矩阵（包含值1表示同一性，值0表示非同一性）和gribskov等人, (1986) nucl. acids res. 14: 6745的加权比较矩阵（或ednafull（ncbi nuc4.4的emboss版本）替换矩阵)，如由schwartz和dayhoff编, atlas of protein sequence andstructure, national biomedical research foundation, pp. 353-358 (1979)所公开的；(2)对于每个空位罚分3.0，并且对于每个空位中的每个符号，额外罚分0.10（或者空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5)；以及(3)末端空位不罚分。

49、在一个实施方案中，本公开中提供的包含特定核苷酸序列的多核苷酸可被解释为不仅包含特定核苷酸序列或与其基本等同的核苷酸序列，还包含含有与特定核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸片段。具体地，具有互补性的多核苷酸可以在下述条件下鉴定：这些条件在已知文献中有具体描述。例如，可以列举具有60%或更高、70%或更高、80%或更高、85%或更高、90%或更高、91%或更高、92%或更高、93%或更高、94%或更高、95%或更高、96%或更高、97%或更高、98%或更高、98%或更高、99.5%或更高或99.9%或更高的高互补性的基因彼此杂交，而具有较低互补性的基因不杂交的条件，或者在对应于常规southern杂交洗涤条件（即60℃，1x ssc（盐水-柠檬酸钠缓冲液）和0.1% (w/v) sds（十二烷基硫酸钠）；60℃，0.1x ssc和0.1% sds；或68℃，0.1x ssc和0.1% sds）的盐浓度和温度下洗涤一次，特别是两到三次的条件，但不限于此。杂交要求两个核苷酸具有互补序列，但根据杂交的严格性，可以允许一些碱基错配。术语“互补”可以用来描述可以彼此杂交的核苷酸之间的关系。例如，在dna的情况下，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。多核苷酸之间杂交的严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，这在相关领域是众所周知的（参见sambrook等，同上，9.50-9.51，11.7-11.8）。

50、此外，本公开的多核苷酸可以可操作地连接到编码目标蛋白的基因，即目标基因。

51、在本公开中，术语“可操作地连接（operably linked或operatively linked）”是指具有本公开启动子活性的多核苷酸与基因序列功能性地连接，从而启动并介导目标基因的转录。可操作地连接可以使用本领域已知的基因重组技术来制备，位点特异性dna切割和连接可以使用本领域的切割和连接酶等来产生，但不限于此。

52、当多核苷酸与目标基因可操作地连接时，为了使用切割和连接酶等，可以添加、缺失和/或修饰一些核苷酸。

53、在一个实施方案中，根据本发明，目标基因可以是编码参与l-缬氨酸生产的蛋白质的基因，但不限于此。参与l-缬氨酸生产的蛋白质可以是参与l-缬氨酸的细胞内生产途径(例如，生物合成、代谢、生物转化等)、细胞内转运和/或细胞外分泌途径的至少一个过程或步骤的蛋白质，并且可以选自由以下组成的组：例如，酶(各种合成酶、裂解酶、激酶、羧化酶(例如丙酮酸羧化酶等)、还原酶、氧化酶、脱羧酶、脱氢酶、脱水酶、转移酶、差向异构酶等)、中间体、转运蛋白、膜蛋白(通道等)，等等，但不限于此。

54、在一个实施方案中，所述目标基因可以是cey17_07095基因，但不限于此。cey17_07095基因可以是编码iclr家族转录调节蛋白的基因。

55、在一个实施方案中，所述目标基因可以是cey17_14380基因，但不限于此。cey17_14380基因可以是编码三羧酸转运蛋白的基因。

56、在一个实施方案中，所述目标基因可以是cey17_06565基因，但不限于此。

57、本公开的另一方面提供了包含本公开的多核苷酸和目标基因的表达盒。

58、所述多核苷酸和目标基因如上所述。

59、在本公开中，术语“表达盒”指包含启动子和与其可操作连接的目标基因的单元盒，并且能够表达位于启动子下游的目标基因。在这种基因表达盒的内部或外部，可以包括有助于目标基因有效表达的各种因子。除了可操作地连接到目标基因的启动子之外，基因表达盒通常可以包括转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号，但不限于此。

60、本公开的另一方面提供了包含所述多核苷酸的载体；所述多核苷酸和与其可操作连接的目标基因；或本公开的表达盒。

61、所述多核苷酸、目标基因和表达盒如上所述。所述载体可以包括与所述多核苷酸可操作地连接的目标基因。

62、在本公开中，术语“载体”指含有编码目标蛋白的多核苷酸的核苷酸序列的dna构建体，其可操作地连接到合适的调控序列，以便能够在合适的宿主中表达目标蛋白。调节序列可以包括能够启动转录的启动子、任何调节转录的操纵子序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列和/或调节转录和/或翻译终止的序列。在转化到合适的宿主细胞后，载体可以独立于宿主细胞的基因组表达，或者可以整合到宿主细胞的基因组中。

63、本公开中可用的载体没有特别限制，只要它可以在宿主细胞中复制，并且可以选自所有常用的载体。常用载体的实例包括天然或重组状态的质粒、粘粒、病毒、噬菌体等。例如，作为载体，pwe15、m13、mbl3、mbl4、ixii、ashii、apii、t10、t11、charon4a和charon21a等可用作噬菌体载体或粘粒载体，pdz系列、pbr系列、puc系列、pbluescriptii系列、pgem系列、ptz系列、pcl系列和pet系列等可用作质粒载体。具体地，实例可包括但不限于pdz、pdc、pacyc177、pacyc184、pcl、peccg117、puc19、pbr322、pmw118、pcc1bac、pdcm2、pdc24载体等。

64、可用于本公开的载体可以是用于整合到宿主细胞染色体中的表达载体或插入载体。使用插入载体将目标dna插入宿主细胞染色体可以通过本领域已知的任何方法进行，例如通过同源重组或crispr系统，但不限于此。载体可以进一步包括选择标记，用于确认载体是否已经转化，或者进一步确认目标dna是否已经插入到染色体中。选择标记可以从赋予可选择表型（如药物抗性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的抗性或表面蛋白的表达）的基因中选择和使用。在用选择剂处理的环境中，只有表达选择标记的细胞能够存活或表现出不同的表型，因此可以选择转化的细胞。

65、在本公开中，术语“转化”指将目标多核苷酸导入宿主细胞。转化的多核苷酸可以插入宿主细胞的染色体中，或者可以位于染色体外。此外，多核苷酸可以是dna和/或rna，并且无论其以何种形式导入，只要其能够被导入宿主细胞并在其中发挥功能。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式导入宿主细胞，所述表达盒是包含其自身表达所必需的所有元素的基因构建体，或者以包含其的载体的形式导入。

66、转化方法包括用于将目标多核苷酸导入细胞的任何方法，并且可以根据宿主细胞通过选择本领域已知的合适的标准技术来进行。例如，实例包括电穿孔、磷酸钙(capo4)沉淀、氯化钙(cacl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(peg)法、deae-葡聚糖法、阳离子脂质体法和乙酸锂-dmso法等，但不限于此。

67、本公开的另一方面提供了一种微生物(宿主细胞)，其包含所述多核苷酸、所述多核苷酸和与其可操作地连接的目标基因、或本公开的表达盒。

68、所述多核苷酸、目标基因或表达盒如上所述。

69、所述多核苷酸、多核苷酸和与其可操作地连接的目标基因或表达盒可通过转化导入微生物，但不限于此。

70、在本公开中，术语“微生物”包括野生型微生物和经过天然或人工遗传修饰的微生物，还包括由于诸如外源基因的插入或内源基因活性的增强或减弱等原因而使特定机制减弱或增强的微生物。

71、所述微生物可以是天然表达目标基因的微生物或具有目标产物生产能力的微生物，或者可以是其中将目标基因表达能力或目标产物生产能力赋予不天然表达目标基因的微生物或不具有目标产物生产能力的亲本菌株的微生物，但不限于此。在一个实施方案中，所述微生物可以是天然产生氨基酸的微生物，特别是产生l-缬氨酸的微生物。

72、在本公开中，术语“目标产物”是指通过使用本公开中提供的多核苷酸、多核苷酸和与其可操作地连接的目标基因、包含多核苷酸和目标基因的表达盒、包含多核苷酸和目标基因的载体和/或包含多核苷酸和目标基因的微生物来生产或调节其生产的生物活性物质，并且不仅包括最终生产的生物活性物质，还包括可由微生物生产的目标蛋白。例如，它可以指由目标基因编码的目标蛋白本身，和/或通过涉及目标蛋白而生产的任何生物活性物质。生物活性物质是指由生物体（例如细胞）产生或来源于生物体（例如细胞）或在体内或细胞内具有预定功能的任何物质，并且可以是例如氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、o-乙酰高丝氨酸等）、核酸、维生素（维生素a、b（b1、b2、b3、b5、b6、b7、b9、b12等）、c、d、e、k等）、蛋白质（目标蛋白或除了目标蛋白之外的蛋白质，例如激素、生长因子、细胞因子、免疫球蛋白（抗体）、抗原蛋白质、受体、配体、其功能性片段（保留所需功能的片段）、其中两个或更多个蛋白质融合的融合蛋白等）、糖（例如，单糖、二糖、多糖、糖醇等）、脂肪酸（肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、十六碳烯酸(sapienic acid)、油酸、反油酸、十八碳烯酸(vaccenic acid)、亚油酸、亚麻反油酸(linoelaidic acid)、花生四烯酸、二十碳五烯酸(epa)、芥酸、二十二碳六烯酸(dha)等）、有机酸（乳酸、柠檬酸、草酸、尿酸、丁酸、硬脂酸、丙酸等），等等，但不限于此。此外，如果某物质是通过目标蛋白的参与而产生的物质，那么除上述物质外，其代谢物（聚羟基链烷酸酯(pha)等）、其前体、保持其生物活性的其衍生物等，也可以包括在目标产物中。

73、在一个实施方案中，包含本公开的多核苷酸和与其可操作地连接的目标基因的微生物可以是具有增加的作为目标产物的氨基酸生产能力的微生物，并且具体地可以是具有增加的l-缬氨酸生产能力的微生物。具有增加的l-缬氨酸生产能力的微生物可以是与不包含本公开的多核苷酸的微生物相比具有增加的l-缬氨酸生产能力的微生物，例如，其中cey17_07095基因、cey17_14380基因或cey17_06565基因的表达在导入突变之前由多核苷酸调节的微生物，但不限于此。导入突变前的多核苷酸可以是野生型多核苷酸，具体来说可以由seq id no: 138、seq id no: 139或seq id no: 140的核苷酸序列组成。

74、在本公开中，“未修饰的微生物”不排除包括天然发生突变的菌株，并且可以指野生型菌株或天然存在的菌株本身，或者在由于天然或人工因素的遗传变异而改变其特性之前的菌株。例如，未修饰的微生物可以指其中变体多核苷酸没有被导入到本公开中描述的cey17_07095基因、cey17_14380基因或cey17_06565基因的启动子区域中的菌株，或者在这种导入之前的菌株。“未修饰的微生物”可以与“修饰前菌株”、“修饰前微生物”、“非突变菌株”、“未修饰菌株”、“非突变微生物”或“参考微生物”互换使用。

75、本公开的微生物可包括但不限于任何本公开的多核苷酸可被导入其中并作为启动子发挥功能的微生物。

76、在一个实施方案中，所述微生物可以是棒状杆菌属(corynebacterium sp.)的微生物，埃希氏菌属(escherichia sp.)的微生物，或芽孢杆菌属(bacillus sp.)的微生物，但不限于此。

77、具体地，所述微生物可以是棒状杆菌属的微生物，更具体地，可以包括谷氨酸棒状杆菌、停滞棒状杆菌（corynebacterium stationis）、热产氨棒状杆菌（corynebacteriumthermoaminogenes）、谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌（brevibacterium flavum）、乳发酵短杆菌（brevibacterium lactofermentum）以及由其制备的菌株，但不限于此。具体地，所述棒状杆菌属的微生物可以是谷氨酸棒状杆菌。

78、在一个实施方案中，所述微生物可以是谷氨酸棒状杆菌，其中突变已经被导入到cey17_07095基因、cey17_14380基因或cey17_06565基因的启动子中，但不限于此。

79、在一个实施方案中，具有增加的l-缬氨酸生产能力（生产量）的本公开的微生物的l-缬氨酸生产能力（生产量）与突变前的亲本菌株或未修饰的微生物相比可以增加约0.5%或更多、约1.0%或更多、约2.0%或更多、约3.0%或更多、约3.5%或更多、约3.75%或更多、约4.0%或更多、约4.25%或更多、约4.3%或更多、约4.5%或更多、约4.75%或更多、约4.8%或更多（上限没有特别限制，例如可以是约200%或更少、约100%或更少、约50%或更少、约25%或更少、或约10%或更少），但不限于此。在另一个实施方案中，具有增加的l-缬氨酸生产能力(生产量)的本公开的微生物的l-缬氨酸生产能力(生产量)与突变前的亲本菌株或未修饰的微生物相比可以增加约1.005倍或更多、约1.01倍或更多、约1.02倍或更多、约1.03倍或更多、约1.035倍或更多、约1.0375倍或更多、约1.04倍或更多、约1.0425倍或更多、约1.043倍或更多、约1.045倍或更多、约1.0475倍或更多、或约1.048倍或更多(上限没有特别限制，可以是例如约5倍或更少、约2倍或更少、约1.5倍或更少、约1.2倍或更少、或约1.1倍或更少)，但不限于此。

80、术语“约”是指包括所有±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1、±0.05、±0.04、±0.03、±0.02、±0.01等的范围，并且包括与术语“约”之后的数值等同或相似的范围内的所有数值，但不限于此。

81、本公开的另一方面提供了用于生产l-缬氨酸的组合物，其包含选自由以下组成的组中的至少一种：本公开的多核苷酸、多核苷酸和与其可操作地连接的目标基因、表达盒、载体和微生物。所述多核苷酸、目标基因、表达盒、载体、微生物等如上所述。

82、在一个实施方案中，用于生产l-缬氨酸的组合物可进一步包含常规用于生产l-缬氨酸的组合物中的任何合适的赋形剂，这种赋形剂可以是例如防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂等，但不限于此。

83、本公开的另一方面提供了选自由以下组成的组中的至少一种用于生产l-缬氨酸的用途：本公开的多核苷酸、多核苷酸和与其可操作地连接的目标基因、表达盒、载体和微生物。所述多核苷酸、目标基因、表达盒、载体、微生物等如上所述。

84、本公开的另一方面提供了选自由以下组成的组中的至少一种用于制备用于生产l-缬氨酸的组合物的用途：本公开的多核苷酸、多核苷酸和与其可操作地连接的目标基因、表达盒、载体和微生物。所述多核苷酸、目标基因、表达盒、载体、微生物等如上所述。

85、本公开的另一方面提供了一种生产目标产物的方法，该方法包括在培养基中培养微生物的步骤，所述微生物包含本公开的多核苷酸、多核苷酸和与其可操作地连接的目标基因、表达盒或载体。

86、所述多核苷酸、目标基因、表达盒、载体、微生物和目标产物等如上所述。

87、在一个实施方案中，所述目标产物可以是l-氨基酸。特别地，所述目标产物可以是l-缬氨酸。

88、该方法还可以包括在培养步骤之后，从培养的微生物、培养物或两者中回收目标产物的步骤。

89、本公开中的术语“培养”是指在适当控制和人工控制的环境条件下生长微生物。本公开的培养过程可以根据本领域已知的合适培养基和培养条件来进行。本领域技术人员可以根据选择的菌株容易地调整和使用这种培养过程。具体地，培养可以是分批、连续和/或补料分批培养，但不限于此。这些不同的方法公开于，例如，“biochemical engineering”(james m. lee, prentice-hall international editions, pp138-176, 1991)等。

90、在本公开中，术语“培养基”是指通过混合培养本公开的微生物所需的营养物作为主要成分而制备的物质，并提供生存和生长所必需的水以及营养物和生长因子。具体地，作为用于培养本公开的微生物的培养基和其他培养条件，可以使用用于培养常规微生物的任何培养基而没有特别限制，但是本公开的微生物可以在含有合适的碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的常规培养基中，在有氧条件下，同时控制温度、ph等的条件下培养。具体地，用于微生物的培养基可以在文献中找到，例如[美国细菌学学会的"manualof methods for general bacteriology"(washington d.c., usa, 1981)]。

91、用于培养的培养基必须以适当的方式满足特定菌株的要求。例如，培养可以在有氧条件下，同时控制温度、ph值等的条件下，在含有合适的碳源、氮源、氨基酸、维生素等的常规培养基中进行。此时，碳源包括碳水化合物如葡萄糖、果糖和蔗糖，以及氨基酸如谷氨酸和半胱氨酸。具体地，可以使用天然有机营养源，例如淀粉水解产物和糖蜜，并且优选碳水化合物，例如葡萄糖、果糖、灭菌的预处理糖蜜（即，转化为还原糖的糖蜜），并且可以不受限地以各种方式使用其他适量的碳源，但不限于此。作为氮源，无机氮源如氨；和氨基酸如谷氨酸和半胱氨酸，以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物等，可用作有机氮源。这些氮源可以单独使用或组合使用，但不限于此。在培养基中，磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可用作磷源，但不限于此。作为无机化合物，可以使用硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰和氯化钙等，此外，氨基酸、维生素和适当的前体等可以包括在内。这些培养基或前体可以分批或连续的方式添加到培养物中，但不限于此。

92、在培养过程中，可以通过以适当的方式向培养物中加入化合物如氢氧化钾、氨和磷酸来调节培养物的ph。此外，在培养过程中，可以使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制泡沫的产生。此外，为了维持培养物的有氧状态，可以向培养物中注入氧气或含氧气体。培养的温度为27℃至37℃，特别是30℃至33℃。培养时间可以持续到获得期望产量的有用物质，具体地是20至160小时。

93、在本公开中，术语“培养物”是指包含培养基的物质，其中微生物在适当控制和人工控制的环境条件下生长或已经完成生长。在狭义上，培养物不包括已长成的微生物，但在广义上包括可以已长成的微生物。“培养物”可以包括微生物在其生长期间释放到培养基中的各种目标物质，以及为微生物培养配制的培养基成分。

94、在本公开的培养中，培养温度可以保持在20℃至45℃，具体地25℃至40℃、25℃至40℃、25℃至37℃、25℃至35℃、27℃至40℃、27℃至37℃、27℃至35℃、30℃至40℃、30℃至37℃、或30℃至35℃，并且培养可以进行约10至160小时、20至100小时、30至90小时、或50至70小时，但不限于此。

95、通过本公开的培养产生的目标产物可以分泌到培养基中，或者可以保留在细胞内。

96、回收目标产物的步骤可以是根据培养方法，例如分批、连续或补料分批培养方法，使用本领域已知的合适方法收集目标产物。例如，可以离心、过滤、用结晶蛋白沉淀剂处理（盐析）、提取、超声波破碎、超滤、透析、各种类型的层析，如分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层析和亲和层析、hplc或这些方法的组合，但不限于此，并且可以使用本领域已知的合适方法从培养基或微生物中回收目标产物。

97、此外，用于生产本公开的目标产物的方法可以另外包括纯化步骤。可以使用本领域已知的合适方法进行纯化。在一个实施方案中，当用于生产本公开的目标产物的方法包括回收步骤和纯化步骤时，回收步骤和纯化步骤可以不考虑顺序而单独（或连续）进行，或者可以同时进行或整合到单个步骤中，但不限于此。

98、本公开的另一方面提供了用于增加目标产物的生产能力的方法，该方法包括在培养基中培养包含本公开的多核苷酸、多核苷酸和目标基因或包含多核苷酸和目标基因的表达盒的微生物的步骤。

99、所述多核苷酸、目标基因、表达盒、微生物和目标产物等如上所述。

100、本公开的另一方面提供了一种制备具有增加的目标产物生产能力的微生物的方法，该方法包括将本公开的多核苷酸、多核苷酸和目标基因或包含多核苷酸和目标基因的表达盒导入微生物的步骤。

101、所述多核苷酸、目标基因、表达盒、微生物和目标产物等如上所述。

102、根据本公开的另一方面，本公开提供了以本公开中公开的一种或多种元素为特征的组合物、方法、产品、工艺(process)或用途。

103、【有益效果】

104、本发明涉及具有启动子活性的新型多核苷酸和使用该多核苷酸生产l-缬氨酸的方法，并且由于在导入了本发明的新的多核苷酸的微生物中l-缬氨酸生产能力显著增加，因此该新型多核苷酸可以有效地用于有效生产l-缬氨酸。