一种靶向Aβ1-42寡聚体的阻断肽、阻断肽衍生物及其应用

本发明涉及生物医药，具体涉及一种靶向aβ1-42寡聚体的阻断肽、阻断肽衍生物及其应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默病（alzheimer's disease, ad）是一种原发性中枢神经系统退行性疾病，其发病率随年龄呈指数级上升。ad的核心临床症状为认知功能障碍和记忆损害，患者从早期的记忆力减退发展为语言障碍、执行功能障碍、视空间能力障碍，最终进展为全面痴呆，丧失生活自理能力。随着全球人口老龄化的加剧，该疾病在全球范围内造成的社会与经济负担逐年加重。ad发病过程中伴随着β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein, aβ）的异常聚集与累积。aβ是淀粉样前体蛋白水解产生的含有39-43个氨基酸的产物，其中aβ1-42因更容易自组装形成寡聚体和纤维，被认为是最具神经毒性的aβ亚型。aβ1-42寡聚体的形成与聚集是ad发病过程中的关键性事件。

2、研究表明，ad患者血清aβ1-42水平显著高于健康对照组，aβ1-42表达水平与认知损害程度呈正相关。aβ1-42通过多条信号通路引发炎症反应、代谢失衡、突触损伤及神经元死亡，基于此，aβ1-42已经成为ad治疗的重要靶点。目前已有的针对aβ1-42的干预工具包括大分子抗体、小分子抑制剂、多肽类药物、天然产物及其衍生物等。其中多肽类药物因其高特异性、低免疫原性及良好的生物安全性，在aβ1-42靶向干预中具有广阔的开发前景。目前获批用于靶向aβ的药物均为大分子抗体，多肽类靶向工具仍处于实验室研究或临床前开发阶段。因此，开发能够直接结合aβ1-42并中和其毒性构象的多肽类分子工具，可以为aβ1-42靶向干预及ad治疗药物的开发提供新的技术途径，具有明确的科学意义与产业转化价值。

技术实现思路

1、为弥补现有技术的不足，本发明目的在于提供一种靶向aβ1-42寡聚体的多肽，为aβ1-42活化相关疾病的治疗药物的开发提供新的思路。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方法：

3、本发明的第一个方面，提供一种靶向aβ1-42的多肽，所述多肽包含seq id no:1所示的氨基酸序列。

4、本发明中，术语“aβ1-42”是淀粉样前体蛋白在淀粉样蛋白生成途径中的切割产物之一，由42个氨基酸组成，其特点是c端多出ile41、ala42两个疏水残基。aβ1-42能够从无规则卷曲的单体结构经过构象改变形成富含β-折叠且具有高度神经毒性的可溶性寡聚体，再由寡聚体进一步向规则折叠结构转变，逐步形成原纤维及成熟纤维。aβ1-42可溶性寡聚体形态是ad核心致病因子，具有多重病理功能，包括通过感染突触可塑性与结构完整性引发突触毒性；在细胞膜上形成孔道导致离子稳态失衡；抑制线粒体呼吸链导致能量代谢危机；促进活性氧生成导致氧化应激等，因此aβ1-42的靶向清除对于ad的预防和治疗至关重要。

5、本发明中，多肽是指具有通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。以化合物的氨基酸数目和分子量区分，两个氨基酸连接即可形成最简单的肽；由10-50个氨基酸连接形成的化合物称为多肽；50个氨基酸以上组合形成的生物大分子通常称为蛋白质。

6、本发明的第二个方面，提供一种多肽衍生物，所述多肽衍生物包括前面所述多肽、与所述多肽连接的修饰部分，所述修饰包括使用可检测标记物缀合修饰、治疗剂缀合修饰、显像剂缀合修饰。

7、进一步，所述可检测标记物包括生物素、荧光色素、荧光蛋白、亲和素、顺磁原子、放射性同位素、酶。

8、本发明中，术语“生物素”是一种水溶性b族维生素，又称维生素b7或维生素h，可以通过化学键共价连接到多肽分子的特定基团（如氨基或羧基）上，其分子量远小于酶标记物，标记多肽后对多肽本身的空间结构和天然功能无明显影响。标记后的生物素多肽可与亲和素形成非共价结合，实现多肽的高效捕获、纯化或检测。

9、进一步，所述亲和素包括卵白亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、卵黄亲和素、类亲和素。

10、进一步，所述酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。

11、本发明的第三个方面，提供一种生物材料，所述生物材料包括：

12、1）核酸分子，所述核酸分子编码前面所述多肽；

13、2）重组载体，所述重组载体包含所述核酸分子；

14、3）宿主细胞，所述宿主细胞包含所述核酸分子或所述重组载体。

15、在本发明中，术语“核酸分子”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。所述核酸分子包括单链或双链分子。核酸分子可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合形成检测标记，用于核酸分子示踪。

16、进一步，所述标记组分包括放射性同位素、荧光素、化学发光标记物、酶。

17、进一步，所述重组载体包括质粒、病毒载体、噬菌体载体、人工染色体载体。

18、进一步，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。

19、进一步，所述重组载体还包括一种或多种调控元件，所述调控元件包括启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列、筛选标记基因。

20、进一步，所述启动子包括诱导型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、自杀型启动子中的一种或多种。

21、进一步，所述宿主细胞包括大肠杆菌、链霉菌、农杆菌、酵母细胞、植物细胞、动物细胞中的一种或多种。

22、本发明的第四个方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含前面所述多肽、多肽衍生物、生物材料中的一种或多种。

23、进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或递送系统。

24、进一步，所述药学上可接受的载体包括溶剂、稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、湿润剂、表面活性剂、乳化剂、润滑剂、缓冲剂、ph调节剂、吸附载体、吸收促进剂、稳定剂中的一种或多种。

25、进一步，所述递送系统包括脂质体、聚合物纳米颗粒、无机纳米粒子、固体脂质纳米粒、水凝胶纳米递送系统、仿生型纳米递送系统。

26、本发明的第五个方面，提供一种产品，所述产品包括前面所述多肽、生物材料、多肽衍生物、药物组合物中的一种或多种。

27、进一步，所述产品包括存储容器和/或施用装置。

28、进一步，所述存储容器包括存储瓶、存储袋、存储盒中的一种或多种。

29、进一步，所述施用装置包括口腔给药装置、鼻腔给药装置、注射给药装置、吸入给药装置、灌肠给药装置中的一种或多种。

30、进一步，所述产品包括试剂盒、生物芯片、试纸条。

31、本发明的第六个方面，提供如下任意一种方法：

32、1）一种制备前面所述多肽的方法，所述方法包括如下步骤：对前面所述宿主细胞进行培养得到培养产物，从培养产物中分离纯化得到前面所述多肽；

33、2）一种体外抑制aβ1-42活化的方法，所述方法包括将前面所述多肽与表达aβ1-42的细胞混合孵育；

34、3）一种检测aβ1-42的方法，所述方法包括如下步骤：①将待测样本与前面所述多肽接触，使所述多肽与待测样本中存在的aβ1-42特异性结合，形成复合物；②去除未结合的所述多肽；③检测复合物中aβ1-42与所述多肽结合产生的信号，并根据信号判断待测样本中aβ1-42的表达情况；

35、4）一种纯化aβ1-42的方法，所述方法包括如下步骤：①将前面所述多肽固定于固相载体，获得固定化所述多肽；②使含有aβ1-42的样品与固定化所述多肽接触，使样品中的aβ1-42与所述多肽特异性结合；③去除未结合的组分；④使与所述多肽结合的aβ1-42自固相载体上解离，收集获得纯化的aβ1-42。

36、进一步，所述体外抑制aβ1-42活化的方法中，所述表达aβ1-42的细胞包括原代神经元、sh-sy5y神经母细胞瘤细胞系、n2a神经母细胞瘤细胞系、原代小胶质细胞、bv2小胶质细胞系、嗜铬细胞瘤细胞系、293t细胞、人单核来源的小胶质样细胞、min6小鼠胰岛β细胞系。

37、进一步，所述检测aβ1-42的方法中，所述待测样品包括细胞样品、组织样品、血液样品、细胞裂解液、细胞分泌物、重组表达体系样品或其经预处理获得的组分；所述使待测样品与多肽接触的方式包括液相孵育、固相捕获、膜上孵育、微孔板孵育、微流控芯片接触、侧向层析接触或传感器表面接触。

38、进一步，所述检测aβ1-42的方法中，所述多肽可带有可检测标记，或者可通过能够识别多肽的检测试剂产生信号。所述可检测标记包括但不限于荧光标记、化学发光标记、显色标记、放射性标记、电化学标记、拉曼标记、磁性标记、酶标记或量子点标记。在一些实施方式中，所述信号包括荧光信号、化学发光信号、电化学信号、比色信号、吸光度信号、表面等离子体共振信号、石英晶体微天平信号、拉曼光谱信号、质量信号、放射性信号或可视化条带信号。

39、进一步，所述检测aβ1-42的方法中，所述检测方式包括酶联免疫吸附测定、荧光检测、化学发光检测、免疫印迹、免疫荧光、流式细胞术、免疫组织化学、侧向层析检测、微流控检测、电化学传感检测、表面等离子体共振检测、质谱检测中的一种或多种。

40、进一步，所述纯化aβ1-42的方法中，所述多肽具有可与固相载体连接的偶联位点或功能基团。所述偶联位点或功能基团可以位于多肽的n端、c端、侧链或经引入的连接臂上。所述功能基团包括氨基、羧基、巯基、羟基、醛基、生物素基团、叠氮基团、炔基。

41、在一些实施方式中，所述固相载体包括磁性微球、琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶、纤维素材料、聚苯乙烯微孔板、硅胶材料、玻璃材料、树脂、膜材料、微流控芯片、色谱填料、金属氧化物颗粒或纳米材料。在一些实施方式中，所述多肽通过生物素-链霉亲和素体系固定于固相载体。具体地，可将生物素化多肽与表面修饰有链霉亲和素或其他类型亲和素的固相载体接触，以获得固定化多肽。

42、本发明的第七个方面，提供如下任意一种应用：

43、1）前面所述多肽、多肽衍生物、生物材料在制备检测aβ1-42表达或抑制aβ1-42功能的产品中的应用；

44、2）前面所述多肽、多肽衍生物、生物材料在制备预防或治疗与aβ1-42活化相关的疾病的药物中的应用；

45、3）前面所述多肽、多肽衍生物、生物材料在制备诊断与aβ1-42活化相关的疾病的产品中的应用。

46、进一步，所述与aβ1-42活化相关的疾病包括阿尔茨海默病、血管性痴呆、轻度认知功能障碍。

47、本发明中，术语“血管性痴呆”是由脑血管病变引起的一种获得性认知功能障碍，是一组具有高度异质性的临床综合征，通常由缺血性脑组织缺氧和出血性脑损害等多种血管损伤机制所导致。aβ1-42可诱导血管内皮功能障碍，是脑卒中后并发血管性痴呆的独立影响因素。

48、本发明中，术语“轻度认知功能障碍”是指个体认知功能相较其年龄和既往水平出现轻度下降，但尚未达到痴呆诊断标准的一种中间状态。且该认知功能下降为病理性损伤，与正常衰老无关。轻度认知功能障碍患者会表现出aβ1-42水平升高，aβ1-42也是该疾病的诊断与进展预测重要的生物标志物。

49、本发明中，术语“预防”只指在疾病尚未发生或进展早期，针对疾病病因、危险因素及早期病理变化所采取的系统性干预行为，目的在于最大限度降低疾病发病率、延缓病程进展、减少并发症与患者死亡。

50、本发明中，术语“治疗”是指减轻、改善或根除疾病或与疾病相关的一种或多种症状。通过施用一种或多种治疗剂，减轻或改善所治疗的疾病或病症的一种或多种临床表现或副作用，改良一种或多种临床结果，降低疾病程度，延迟或减缓疾病进展，缓解或稳定疾病状态。

51、与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

52、本发明筛选出了一条靶向aβ1-42的226多肽，该多肽能有效识别并稳定结合aβ1-42。将226多肽与aβ1-42同时处理sh-sy5y或min6细胞，可抑制由aβ1-42导致的细胞活力降低及乳酸脱氢酶释放增强，并抑制aβ1-42诱导的细胞内ca²+浓度升高。226多肽能有效抑制aβ1-42寡聚体的功能，可应用于阿尔茨海默病、血管性痴呆、轻度认知功能障碍等疾病预防或治疗药物的开发。