单链末端保留衔接子的制作方法

本文提供了采用单链末端保留衔接子的组合物、试剂盒、系统和方法。通过以下方式将此类单链衔接子连接至dna双链体分子，同时保留原始的5'或3'单链突出端(例如，存在于无细胞dna中)：使用具有步骤3连接酶活性但不具有步骤2腺苷酰转移活性的单链连接酶将此类衔接子连接至dna双链体分子的3'末端，并使用连接酶(例如，环化酶(circligase))将此类衔接子连接至dna双链体分子的5'末端，从而在dna双链体分子的一个或每个末端上形成环样结构。在另外的实施方案中，当单链衔接子具有可切割部分时，环样结构被切割(例如，通过内切核酸酶)，从而在dna双链体分子的一个或两个末端生成两部分衔接子，该两部分衔接子保留初始的5'或3'单链突出端(或平端)。

背景技术：

1、ngs (下一代测序)文库制备工作流程通常由对片段化dna的末端修复和a尾添加步骤(er/at)组成。在末端修复(er)期间，3'-单链突出端被填补，并且3'-突出(即，5'-单链突出)端被切除，以形成平端dna双链体。这通常由t4 dna聚合酶催化，t4 dna聚合酶具有5'-3'聚合酶活性以及3'-5'外切核酸酶活性。在a尾添加(at)期间，taq dna聚合酶或klenow聚合酶将非模板a添加到dna双链体的3'末端，以促进随后与t悬垂测序衔接子的连接。由于t4 dna连接酶的生物化学底物要求——规定两个dna双链体片段之间的连接——因此在连接步骤之前必须进行er/at步骤。

2、可能存在与常规er/at过程及其基础化学相关的可预见的担忧。首先，在扩增之前对原始dna样品进行“写入”(3'-单链突出端填补)和“擦除”(3'-突出端切除)。er/at期间的“写入”活动会增加引入复制错误的可能性，这些复制错误随后可能被放大并被视为与起始样品相关的真实突变。例如，观察到聚合酶相关的“写入”活动可能由于其用于片段化的用途而产生许多测序伪影(1)。另一方面，“擦除”简单地减少样品输入，导致序列信息的部分丢失，并且可能对基因组改变发现的测定灵敏度具有负面影响。

3、其次，发现“写入”可能不仅限于末端。事实上，最近有报道称，在er/at步骤期间可能发生大量的dna链再合成，通常从dna双链体内深处的位点开始(2)。据报道，“来自无细胞dna和福尔马林固定的肿瘤活检样品的内部‘双链体碱基对’中，分别有7-17%和32-57%的内部“双链体碱基对”可以在体外再合成，并可能引入假突变”(2)。另外，对于旨在绘制碱基的表观遗传修饰的基因组测定，er/at期间的合成和再合成将引入混淆因素，因为新合成的片段缺乏生物学相关的表观遗传标记(3)。因此，er/at期间的再合成可能稀释生物学表观遗传信号并导致修饰水平被低估(3)。

4、第三，由于起始dna的单链悬垂在er/at之后被破坏，因此通常难以从测序数据中推断出原始末端，尤其是对于3'-末端。因此，3'-末端位置的不确定性可能使从“片段组学”研究中推断出的信号变得复杂(4)。作为另一个实例，通过使用双链体测序文库制备方法(5)，其中源自相同dna双链体的两条链可以在分析后配对，链配对只能揭示er/at后的平端构型。虽然对于体外生成的dna末端可能不是至关重要的，但发现，无细胞血浆dna的末端(被称为“锯齿状末端”)的单链悬垂可能含有在胎儿/母体以及正常/癌性来源之间不同的有意义的生物信号(3)。在他们的研究(3)中，jiang, p.等人使用经修饰的碱基5甲基-dctp代替er/at中的dctp，使得合成的片段可以基于其表观遗传模式与天然dna区分开，这然后允许对3'-单链突出端进行谱分析。

5、存在不使用常规er/at化学并且具有最小“写入”或“擦除”活动的益处的文库制备工作流程。例如，可以通过基于转座酶的方法同时用衔接子剪切和标记大的基因组dna(6)，但这通常不适合于已经片段化的dna，诸如血浆衍生的无细胞dna或ffpe组织提取的dna。报道了利用直接单链连接(7)或简并单链介导的夹板连接(8)的其他方法。然而，这些方法通常以热变性步骤开始，在此期间，dna双链体和相关的末端信息丢失。另外，基于复杂基因组文库中单链dna之间的互补性的杂交可能是具有挑战性的。harkins等人报道了一种文库制备方法，该方法使用具有多达6个核苷酸的预定义简并末端的y-衔接子池来对文库dna的天然末端进行谱分析(9)。然而，取决于衔接子池的设计，有限的可能性可能会给分析带来偏差。

技术实现思路

1、本文提供了采用单链末端保留衔接子的组合物、试剂盒、系统和方法。通过以下方式将此类单链衔接子连接至dna双链体分子，同时保留原始的5'或3'单链突出端(例如，存在于无细胞dna中)：使用具有步骤3连接酶活性但不具有步骤2腺苷酰转移活性的单链连接酶将此类衔接子连接至dna双链体分子的3'末端，并使用连接酶(例如，环化酶)将此类衔接子连接至dna双链体分子的5'末端，从而在dna双链体分子的一个或每个末端上形成环样结构。在另外的实施方案中，当单链衔接子具有可切割部分时，环样结构被切割(例如，通过内切核酸酶)，从而在dna双链体分子的一个或两个末端生成两部分衔接子，该两部分衔接子保留初始的5'或3'单链突出端(或平端)，因为该方法不需要任何末端修复或a尾添加。与文库制备中使用的常规末端修复/a尾添加不同，此类方法在衔接子连接步骤之前不改变dna模板，并且特别适用于高质量测序文库制备，包括基因组和表观基因组测序文库制备和片段组学分析。

2、在一些实施方案中，本文提供了将衔接子连接至dna双链体分子(例如，同时保留5'或3'单链突出端，以及存在的任何dna修饰，诸如甲基化)的方法，这些方法包括：a)生成样品，该样品包含：dna双链体分子、第一单链衔接子和单链连接酶，其中该单链连接酶具有步骤3连接酶活性但不具有步骤2腺苷酰转移活性，其中该dna双链体分子包含：i)第一双链体末端，该第一双链体末端包含3'链末端和5'链末端，并且具有3'或5'单链突出端，该3'或5'单链突出端为单个非腺嘌呤核苷酸(例如，g、c或t)或长度为至少两个核苷酸(例如，长度为2-15个核苷酸)；以及ii)第二双链体末端，该第二双链体末端包含3'链末端和5'链末端，该第二双链体末端任选地具有3'或5'单链突出端(例如，为单个非腺嘌呤核苷酸(例如，g、c或t)或长度为至少两个核苷酸(例如，长度为2-15个核苷酸))，其中该第一单链衔接子包含第一核酸序列和与该第一核酸序列的3'末端连接的3'末端封闭基团，其中该第一核酸序列的5'末端是腺苷酸化的，并且其中该第一核酸序列包含：5'区、3'区和任选的在该5'区与3'区之间的可切割区；b)在一定温度下温育该样品，使得该单链连接酶将该第一单链衔接子的5'末端连接至该第一双链体末端的3'链末端；c)任选地使该样品与去封闭剂接触，该去封闭剂去除或修饰该3'末端封闭基团，使得该第一单链衔接子的3'末端包含可用于连接的3'末端；以及d)任选地使该样品与连接酶接触，该连接酶将该第一单链衔接子的3'末端连接至该第一双链体末端的5'链末端，从而在该dna双链体分子的第一双链体末端生成第一环样结构。在某些实施方案中，这些突出端中的任何或所有突出端包含至少一个甲基化的胞嘧啶。在特定实施方案中，第一环结构在该第一环结构中存在的每个(或几乎每个)胞嘧啶处被甲基化。

3、在另外的实施方案中，这些方法还包括：e)使该样品与一种或多种酶接触，使得该第一核酸序列的可切割区被切割，从而在该第一双链体末端上生成保留该第一双链体末端的3'或5'单链突出端的第一两部分衔接子，其中该第一两部分衔接子包含：i)与该dna双链体分子的第一双链体末端的3'链末端连接的该第一核酸序列的5'区，以及ii)与该dna双链体分子的第一双链体末端的5'链末端连接的该第一核酸序列的3'区。在其他实施方案中，a)中的样品还包含与该第一单链衔接子相同的第二单链衔接子(例如，就存在的元件而言是相同的)，其中该第二单链衔接子包含第二核酸序列和任选的与该第二核酸序列的3'末端连接的3'封闭基团，其中该第二核酸序列的5'末端是腺苷酸化的，并且其中该第二核酸序列包含：5'区、3'区和在该5'区与3'区之间的可切割区，并且其中：i)在步骤b)期间，该单链连接酶将该第二单链衔接子的5'末端连接至该第二双链体末端的3'链末端，ii)任选地在步骤c)期间，该去封闭剂去除或修饰该3'末端封闭基团，使得该第二单链衔接子的3'末端包含可用于连接的3'末端；并且iii)任选地在步骤d)期间，该连接酶将该第二单链衔接子的游离3'末端连接至该dna双链体分子的第二双链体末端的5'链末端，从而在该dna双链体分子的第二双链体末端生成第二环样结构。在一些实施方案中，第一和/或第二核酸序列在该第一和/或第二核酸序列中存在的每个(或几乎每个)胞嘧啶处被甲基化。在某些实施方案中，甲基化是5-甲基胞嘧啶(5mc)和/或5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)。

4、在另外的实施方案中，其中在步骤e)期间，该一种或多种酶切割该第二核酸序列的可切割区，从而在该第二双链体末端上生成第二两部分衔接子，其中该第二两部分衔接子包含：i)与该dna双链体分子的第二双链体末端的3'链末端连接的该第二核酸序列的5'区，以及ii)与该dna双链体分子的第二双链体末端的5'链末端连接的该第二核酸序列的3'区。

5、在一些实施方案中，本文提供了将衔接子连接至dna双链体分子同时保留dna双链体分子的5'或3'单链突出端(以及存在于突出端上的任何dna修饰，包括甲基化)的方法，这些方法包括：a)生成样品，该样品包含：多个dna双链体分子(例如，无细胞dna双链体分子)、多个单链衔接子和单链连接酶，其中该单链连接酶具有步骤3连接酶活性但不具有步骤2腺苷酰转移活性，其中这些dna双链体分子中的每个dna双链体分子包含：i)第一双链体末端，该第一双链体末端包含3'链末端和5'链末端，并且具有3'或5'单链突出端，该3'或5'单链突出端为单个非腺嘌呤核苷酸或长度为至少两个核苷酸；以及ii)第二双链体末端，该第二双链体末端包含3'链末端和5'链末端，该第二双链体末端任选地具有3'或5'单链突出端或平端，其中这些单链衔接子中的每个单链衔接子包含核酸序列和任选的与该核酸序列的3'末端连接的3'封闭基团，其中该3'末端封闭基团任选地是经修饰的非规范核苷酸或磷酸基团，其中该核酸序列的5'末端是腺苷酸化的，并且其中该核酸序列包含：5'区、3'区和在该5'区与3'区之间的可切割区；b)在一定温度下温育该样品，使得该单链连接酶将这些单链衔接子的5'末端连接至第一和第二双链体末端的3'链末端；c)如果存在的话，任选地使该样品与去封闭剂接触，该去封闭剂从这些单链衔接子中去除该3'封闭基团；以及d)使该样品与连接酶接触，该连接酶将这些单链衔接子的3'末端连接至第一和第二双链体末端的5'链末端，从而在该多个dna双链体分子的第一双链体末端生成第一环样结构，并在该多个dna双链体分子的第二双链体末端生成第二环样结构。在某些实施方案中，这些突出端中的任何或所有突出端包含至少一个甲基化的胞嘧啶(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个胞嘧啶)。

6、在另外的实施方案中，这些方法还包括：e)使该样品与一种或多种酶接触，使得这些核酸序列的可切割区被切割，从而在该多个双链体dna分子的第一和第二双链体末端上生成两部分衔接子，其中这些两部分衔接子各自包含：i)与该多个dna双链体分子的第一双链体末端的3'链末端连接的这些核酸序列的5'区，以及ii)与该多个dna双链体分子的第一双链体末端的5'链末端连接的这些核酸序列的3'区。在另外的实施方案中，使该多个dna双链体分子与亚硫酸氢盐(或具有相同功能的类似试剂或酶)接触，以将未甲基化的(而非甲基化的)胞嘧啶转化为尿嘧啶，并作为胸腺嘧啶进行测序。在另外的实施方案中，采用此类dna双链体来生成测序文库，然后对该测序文库进行测序以生成多个序列读段(例如，其可以确定最初甲基化和未甲基化的胞嘧啶的位置)。在另外的实施方案中，使该多个dna双链体分子与化学品或酶接触(例如，在taps方法或天然或工程化的胞嘧啶脱氨酶中；参见例如liu等人, nature biotechnology第37卷,第424–429页(2019)，其通过引用并入本文)，以仅转化甲基化的胞嘧啶(而非未甲基化的胞嘧啶)，并作为胸腺嘧啶进行测序。

7、在一些实施方案中，本文提供了将衔接子连接至dna双链体分子的方法，这些方法包括：a)生成样品，该样品包含：dna双链体分子、第一单链衔接子和单链连接酶，其中该单链连接酶具有步骤3连接酶活性但不具有步骤2腺苷酰转移活性，其中该dna双链体分子包含：i)第一双链体末端，该第一双链体末端包含3'链末端和5'链末端，和ii)第二双链体末端，该第二双链体末端包含3'链末端，其中该第一单链衔接子包含第一核酸序列和与该第一核酸序列的3'末端连接的3'末端封闭基团，其中该第一核酸序列的5'末端是腺苷酸化的，并且其中该第一核酸序列包含：5'区、3'区和在该5'区与3'区之间的可切割区；以及b)在一定温度下温育该样品，使得该单链连接酶将该第一单链衔接子的5'末端连接至该第一双链体末端的3'链末端。在另外的实施方案中，这些方法还包括：c)使该样品与去封闭剂接触(如果需要)，该去封闭剂去除或修饰该3'末端封闭基团，使得该第一单链衔接子的3'末端包含可用于连接的3'末端；d)使该样品与连接酶接触，该连接酶将该第一单链衔接子的3'末端连接至该第一双链体末端的5'链末端，从而在该dna双链体分子的第一双链体末端生成第一环样结构；以及e)使该样品与一种或多种酶接触，使得该第一核酸序列的可切割区被切割，从而在该第一双链体末端上生成第一两部分衔接子，其中该第一两部分衔接子包含：i)与该dna双链体分子的第一双链体末端的3'链末端连接的该第一核酸序列的5'区，以及ii)与该dna双链体分子的第一双链体末端的5'链末端连接的该第一核酸序列的3'区。

8、在另外的实施方案中，本文提供了将衔接子连接至dna双链体分子同时保留5'或3'单链突出端的方法，这些方法包括：a)生成样品，该样品包含：dna双链体分子、第一和第二单链衔接子和单链连接酶，其中该单链连接酶具有步骤3连接酶活性但不具有步骤2腺苷酰转移活性，其中该dna双链体分子包含：i)第一双链体末端，该第一双链体末端包含3'链末端和5'链末端，并且具有3'或5'单链突出端，该3'或5'单链突出端为单个非腺嘌呤核苷酸或长度为至少两个核苷酸；以及ii)第二双链体末端，该第二双链体末端包含3'链末端和5'链末端，该第二双链体末端任选地具有3'或5'单链突出端，其中第一和第二单链衔接子各自包含第一核酸序列和与该第一核酸序列的3'末端连接的3'末端封闭基团，其中该第一核酸序列的5'末端是腺苷酸化的，并且其中该第一核酸序列包含：5'区、3'区和在该5'区与3'区之间的可切割区；以及b)在一定温度下温育该样品，使得该单链连接酶：i)将该第一单链衔接子的5'末端连接至该第一双链体末端的3'链末端，并且ii)将该第二单链衔接子的5'末端连接至该第二双链体末端的3'链末端；c)使该样品与去封闭剂接触，该去封闭剂去除或修饰该3'末端封闭基团，使得第一和第二单链衔接子的3'末端包含可用于连接的3'末端；d)在一定温度下温育该样品，使得该dna双链体变性为第一和第二靶标-衔接子构建体；e)使该样品与环化酶接触，使得第一和第二靶标-衔接子构建体的末端被连接，从而生成第一靶标-衔接子环结构和第二靶标-衔接子环结构；以及f)任选地使该样品与一种或多种酶接触，使得第一和第二衔接子的第一核酸序列的可切割区被切割，从而：i)在该第一双链体末端上生成保留该第一双链体末端的3'或5'单链突出端的第一两部分衔接子；以及ii)在该第二双链体末端上生成第二两部分衔接子。

9、在某些实施方案中，本文提供了组合物，其包含：a)多个单链衔接子，其中这些单链衔接子中的每个单链衔接子包含核酸序列和任选的与该核酸序列的3'末端连接的3'末端封闭基团，其中该3'末端封闭基团任选地是经修饰的非规范核苷酸或磷酸基团，其中该核酸序列的5'末端是腺苷酸化的，并且其中该核酸序列包含：5'区、3'区和在该5'区与3'区之间的可切割区；以及b)单链连接酶，其中该单链连接酶具有步骤3连接酶活性但不具有步骤2腺苷酰转移活性。在某些实施方案中，核酸序列在该核酸序列中存在的每个(或几乎每个)胞嘧啶处被甲基化。在某些实施方案中，甲基化是5-甲基胞嘧啶(5mc)和/或5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)。

10、在一些实施方案中，本文提供了组合物、试剂盒和系统，其包含：a)多个单链衔接子(或单个单链衔接子)，其中这些单链衔接子中的每个单链衔接子(或该衔接子)包含单链核酸序列，该单链核酸序列除一个尿嘧啶碱基外为dna，其中该单链核酸序列包含：i)任选地包含seq id no:56的第一测序引物结合位点；ii)任选地包含seq id no:57的第二测序引物结合位点；iii)腺苷酸化的5'末端；以及iv)包含磷酸基团的3'末端；并且其中该尿嘧啶碱基在第一与第二测序引物结合位点之间，并且任选地其中核酸序列在该核酸序列中存在的每个或几乎每个胞嘧啶处被甲基化。

11、在特定实施方案中，该多个单链衔接子包括至少50个单链衔接子，并且其中这些核酸序列中的每个核酸序列还包含不同的条形码序列，其中该条形码序列的长度任选地为2-12或13-18 (例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18)个核苷酸。在其他实施方案中，这些组合物、试剂盒和系统还包含：b)单链连接酶，其中该单链连接酶具有步骤3连接酶活性但不具有步骤2腺苷酰转移活性。在某些实施方案中，单链核酸序列还包含：i)任选地包含seq id no:59的第一流动池结合序列，和ii)任选地包含seq id no:60的第二流动池结合序列。在其他实施方案中，单链核酸序列还包含：i)任选地包含seq id no:62的第一索引序列，和ii)任选地包含seq id no:63的第二索引序列。在另外的实施方案中，单链序列包含选自以下的序列：seq id no: 54、55、58和61。

12、在另外的实施方案中，组合物还包含去封闭剂。在另外的实施方案中，组合物还包含选自以下的连接酶：环化酶、来自大肠杆菌的rtcb连接酶和同源rtcb连接酶、热稳定性rtcb，诸如来自嗜热栖热菌(thermus thermophilus) (27)或来自掘越氏火球菌(pyrococcus horikoshii) (28,30)的rtcb，环化酶i、环化酶ii、ts2126 rna连接酶和mthdna连接酶、t4 rna连接酶1和t4 rna连接酶2。在其他实施方案中，组合物还包含能够切割核酸序列的可切割区的一种或多种酶。在另外的实施方案中，组合物还包含多个dna双链体分子，其中这些dna双链体分子中的每个dna双链体分子包含：i)第一双链体末端，该第一双链体末端包含3'链末端和5'链末端，并且具有3'或5'单链突出端或平端；以及ii)第二双链体末端，该第二双链体末端包含3'链末端和5'链末端，该第二双链体末端任选地具有3'或5'单链突出端或平端。在另外的实施方案中，这些dna双链体分子中的每个dna双链体分子在第一双链体末端和第二双链体末端上包含环样结构，其中该环样结构由核酸序列组成。

13、在另外的实施方案中，本文提供了组合物，其包含：多个dna双链体分子，这些dna双链体分子是片段化的基因组dna双链体分子和/或无细胞dna双链体分子，其中这些dna双链体分子中的每个dna双链体分子包含：i)第一双链体末端，该第一双链体末端包含3'链末端和5'链末端，并且具有3'或5'单链突出端，该3'或5'单链突出端为单个非腺嘌呤核苷酸或长度为至少两个核苷酸；以及ii)第二双链体末端，该第二双链体末端包含3'链末端和5'链末端，该第二双链体末端任选地具有3'或5'单链突出端或平端，并且其中第一双链体末端或第二双链体末端均未通过添加或缺失核苷酸而改变，并且其中存在以下任一种情况：i)其中这些dna双链体分子中的每个dna双链体分子在第一双链体末端和第二双链体末端上包含环样结构，其中该环样结构由包含以下的核酸序列组成：5'区、3'区和在该5'区与3'区之间的可切割区；或ii)其中这些dna双链体分子中的每个dna双链体分子在第一双链体末端上包含第一两部分衔接子，其中每个第一两部分衔接子包含：a)与该dna双链体分子的第一双链体末端的3'链末端连接的该核酸序列的5'区，以及b)与该dna双链体分子的第一双链体末端的5'链末端连接的该第一核酸序列的3'区。在某些实施方案中，这些突出端中的任何或所有突出端包含至少一个甲基化的胞嘧啶(例如，所有存在的胞嘧啶均被甲基化)。

14、在某些实施方案中，其中，对于部分ii)，这些dna双链体分子中的每个dna双链体分子在第二双链体末端上还包含第二两部分衔接子，其中每个第二两部分衔接子包含：a)与该dna双链体分子的第二双链体末端的3'链末端连接的该第二核酸序列的5'区，以及b)与该dna双链体分子的第二双链体末端的5'链末端连接的该第二核酸序列的3'区。在特定实施方案中，从至少一些dna双链体分子生成测序文库，并且任选地对该测序文库进行测序以生成多个序列读段。在另外的实施方案中，片段化的基因组或无细胞dna双链体来自人或哺乳动物物种，任选地来自体液样品，该体液样品任选地是血浆、血液、尿液或精液。在一些实施方案中，第一和/或第二核酸序列在该第一和/或第二核酸序列中存在的每个(或几乎每个)胞嘧啶处被甲基化。在某些实施方案中，甲基化是5-甲基胞嘧啶(5mc)和/或5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)。

15、在一些实施方案中，本文提供了试剂盒和组合物，其包含：a)多个单链衔接子，其中这些单链衔接子中的每个单链衔接子包含核酸序列和任选的与该核酸序列的3'末端连接的3'末端封闭基团，其中该3'末端封闭基团任选地是经修饰的非规范核苷酸或磷酸基团，其中该核酸序列的5'末端是腺苷酸化的，并且其中该核酸序列包含：5'区、3'区和在该5'区与3'区之间的可切割区；以及b)单链连接酶，其中该单链连接酶具有步骤3连接酶活性但不具有步骤2腺苷酰转移活性。在某些实施方案中，核酸序列在该核酸序列中存在的每个(或几乎每个)胞嘧啶处被甲基化。在某些实施方案中，甲基化是5-甲基胞嘧啶(5mc)和/或5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)。

16、在某些实施方案中，试剂盒和系统还包含去封闭剂。在另外的实施方案中，试剂盒和系统还包含选自以下的连接酶：环化酶、来自大肠杆菌的rtcb连接酶或相关同源rtcb、热稳定性rtcb、环化酶i、环化酶ii、ts2126 rna连接酶和mth dna连接酶、t4 rna连接酶1和t4rna连接酶2。在另外的实施方案中，试剂盒和系统还包含能够切割核酸序列的可切割区的一种或多种酶。在另外的实施方案中，试剂盒和系统还包含多个dna双链体分子，其中这些dna双链体分子中的每个dna双链体分子包含：i)第一双链体末端，该第一双链体末端包含3'链末端和5'链末端，并且具有3'或5'单链突出端，该3'或5'单链突出端为单个非腺嘌呤核苷酸或长度为至少两个核苷酸；以及ii)第二双链体末端，该第二双链体末端包含3'链末端和5'链末端，该第二双链体末端任选地具有3'或5'单链突出端或平端。在另外的实施方案中，这些dna双链体分子中的每个dna双链体分子在第一双链体末端和第二双链体末端上包含环样结构，其中该环样结构由核酸序列组成。在一些实施方案中，试剂盒和系统还包含一个或多个容器，用于共同或分开地容纳所列举的组分，任选地，其中这些组分存在于容器内。在另外的实施方案中，该一个或多个容器选自纸板箱、塑料袋或塑料盒、玻璃小瓶和塑料小瓶。在某些实施方案中，这些突出端中的任何或所有突出端包含至少一个甲基化的胞嘧啶(例如，1、2、3个或更多个)。

17、在一些实施方案中，本文提供了组合物、试剂盒和系统，其包含：多个单链衔接子，其中所述单链衔接子中的每个单链衔接子包含核酸序列，其中所述核酸序列的5'末端是腺苷酸化的，其中所述核酸序列包含：5'区、3'区和在所述5'区与3'区之间的可切割区，其中所述第一核酸序列的所述5'区和3'区各自包含彼此具有预定义关系的条形码序列，并且其中存在以下中的至少一种情况：i)其中所述5'区中的所述条形码不与所述3'区中的所述条形码互补，和/或ii)其中所述5'区中的所述条形码具有与所述3'区中的所述条形码不同的长度。在另外的实施方案中，条形码的预定义关联基于查找表(例如，表5-8)。在另外的实施方案中，所述5'区中的条形码与3'区中的条形码相同(表8)。在其他实施方案中，3'末端封闭基团连接至所述核酸序列的所述3'末端，其中所述3'末端封闭基团任选地是经修饰的非规范核苷酸或磷酸基团。在某些实施方案中，核酸序列在该核酸序列中存在的每个(或几乎每个)胞嘧啶处被甲基化。在某些实施方案中，甲基化是5-甲基胞嘧啶(5mc)和/或5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)。

18、在特定实施方案中，本文提供了组合物，其包含：测序文库，该测序文库包含多个dna双链体分子，这些dna双链体分子在每个末端连接有y形衔接子，其中所述y形衔接子中的每个y形衔接子包含5'臂和3'臂，其中所述5'臂具有第一条形码并且所述3'臂具有第二条形码，并且其中存在以下中的至少一种情况：i)所述第一条形码与所述第二条形码不互补，和/或ii)所述第一条形码具有与所述第二条形码不同的长度。在某些实施方案中，第一和第二条形码具有相同的序列。在某些实施方案中，y形衔接子在核酸序列中存在的每个或几乎每个胞嘧啶处被甲基化。在某些实施方案中，甲基化是5-甲基胞嘧啶(5mc)和/或5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)。

19、在一些实施方案中，3'或5'单链突出端的长度恰好为或为至少3个核苷酸，并且任选地，其中3'或5'单链突出端的长度恰好为或为至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或20个核苷酸。在另外的实施方案中，第一两部分衔接子的5'区和3'区彼此基本上或完全不杂交。在另外的实施方案中，第一两部分衔接子在连接和切割后形成一般的v-构型(即，y形衔接子减去退火的下茎部分)。在其他实施方案中，第二两部分衔接子的5'区和3'区彼此基本上或完全不杂交。在另外的实施方案中，第二两部分衔接子在连接和切割后形成一般的v-构型(即，y形衔接子减去退火的下茎部分)。

20、在特定实施方案中，可切割区包含：a)经修饰的非规范碱基；b)核酸主链连接键(硫代磷酸酯或磷酸二酯键)；或c)内切核酸酶识别位点，其中内切核酸酶识别位点形成于5'区与3'区的接合点处或由5'区与3'区之间的序列组成；或d)一个或多个rna碱基，其中任选地，第一和第二核酸序列的其余部分由dna组成；或e)包含一种序列，当添加次级寡核苷酸时，该序列形成内切核酸酶识别序列。在其他实施方案中，不对dna双链体分子进行末端修复和/或a尾添加。

21、在其他实施方案中，温育的温度足以使得第一双链体末端和/或第二双链体末端瞬时分离。在特定实施方案中，温育的温度介于70和80摄氏度之间，或为约75摄氏度。

22、在另外的实施方案中，单链连接酶是热稳定性赖氨酸突变型ssdna/rna连接酶，其是前体热稳定性ssdna/rna连接酶的突变形式，其中该前体热稳定性ssdna/rna连接酶具有基序i ekx(d/n/h)g，并且其中该热稳定性赖氨酸突变体用任何其他氨基酸代替基序i中的k，或选自丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、半胱氨酸(c)、缬氨酸(v)、苏氨酸(t)和甘氨酸(g)。在某些实施方案中，该热稳定性赖氨酸突变型ssdna/rna连接酶包含选自由以下组成的组的基序序列：egx(d/n/h)g (seq id no:34)、epx(d/n/h)g (seq id no:35)、eax(d/n/h)g (seqid no:36)、evx(d/n/h)g (seq id no:37)、elx(d/n/h)g (seq id no:38)、e ix(d/n/h)g(seq id no:39)、emx(d/n/h)g (seq id no:40)、ecx(d/n/h)g (seq id no:41)、efx(d/n/h)g (seq id no:42)、eyx(d/n/h)g (seq id no:43)、ewx(d/n/h)g (seq id no:44)、ehx(d/n/h)g (seq id no:45)、erx(d/n/h)g (seq id no:46)、eqx(d/n/h)g (seq id no:47)、enx(d/n/h)g (seq id no:48)、eex(d/n/h)g (seq id no:49)、edx(d/n/h)g (seq idno:50)、esx(d/n/h)g (seq id no:51)、etx(d/n/h)g (seq id no:52)和ex(d/n/h)g (seqid no:53)，赖氨酸的点缺失)；其中x是任何氨基酸。在特定实施方案中，x是与其他氨基酸相比具有小的或更小的侧链的氨基酸。在一些实施方案中，单链连接酶具有与seq id no:1-21中的任一者94%或95%或96%或97%或98%或99%或100%相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，单链连接酶是天然存在的酶或是其突变体。在特定实施方案中，单链连接酶是美国专利公开20190062827中描述的任何一种，该美国专利公开通过引用整体并入本文。在另外的实施方案中，单链连接酶是天然存在的酶或是其突变体。

23、在另外的实施方案中，dna双链体分子是来自受试者的无细胞dna (cfdna)，其中该dna双链体分子的第一和第二双链体末端未通过添加或缺失核苷酸而改变。在另外的实施方案中，受试者是人，并且任选地其中无细胞dna双链体从体液中提取，该体液任选地是血浆、尿液、血液或csf液。

24、在特定实施方案中，dna双链体分子的第一双链体末端具有3'单链突出端。在其他实施方案中，dna双链体分子的第一双链体末端具有5'单链突出端。在另外的实施方案中，dna双链体分子的第二双链体末端具有3'单链突出端。在一些实施方案中，dna双链体分子的第二双链体末端具有5'单链突出端。在另外的实施方案中，第一和/或第二单链衔接子包含3'末端封闭基团，并且其中进行c)。在其他实施方案中，第一和/或第二单链衔接子不具有3'封闭基团，并且不进行步骤c)。

25、在另外的实施方案中，第二核酸序列的5'区和3'区各自包含选自以下的至少一个元件：流动池连接序列、独特条形码序列、非独特条形码序列、样品识别索引序列、读段1引物结合序列、读段2引物结合序列和通用pcr扩增引物结合序列。在特定实施方案中，第一核酸序列的5'区和3'区各自(或它们中的至少一者)包含选自以下的至少一个元件：流动池连接序列、独特条形码序列、非独特条形码序列、样品识别索引序列、读段1引物结合序列、读段2引物结合序列和通用pcr扩增引物结合序列。在其他实施方案中，第一核酸序列的5'区和3'区各自包含独特条形码序列，并且任选地其中这些条形码序列彼此具有预定义关系，该预定义关系任选地基于预定义关联，该预定义关联可以是查找表(例如，表5-8)或其他用于关联条形码的方法，并且任选地其中这些条形码序列彼此不互补，并且任选地其中这些条形码序列彼此相同，并且任选地其中这些条形码具有不同的长度。

26、在另外的实施方案中，这些方法还包括使样品与引物接触，这些引物与第一两部分衔接子的第一核酸序列的3'和5'区的至少一部分杂交，并进行pcr扩增以生成扩增子。在其他实施方案中，这些方法还包括：使样品与引物接触，这些引物与第一和第二两部分衔接子的第一和第二核酸序列的3'和5'区的至少一部分杂交，并进行pcr扩增以生成扩增子。在另外的实施方案中，扩增子包含条形码，并且该方法还包括：对扩增子进行测序以生成读段，至少部分地根据条形码对读段碱基进行分组，以及任选地鉴定dna双链体分子的原始顶部链和底部链。在一些实施方案中，这些方法还包括：通过计算确定dna双链体分子的原始第一末端和第二末端。

27、在特定实施方案中，3'末端封闭基团选自具有3'-磷酸基团的核苷酸和核苷酸可逆终止子。在另外的实施方案中，去封闭剂选自：具有磷酸酶活性的酶，其任选地选自：t4多核苷酸激酶、小牛肠碱性磷酸酶(cip)、虾碱性磷酸酶(sap)；以及用于使核苷酸可逆终止子去封闭的化学或物理药剂，其任选地是缓冲的硝酸钠或uv光。在另外的实施方案中，连接酶选自：环化酶i、环化酶ii、mth dna连接酶、来自大肠杆菌的rtcb连接酶、热稳定性rtcb、taqdna连接酶、t4 rna连接酶1、t4 rna连接酶2。在另外的实施方案中，一种或多种酶选自：内切核酸酶、内切核酸酶v、内切核酸酶viii、内切核酸酶和尿嘧啶dna糖基化酶、热稳定性氧代鸟嘌呤糖基化酶(ogg)和碘。

28、在特定实施方案中，温育的温度足以使得第一双链体末端和/或第二双链体末端瞬时分离。在其他实施方案中，温育的温度介于70和80摄氏度之间(例如，70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80)，或为约75摄氏度。

29、在一些实施方案中，第一核酸序列的5'区和3'区各自包含条形码序列，使得在分析期间，具有相同条形码序列的读段可以被分组在一起以进行错误校正。

30、在一些实施方案中，第一核酸序列的5'区和3'区各自包含具有预定义关系的条形码序列，并且任选地其中这些条形码序列彼此不互补，并且任选地其中这些条形码序列彼此相同，并且任选地其中这些条形码具有不同的长度。例如，它们可以彼此互补。或者，它们可以不是互补的，并且可以从双条形码对的列表中选择。在分析期间，可以将具有满足预定义关系的条形码的读段配对，以恢复原始双链体。在一些实施方案中，配对的双链体可用于错误校正。在一些实施方案中，可以从配对的双链体中推断出原始末端。

31、在特定实施方案中，单链衔接子的3'修饰的非规范核苷酸选自：具有3'-磷酸基团的核苷酸，或核苷酸可逆终止子，例如具有3'-o-封闭基团的核苷酸可逆终止子。例如，3'-o-烯丙基(ruparel h等人(2005) design and synthesis of a 3’-o-allylphotocleavable fluorescentnucleotide as a reversible terminator for dnasequencing by synthesis.proc natl acadsci usa, 102:5932–5937.)。对于另一个实例，3'-onh2 (chen f等人(2009) reconstructed evolutionary adaptive pathsgivepolymerases accepting reversible terminatorsfor sequencing and snpdetection, pnas, 107: 1948-1953)。或不含3'-封闭基团的核苷酸可逆终止子，诸如“虚拟终止子”，并且可以通过uv去封闭(引用：wu w.等人termination of dna synthesis byn6-alkylated, not 3-o-alkylated, photocleavable 2-deoxyadenosinetriphosphates. nucleic acids res. 2007;35:6339–6349)。

32、在另外的实施方案中，去封闭剂选自：具有磷酸酶活性的酶，例如t4多核苷酸激酶、小牛肠碱性磷酸酶(cip)、虾碱性磷酸酶(sap)。对于核苷酸可逆终止子，用于去除封闭基团的化学试剂或uv。例如，用于将3'-onh2转化为3'-oh的缓冲的(ph 5.5)亚硝酸钠，如上述参考文献中所述。

33、在一些实施方案中，第一核酸序列的5'区和3'区各自包含条形码序列，使得在分析期间，具有相同条形码序列的读段可以被分组在一起以进行错误校正。

34、在一些实施方案中，第一核酸序列的5'区和3'区各自包含具有预定义关系的条形码序列，并且任选地其中这些条形码序列彼此不互补，并且任选地其中这些条形码序列彼此相同，并且任选地其中这些条形码具有不同的长度。例如，它们可以彼此互补。或者，它们可以不是互补的，并且可以从独特双条形码对的列表(例如，如表5-8中所示)中选择。在分析期间，可以将具有满足预定义关系的条形码的读段配对，以恢复原始双链体(例如，使得可以鉴定原始的顶部链和底部链)。在一些实施方案中，配对的双链体可用于错误校正。在一些实施方案中，可以从配对的双链体中推断出原始末端。

35、在一些实施方案中，第一核酸序列的5'区和3'区各自包含具有预定义关系的条形码序列，并且任选地其中这些条形码序列彼此不互补，并且任选地其中这些条形码具有不同的长度。例如，它们可以彼此互补。或者，它们可以不是互补的，并且可以从独特双条形码对的列表(例如，查找表，诸如表5-8)中选择。在分析期间，可以将具有满足预定义关系的条形码的读段配对，以恢复原始双链体，并且任选地其中这些条形码序列彼此不互补，并且任选地其中这些条形码具有不同的长度。在一些实施方案中，配对的双链体可用于错误校正。在一些实施方案中，可以从配对的双链体中推断出原始末端。

36、在一些实施方案中，试剂盒和系统还包含一个或多个容器，用于共同或分开地容纳所列举的组分，任选地，其中这些组分单独地或以混合形式存在于容器内。在另外的实施方案中，该一个或多个容器选自纸板箱、塑料袋或塑料盒、玻璃小瓶和塑料小瓶。