一种胰腺组织单细胞测序方法

本发明涉及一种单细胞测序技术，特别是一种胰腺组织单细胞测序方法。

背景技术：

1、在现有技术的组织单细胞测序中，制备单细胞悬液用于10x单细胞测序，侧重解离效率，无组织固定步骤，直接解离。但是传统方法并不适用于胰腺组织检测，检测结果中细胞成分比例，尤其是胰腺腺泡细胞，细胞比例远少于试剂结果。这可能是由于现有技术对组织的快速解离，会导致rna快速降解和应激基因表达，最终影响检测腺泡细胞占比，并且现有技采用tumor dissociation kit（酶d、r、a混合物）的解离酶，会降低细胞活性，进一步影响检测腺泡细胞占比结果。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决上述技术的不足而提供一种胰腺组织单细胞测序方法，通过dsp（dithiobis(succinimidyl propionate）固定和解离，将新鲜的小鼠胰腺组织制备成高质量的单细胞悬液，减少细胞应激和rna降解，以适用于胰腺这种易碎组织的单细胞测序，用于后续单细胞转录组测序分析。

2、为了达到上述目的，本发明提供的一种胰腺组织单细胞测序方法，其特征是包括如下步骤：

3、（1）dsp工作液配制：

4、50x dsp母液从-80冰箱取出溶解后，取10ul 50x dsp 加入1.5ml离心管中，边震荡边加入490ul 常温pbs，用200ul移液器逐滴加入，防止产生沉淀；

5、1xdsp工作液用40um细胞筛过滤，工作液配制后在5min内进行固定使用。

6、（2）组织固定：

7、快速取除小鼠胰腺组织，用pbs清洗后，放入5ml离心管中，加入500ul的dsp工作液，剪成3x3mm的小块（越小越好），常温固定30min；

8、固定15min后，用剪刀再次将组织剪得更碎；

9、固定30min后，加入10 µl 1m tris-hcl 7.5，混样后，室温放置15min；

10、500g 离心10min，去除固定液，加1ml pbs进行清洗，500g 4℃离心5min；

11、去除上清，加1ml pbs进行清洗，500g 4℃离心5min，去除上清；

12、（3）组织解离：

13、在清洗后的样品管中加入80ul 1mg/ml的liberase tm（终浓度200ug/ml）, 补加pbs至4ml，37℃消化30min；

14、消化15min后进行吹打混匀一次；

15、消化30min后过70um细胞筛；500g 4℃离心5min；

16、去上清后，加10ml 预冷的pbs+0.1%bsa重悬沉淀，500g 4℃离心5min；

17、再重复清洗两次；

18、用2ml 1640 重悬沉淀，镜检；

19、取500ul样品过40um细胞筛后，稀释至700ul；

20、取2w细胞进行上机。

21、（4）细胞计数和活率测定：通过镜检（显微镜检查）评估细胞浓度和活率。使用台盼蓝染色进行活细胞计数：取10 μl细胞悬液与10 μl 0.4%台盼蓝混合，用细胞计数板或自动化计数器测定。

22、本发明对胰腺组织通过固定减少解离应激，引入固定步骤，专注于细胞保存而非快速解离，由此提高了转录组质量；通过使用dsp固定（室温30分钟）后淬灭（tris-hcl），通过控制时间避免过度交联，由此减少rna降解和应激基因表达；本发明采用liberase tm（200 μg/ml），适合固定后组织，提高了细胞活性；本发明在37°c消化30分钟，800 rpm振荡，中途吹打，省去仪器程序，依赖手动振荡，更适合小规模实验；并且固定后和解离后均用pbs清洗，由于胰腺组织红细胞较少，通过评估样品纯度，无红细胞裂解步骤，由此简化了流程；本发明先70μm筛，最后40μm筛过滤，这种严格的过滤手段，确保单细胞悬液质量，减少团块。传统单细胞检测方法，胰腺组织中腺泡细胞比例不足20%，而通过本发明方法对胰腺组织单细胞测序，所检测腺泡细胞占比得到了大幅提高，达到74.1%，接近于正常胰腺组织中80%腺泡细胞的占比。

23、本发明旨在通过dsp（dithiobis(succinimidyl propionate）固定和解离方法，将新鲜的小鼠胰腺组织制备成高质量的单细胞悬液，用于后续单细胞转录组测序分析。该方法特别优化了固定步骤，以减少细胞应激和rna降解，适用于胰腺这种易碎组织，实验结果相较于传统方法，更加符合胰腺组织实际的细胞比例。

1.一种胰腺组织单细胞测序方法，其特征是包括如下步骤：