一种用于诊断或辅助诊断胃癌的tsRNA生物标志物组合及其应用

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种用于诊断或辅助诊断胃癌的tsrna生物标志物组合及其应用。

背景技术：

1、根据世界卫生组织的数据显示，2023年我国胃癌新发病例约为50.3万例，发病率仍位居恶性肿瘤的第4位，死亡病例达到38.9万例，死亡率位列第3位。我国胃癌发病人数和死亡人数分别占全球总数的约44.8%和49.2%。胃癌的早期症状不明显，诊断率低，进展期胃癌比例较高。胃癌早期症状隐匿，诊断率低，进展期胃癌比例较高。我国胃癌患者的5年相对生存率约为35.9%，明显低于日本（60.3%）和韩国（77.0%）。这主要是由于多数患者在确诊时已处于中晚期，常规治疗效果有限，转移和复发率高。由此可见，胃癌的早期诊断和预防仍然是我国恶性肿瘤防控中的重大挑战。

2、目前，临床指南推荐的胃癌筛查方法包括血清肿瘤标志物检测、影像学检查（如x线钡餐造影、ct、mri等）和内镜检查及组织活检。这些方法在胃癌诊断中发挥着重要作用，但均存在一定局限性。传统的血清学标志物，如癌胚抗原（cea）和糖类抗原19-9（ca19-9），虽然已广泛用于胃癌的辅助诊断和疗效监测，但其对早期胃癌的灵敏度和特异性均较低。例如，有研究表明，cea（临界值3ng/ml）和ca19-9（临界值37u/ml）对胃癌的诊断灵敏度分别为20%-30%和30%-40%，特异性分别为70%-80%和80%-90%。影像学检查和内镜检查虽然能较为准确地发现胃部病变，但前者存在辐射暴露风险，后者为侵入性检查，患者依从性较差，且费用较高，难以作为大规模人群筛查的常规手段。因此，为满足临床需求，迫切需要开发一种灵敏度高、特异性强、无创、便捷且经济的胃癌早期诊断新方法。

3、液态活检是肿瘤筛查和诊断的突破性技术，具备无创、实时动态检测、克服肿瘤异质性等独特优势，使胃癌患者及早接受治疗，通过手术获得根治性治疗，提高患者的生存率并减轻患者的治疗成本，具有显著的临床意义和社会效益。

4、液态活检作为一种新兴的肿瘤筛查和诊断技术，具有无创、可重复、实时动态监测、克服肿瘤异质性等优势，在肿瘤早期诊断、疗效评估和预后监测等方面展现出巨大的应用潜力。

5、近年来，循环肿瘤细胞（ctcs）、循环肿瘤dna（ctdna）和外泌体等多种液态活检标志物已被用于胃癌的研究。其中，循环中的小分子非编码rna（smallnon-codingrna,sncrna）因其在血液中的稳定性而备受关注。sncrna，包括microrna(mirna)等，已被证实与肿瘤的发生发展密切相关，具有成为新型肿瘤标志物的潜力。trna衍生的小rna(trna-derivedsmallrna,tsrna)是一类长度为14-30个核苷酸的非编码rna分子，由成熟trna或trna前体在特定核酸酶（如dicer、rnasez等）的作用下切割产生。研究表明，tsrna并非trna的随机降解产物，而是在细胞内发挥重要调控作用的功能分子，参与基因表达调控、细胞增殖、凋亡、应激反应等多种生物学过程。更重要的是，研究发现tsrna在多种肿瘤（包括胃癌）中存在异常表达，且这种异常表达往往早于肿瘤的临床症状出现。tsrna在体液（如血液、尿液等）中具有良好的稳定性，不易被rna酶降解，可通过qrt-pcr等技术进行准确定量，且tsrna种类繁多，表达模式具有组织和疾病特异性，这些特点使得tsrna成为一种极具潜力的非侵入性肿瘤生物标志物。

6、鉴于此，特提出本发明，一种基于液体活检的tsrna标志物组合用于中国人群胃癌的早期筛查。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种用于诊断或辅助诊断胃癌的tsrna生物标志物组合及其应用，以解决上述背景技术中提出的便于早期的筛查胃癌问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种用于诊断或辅助诊断胃癌的tsrna生物标志物组合，包括所述tsrna生物标志物组合的tsrna分子包括一种或几种：

4、mature-trna-arg-tcg_5_end、mature-trna-gly-gcc_cca_end、mature-trna-gly-tcc_5_end、mature-trna-pro-tgg_cca_end、mature-trna-ser-gct_5_end。

5、检测样本中目的tsrna生物标志物组合在制备用于胃癌早期诊断或辅助诊断胃癌的试剂盒中的应用，所述tsrna生物标志物组合的tsrna分子核苷酸序列依次如seqidno.1-5所示。

6、作为优选，所述检测样本中目的tsrna的试剂包括用于检测目的tsrna的引物和探针。

7、一种用于诊断或辅助诊断胃癌的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测目tsrna的引物和探针；所述tsrna生物标志物组合的tsrna分子核苷酸序列依次如seqidno.1-5所示。

8、一种胃癌肿瘤筛查和风险计算方法，包括如下步骤：

9、s1、血液样本收集与处理；

10、s2、小rna测序文库构建及tsrna定量；

11、s3、差异分析及分类性能评估及特征tsrna筛选；

12、s4、构建堆叠式集成模型；

13、s5、独立验证集性能验证及风险计算。

14、作为优选，步骤s1中，分为cf1阶段与cf2阶段两个阶段，分别得到实验集与独立验证集；

15、所述cf1阶段：使用edta抗凝管采集血液样品，离心力处理分离血浆，分装至无rna酶冻存管中，进行低温保存作为实验集，保存至rna提取；

16、所述cf2阶段：相同方法收集血液样本作为独立验证集，保存至rna提取。

17、作为优选，步骤s2包括以下步骤：

18、s21、利用5'-腺苷化/3'-封闭单链dna接头完成rna的3'端连接，引入含umi的rt引物结合残留接头，随后进行5'端连接，对步骤s1中血液样本进行rna提取；

19、s22、将提取的rna采用高灵敏度聚合酶反转录合成cdna并扩增，通过page胶回收110-140bppcr产物；

20、s23、进一步环化成单链dna文库，经质控后基于dnbseq平台进行单端50bp高通量测序；

21、s24、测序后通过质量控制过滤低质量读段、修剪接头序列、过滤长度非15-44bp的读段、移除全polya序列、限制高腺嘌呤含量以及剔除含非标准碱基的读段，输出序列数据；

22、s25、根据输出序列数据通过sports工具进行tsrna的量化；

23、s26、量化后的tsrna通过bowtie优先映射至gtrnadb数据库，筛选出与trna序列匹配的读段；

24、s27、将筛选后的trna序列匹配的读段，通过分析tsrna的切割位点，区分其来源于trna的5'端、3'端或3'cca末端，基于匹配读段数，计算各tsrna的表达丰度，并保留平均表达量大于5的特征的tsrna 特征集合。

25、作为优选，步骤s3包括以下步骤：

26、s31、基于经验贝叶斯方法筛选差异表达tsrna，通过benjamini-hochberg法校正p值，并结合以下标准筛选候选标志物：auc>0.75、|logfc|>1、平均表达量>3cpm；

27、用lasso回归进一步进行特征tsrna筛选，得到最终tsrna特征标志物。

28、作为优选，步骤s4中，所述构建堆叠式集成模型为首先基于基学习器生成预测概率矩阵，随后以广义线性模型作为元学习器，通过加权融合策略整合基模型的分类输出。

29、作为优选，步骤s5中，所述独立验证集性能验证为采用所述cf2阶段独立样本队列进行盲法验证，综合评价集成模型对胃癌的检测性能。

30、本发明的有益效果：

31、1.本发明提供的tsrna生物标志物组合作为胃癌诊断标志物，其特异性好，能准确鉴别胃癌患者；敏感性高，能早期检测出癌症患者且诊断效率高，为诊断胃癌提供了新的临床手段，具有良好的转化医学前景。

32、2.本发明构建了基于tsrna生物标志物的胃癌诊断模型，该模型可用于胃癌的早期筛查和辅助诊断，能够提供对胃癌风险的精确评估，从而促进早期治疗和管理决策。