一种基于MIRA-CRISPR/Cas12a的鸡传染性喉气管炎病毒gB基因检测方法及其应用

本发明涉及生物学检测，具体涉及一种基于mira-crispr/cas12a的鸡传染性喉气管炎病毒gb基因检测方法及其应用。

背景技术：

1、鸡传染性喉气管炎（infectious laryngotracheitis，ilt）是由鸡传染性喉气管炎病毒（iltv）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。鸡群感染后主要表现为严重的呼吸困难、咳嗽及咳出带血黏液，病理特征以气管黏膜出血、坏死和脱落为主。该病在集约化养殖条件下极易快速扩散，常导致蛋鸡产蛋率严重下降或肉鸡大量死亡，给养殖业造成重大的经济损失。

2、iltv属于疱疹病毒科，其基因组中的gb基因是编码主要囊膜糖蛋白的关键序列，在病毒吸附、细胞融合及诱导宿主产生中和抗体过程中发挥重要作用。由于该基因在不同毒株间高度保守，是临床上进行iltv分子生物学诊断和流行病学调查的首选靶点。

3、目前，临床常用的iltv检测方法主要包括常规pcr、实时荧光定量pcr（qpcr）及酶联免疫吸附试验（elisa）等。这些方法虽具有较好的灵敏度，但普遍需要配置荧光定量pcr仪、电泳系统或酶标仪等笨重且昂贵的仪器设备，且操作步骤繁琐、耗时较长，对操作人员的专业要求高。这导致现有技术只能局限于实验室辅助诊断，无法满足基层养殖现场对快速、便携及即时筛查的实际需求。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种基于mira-crispr/cas12a的鸡传染性喉气管炎病毒gb基因检测方法及其应用，以解决现有鸡传染性喉气管炎病毒检测方法检测设备依赖性强、检测周期长、无法在基层现场快速筛查等问题。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、本发明的第一方面，提供一种基于mira-crispr/cas12a的鸡传染性喉气管炎病毒非疾病诊断目的检测方法，包括以下步骤：

4、s1、提取待测样本的dna；

5、s2、以s1所得dna为模板，进行mira扩增，得到扩增产物；

6、s3、以s2所得扩增产物为模板，进行实时荧光crispr/cas12a反应，收集荧光信号；

7、s4、对s3所得荧光信号进行判断，若出峰时间≤20 min或cq值≤38，则待测样本为鸡传染性喉气管炎病毒阳性；若出峰时间＞20 min或cq值＞38，则待测样本为鸡传染性喉气管炎病毒阴性；

8、其中，mira扩增中采用的正向引物和反向引物如seq id no.1和seq id no.2所示；

9、seq id no.1：ccctatctcaagattcacacggaattgctg；

10、seq id no.2：gactacggcaattccttcagtcatgttagt。

11、本发明的有益效果为：本发明方法利用mira技术在恒温条件下对目标gb基因片段进行特异性高效扩增，同时引入crispr/cas12a系统对扩增产物进行特异性识别，并通过便携式荧光仪读数实现检测结果的直观输出。整个检测过程均在恒温条件下完成，一定程度上摆脱了对复杂热循环变温仪器的依赖，大幅降低了操作门槛与设备成本，易于在基层养殖现场进行推广应用。

12、进一步地，实时荧光crispr/cas12a反应中采用的荧光探针的核苷酸序列如seqid no.4所示，crrna的核苷酸序列如seq id no.5所示；

13、seq id no.4：5’-fam-ttatt-bhq i-3’；

14、seq id no.5：aauuucuacuaaguguagautccgaagccattgggtcggg。

15、进一步地，mira扩增的反应体系中：反应干粉、缓冲液、醋酸镁、正向引物、反向引物、dna模板和ddh2o的质量体积比为15 mg:29.4 μl:2.5 μl: 2 μl: 2 μl:5 μl:9.1 μl。

16、进一步地，mira扩增的反应体系中，正向引物和反向引物的浓度均为5-20 μmol/l。

17、进一步地，实时荧光crispr/cas12a反应的反应体系中：lbcas12a、crrna、10×cassmart buffer、荧光探针、扩增模板和ddh2o的质量体积比为2 μl:0.5 μl:5 μl:0.5 μl:1 μl:41 μl。

18、进一步地，实时荧光crispr/cas12a反应的反应体系中，lbcas12a的浓度为0.05-0.2 μmol/l；crrna的浓度为0.5-2 ng/μl；荧光探针的浓度为0.5-2 μmol/l。

19、进一步地，实时荧光crispr/cas12a反应的反应程序为42℃ 30 s，40个循环。

20、本发明的第二方面，提供一种基于mira-crispr/cas12a的鸡传染性喉气管炎病毒gb基因检测试剂盒，试剂盒包括如seq id no.1和seq id no.2所示的正向引物和反向引物、mira扩增反应体系和crisp/cas12a反应体系。

21、本发明的有益效果为：本发明提供了一种传染性喉气管炎病毒gb基因的检测试剂盒，该试剂盒可以特异性扩增鸡传染性喉气管炎病毒，与传染性法氏囊病毒（ibdv）、新城疫病（ndv）、鸡传染性支气管炎病毒（ibv）和h9n2禽流感病毒（aiv）的核酸均无交叉反应，特异性强，能够实现鸡传染性喉气管炎病毒的快速、准确检测。

22、进一步地，mira扩增反应体系包括mira扩增反应干粉、缓冲液、阳性对照品和阴性对照品；

23、阳性对照品包括鸡传染性喉气管炎gb基因，核苷酸序列如seq id no.3所示；

24、seq id no.3：tgcgtggcaatcctgatcccatctaccctatctcaagattcacacggaattgctggaataatagaccctcgtgatacagccagcatggatgttggaaaaatctctttctccgaagccattgggtcgggggcaccgaaagaaccccagattagaaacagaatttttgcgtgctcatctccaactggcgccagtgttgcgaggcttgcccagccacgacattgtcaccgacatgccgattcgactaacatgactgaaggaattgccgtagtcttcaagcaaaacattgccccgtacgtcttt。

25、进一步地，阴性对照品包括ddh2o。

26、进一步地，crispr/cas12a反应体系包括lbcas12a、crrna、10×cassmart buffer、荧光探针和ddh2o。

27、进一步地，荧光探针的核苷酸序列如seq id no.4所示。

28、进一步地，crrna的核苷酸序列如seq id no.5所示。

29、采用上述进一步技术方案的有益效果为：本发明对通用试剂来源没有特殊要求，采用本领域技术人员熟识市售商品即可，试剂要求低，来源广泛。

30、本发明的第三方面，提供上述试剂盒在非疾病诊断目的检测鸡传染性喉气管炎病毒中的应用。

31、本发明具有以下有益效果：

32、1、本发明提供了一种能够特异性扩增鸡传染性喉气管炎病毒gb基因的引物对，该引物对与传染性法氏囊病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和h9n2型禽流感病毒的核酸均无交叉反应，特异性强。

33、2、本发明提供了一种鸡传染性喉气管炎病毒gb基因mira扩增反应体系，该方法可以快速完成低浓度鸡传染性喉气管炎病毒核酸扩增，具备抗干扰能力和稳定性较强等优势。

34、3、本发明提供了一种基于该引物对的实时crispr/cas12a荧光检测鸡传染性喉气管炎病毒的方法，该方法能够在30 min内完成检测，可以检测低拷贝数的鸡传染性喉气管炎病毒核酸，具有操作简便、成本低、灵敏度高和假阳性率低等优势。