一种检测超微蓝藻的试剂盒及方法
本发明属于微藻分子生物学应用和水环境监测领域，具体涉及一种检测超微蓝藻的试剂盒及方法。
背景技术：
1、超微蓝藻是一类粒径极小（0.2-2.0 μm）的光合自养型原核生物，主要由聚球藻属（synechococcus）、原绿球藻属（prochlorococcus）和双色藻属（cyanobium）组成，是水生态系统中重要的初级生产者。在淡水与陆地边缘的水域中，聚球藻和双色藻往往占据主导地位。尽管体积微小，但在某些贫营养甚至中营养的水体中，超微蓝藻可占据浮游植物总生物量的50%以上。由于超微蓝藻具有极高的比表面积，对环境的适应性极强，且能够高效利用低浓度的营养盐，这使得其在大型蓝藻无法爆发的环境中仍然能维持较高的种群密度。近年来，随着全球气候变暖及水体富营养化的加剧，超微蓝藻在水体中的异常增殖与聚集现象日益频繁，其潜在的对生态及健康的危害逐渐引起了广泛关注。
2、已有研究证实部分超微蓝藻具有产生微囊藻毒素、神经毒素及嗅味物质（如2-mib）的能力，直接威胁到了饮用水安全和水产养殖的质量。这些微小的产毒细胞可穿透常规的水处理工艺，使得毒素在人体及饮用水源中累积。超微蓝藻的个体极小且比表面积大，可在极端环境下表现出极强的适应性与扩张能力，极易在较暖的表层水体中形成竞争优势，改变浮游植物的群落结构。
3、对于以地表水为水源的自来水厂来说，超微蓝藻的频繁出现对常规水处理工艺提出了严峻挑战。由于其个体微小，传统的水处理工艺难以将其完全去除，从而导致超微蓝藻细胞及其代谢产物进入供水系统，威胁到了供水安全。从饮用水安全的角度来看，超微蓝藻的隐蔽性给水处理监测带来了巨大的挑战。传统的显微镜计数法难以对这些微米级的藻细胞进行准确计数和分类，这也导致其在常规的水质监测中长期被忽略。这些微小的藻细胞可穿透水厂的混凝、沉淀和过滤屏障进入出厂水，增加出厂水的生物风险，还可能在输水管网中形成生物膜，甚至产生具有生物毒性的次级代谢产物。
4、传统的显微计数法受到光学显微镜分辨率（约为0.2 μm）的限制，难以对形态特征单一的超微蓝藻进行分类，且极易将其与异养细菌混淆；其次，仅通过形态学特征很难区分亲缘关系极近但生理特性差异较大的类群（如聚球藻与双色藻）。流式细胞术虽然能利用藻红蛋白和藻蓝蛋白的自发荧光进行快速计数，但在区分生态型和解析遗传多样性方面仍有不足。分子生物学技术，特别是实时荧光定量pcr技术和高通量测序，为准确识别超微蓝藻和对其进行定量提供了可能。这些技术能够直接从环境dna中捕获特定的遗传标记，从而克服超微藻类不可视的难题。
5、基于16s rrna基因的扩增子测序虽然能够反映群落的整体结构，但由于16s rrna基因具有高度保守性，这使得对超微蓝藻的精确定量难以实现。
6、目前，关于超微蓝藻的分子检测方法尚无报道。因此，开发一种简便、快捷、高灵敏度、高特异性的超微蓝藻定量检测方法十分必要。
技术实现思路
1、本发明通过对超微蓝藻细胞内的rbcl基因进行考察和分析，筛选出了位于基因核心区域的保守序列，并以此设计了特异性引物。这种基于功能基因设计的引物能够特异性扩增出超微蓝藻的序列，排除水体中硅藻、绿藻及其他异养细菌的干扰。
2、基于以上研究，本发明提供了一种检测超微蓝藻的试剂盒，包括序列分别如seqid no:1和2所示的一对引物。
3、在一个具体实施方案中，所述试剂盒为普通pcr试剂盒或实时荧光定量pcr试剂盒。
4、在一个具体实施方案中，所述超微蓝藻选自聚球藻属（
synechococcus）、原绿球藻属（
prochlorococcus）和双色藻属（
cyanobium）中的一种或多种组合。
5、本发明还提供了一种检测水样中超微蓝藻的方法，包括使用序列分别如seq idno:1和2所示的一对引物对待测水样进行扩增的步骤，当扩增出202 bp大小的片段时，则判定所述待测水样中含有超微蓝藻。
6、在一个具体实施方案中，所述超微蓝藻选自聚球藻属（
synechococcus）、原绿球藻属（
prochlorococcus）和双色藻属（
cyanobium）中的一种或多种组合。
7、在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：
8、s1：将所述待测水样进行膜过滤；
9、s2：将过滤后的待测水样的基因组dna作为模板，用所述引物进行pcr扩增；
10、s3：根据扩增结果进行判断。
11、在一个具体实施方案中，s1中，过滤所用的滤膜的孔径为0.22 μm。
12、在一个具体实施方案中，所述方法为pcr法，将pcr扩增产物进行电泳，根据202 bp处是否有特异性扩增条带进行判断。
13、在一个具体实施方案中，所述方法为实时荧光定量pcr法，s2包括以下步骤：
14、s21：提取待测水样的基因组dna作为模板，使用所述引物进行pcr扩增，反应完成后记录ct值；
15、s2：使用含有超微蓝藻rbcl基因目标片段的质粒标准品制作标准曲线;
16、s23：将所述待测水样的ct值代入所述标准曲线中，计算得到所述rbcl基因目标片段的拷贝数；
17、s24：根据所述拷贝数估算所述待测水样中超微蓝藻的细胞密度。
18、在一个具体实施方案中，s21中的cr扩增反应中地扩增程序如下:95℃预变性300s，然后进行40个扩增循环，每个扩增循环中95℃ 15 s，60℃30 s，72℃ 30 s。
19、与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
20、1）摆脱了对专业分类学技术人员和光学显微镜、流式细胞仪等大型仪器设备的依赖性，常规的水质分析员借助实时荧光定量pcr就可以实现对超微蓝藻这一特定类群的定量。
21、2）操作方法简单便捷，普通的水质检测人员在短时间内就可以掌握，且单位时间内可以检测更多的样品，效率大大提高。
22、3）特异性强，基于rbcl基因设计的特异性引物可排除水体中硅藻、绿藻及其他异养细菌的干扰。
23、4）数据准确客观，可比性强，有望成为国标检测方法。
24、通过本发明，可突破超微蓝藻定量检测依赖流式细胞仪等大型仪器设备的瓶颈，大大提高水体中超微蓝藻的检测效率，为水质安全管理和预警提供重要的技术手段。
1.一种检测超微蓝藻的试剂盒，其特征在于，包括序列分别如seq id no:1和2所示的一对引物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，为普通pcr试剂盒或实时荧光定量pcr试剂盒。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述超微蓝藻选自聚球藻属（synechococcus）、原绿球藻属（prochlorococcus）和双色藻属（cyanobium）中的一种或多种组合。
4.一种检测水样中超微蓝藻的方法，其特征在于，包括使用序列分别如seq id no:1和2所示的一对引物对待测水样进行扩增的步骤，当扩增出202 bp大小的片段时，则判定所述待测水样中含有超微蓝藻。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述超微蓝藻选自聚球藻属（synechococcus）、原绿球藻属（prochlorococcus）和双色藻属（cyanobium）中的一种或多种组合。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，s1中，过滤所用的滤膜的孔径为0.22 μm。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法为pcr法，将pcr扩增产物进行电泳，根据202 bp处是否有特异性扩增条带进行判断。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法为实时荧光定量pcr法，s2包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，s21中的cr扩增反应中地扩增程序如下:95℃预变性300 s，然后进行40个扩增循环，每个扩增循环中95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃30 s。