一种具有高密度表达效果的重组乳酸乳球菌

本发明属于基因工程和疫苗，具体涉及一种具有高密度表面展示效果的重组乳酸乳球菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、猪病毒性腹泻一直是困扰全球养猪业的重要疫病，其中由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, pedv）和猪传染性胃肠炎病毒（transmissiblegastroenteritis virus, tgev）引起的急性肠道感染给养猪生产造成了巨大的经济损失。这两种病原同属于冠状病毒科、α冠状病毒属，生物学特性和致病机制较为相似。它们主要感染新生仔猪的小肠绒毛上皮细胞，导致肠绒毛萎缩、吸收功能障碍，临床上表现为严重的水样腹泻、呕吐和脱水，两周龄以内仔猪的发病率与死亡率可高达80%-100%。尽管二者在病原学和临床表现上存在很多相似之处，但其流行病学特征和演变趋势却各具特点。

2、tgev的传统疫苗（包括灭活疫苗和弱毒疫苗）在研发策略与共性问题上与前述pedv疫苗相似。

3、s蛋白是tgev亚单位疫苗研究的核心靶点。xu成功构建了pczn1-tgev s1原核表达载体，通过大肠杆菌表达系统获得重组tgev s1蛋白，并将其与pedv s1蛋白组合后制备了单价、二价及混合型亚单位疫苗。小鼠免疫实验显示，所有疫苗均能诱导高水平特异性抗体。

4、基因工程活载体疫苗是以病毒或细菌为载体，插入tgev保护性抗原基因构建的重组活载体疫苗。这类疫苗结合了弱毒疫苗和亚单位疫苗的优点，能够在体内复制并递送抗原，诱导全面的免疫应答。yuan构建了表达tgev s蛋白a表位的重组猪痘病毒rspv-sa，小鼠免疫实验显示，rspv-sa可显著增强血清igg水平，并同时上调th1型和th2型细胞因子水平；新生仔猪被动免疫保护试验表明，rspv-sa可100%保护仔猪免受spv感染，且免疫组在整个实验期间未出现明显临床症状。mou利用枯草芽孢杆菌芽孢表面展示系统，构建表达tgev s蛋白的重组菌株b. subtilis cotgsg，该重组菌能够被肠道黏膜下树突状细胞捕获，诱导骨髓源性树突状细胞成熟、t细胞增殖及细胞因子分泌；口服免疫仔猪后，粪便中特异性siga抗体、血清中特异性igg抗体及中和抗体滴度均显著升高。宋子杰构建了表达tgev sln基因的重组l. lactis mg1363/pmg36e-sln，口服免疫新西兰大白兔后检测到血清特异性igg和小肠黏膜iga抗体升高，证实该重组菌能刺激机体产生体液免疫和黏膜免疫应答。

5、综上所述，tgev疫苗研究在传统疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗及基因工程活载体疫苗方面均取得了重要进展，但其面临的共性挑战与前述pedv疫苗相似。

技术实现思路

1、本发明提供了一种具有高密度表达效果的重组乳酸乳球菌，可表达猪流行性腹泻病毒（pedv）和猪传染性胃肠炎病毒（tgev）抗原蛋白的重组乳酸乳球菌和枯草芽孢杆菌工程菌株，从而弥补现有技术的不足。

2、本发明首先提供一种能用作抗原蛋白的融合多肽，为usp45-ca-cs-ltb；其氨基酸序列为seq id no:1;

3、mvtlpsfndhsfvnitvsasfgghsganliasdttinglssfcvdtrqftislfynvtnsygyvsksqdsncpftlqsvndylsfskfcvstsllasactidlfgypefgsgvkftslyfqftkgelitgtpkplrgvidvsfmtldvctkytiygfkgegiitltnssilagvyytsdsgqllafknvtsgavysvtpcsfseqaayvdddivgvisslssstfnstrelpgffyhsndgsnctepvlvysnigvcksgsigyvpsqsgqvkiaptvtgnisiptnfsmsiggggsggggsggggsnkvkcyvlftallsslcaygapqsitelcseyrntqiytindkilsytesmagkremviitfksgatfqvevpgsqhidsqkkaiermkdtlrityltetkidklcvwnnktpnsiaaismenhhhhh;

4、编码上述融合多肽的核酸片段，其一种具体的核苷酸序列为seq id no:2;

5、atggtgacactgccgagctttaacgatcatagctttgtgaacatcacagttagcgcgagctttggcggacatagcggcgccaatctgattgcgagcgatacgacgattaacggcctgagcagcttctgcgtcgatacgcgccagtttacgatttccctgttttataacgttacgaactcttatggctatgtgagcaaatcccaggatagcaactgcccgtttacgctccagtccgtgaacgattaccttagctttagcaaattctgcgtgagcacgagcttgctggcgtcagcatgcacgatcgacctttttggatacccggaattcggcagcggcgtcaaattcacatcactgtactttcagttcacaaaaggcgagctgatcacaggaacgccgaaaccgcttcgcggcgtaatcgacgttagctttatgacgctggatgtgtgcacgaaatatacaatctatggctttaaaggcgaaggtattattacactgactaactcgtccatcctggctggcgtctattacacaagcgatagcggacaactgctggcgtttaaaaacgtgacaagcggcgcggtctattctgtgacgccgtgcagctttagcgaacaagcggcctatgttgacgacgatattgttggcgtcattagcagcctgagcagctcaacatttaatagcacacgcgaattgccgggctttttctatcatagcaatgatggcagcaactgcacggaaccggttctggtctattccaatattggcgtttgcaagagcggctcaattggctatgttccgagccagtccggccaggtcaaaattgctccgacggtcacaggcaacatcagcatcccgacaaactttagcatgagcatcggcggcggcggatctggcggcggcggcagcggcggcggcggctcaaacaaagtgaaatgctatgtcctgtttacagctctgctgtcaagcctttgcgcctacggcgcgccgcagagcatcacagaactgtgctcagaatatcgcaacacacagatttatacgatcaatgataaaattcttagctacacggaaagcatggccggcaagcgcgaaatggtgattatcacatttaaaagcggcgccacatttcaggtggaagtgccgggctcccagcatatcgactcccagaaaaaagcgatcgaacggatgaaagatacgcttcgcatcacgtatcttacggaaacgaagatcgataaactgtgcgtgtggaataataaaacaccgaatagcattgcggcaattagcatggaaaaccatcatcatcatcatcactaa。

6、本发明还提供另一种能用作抗原蛋白的融合多肽，为usp45-ca-sln-ltb；其氨基酸序列为seq id no:3;

7、mtvsdssfssygempfgvtdgprycyggggsggggsggggsqflqqinayarpsevakeqrkrksrggggsggggsggggsgmkrsgygqpiastlsnitlpmqddntdvycirsdqfsvyvhstcksalwdnvfkrnctggggsggggsggggsnkvkcyvlftallsslcaygapqsitelcseyrntqiytindkilsytesmagkremviitfksgatfqvevpgsqhidsqkkaiermkdtlrityltetkidklcvwnnktpnsiaaismenhhhhhh；

8、编码上述融合多肽的核酸片段，其一种具体的核苷酸序列为seq id no:4;

9、atgacagtgagcgatagcagctttagctcatatggcgaaatgccgtttggcgttacagatggaccgcgctattgctatggcggcggaggcagcggaggcggcggcagcggcggaggcggatctcagtttctgcagcagattaatgcgtatgcgagaccgtctgaagtggccaaagaacagcgcaaacgcaaaagccggggaggcggcggaagcggcggcggcgggtcaggcggcggcggatcaggcatgaaacgcagcggctatggccagccgattgcgagcacgctgagcaatattacacttccgatgcaggacgacaacacagatgtctattgcatcagatcagatcaatttagcgtgtatgttcatagcacatgcaaaagcgcgctgtgggataacgtgtttaaacgtaattgcacgggcggcggcggctctggcggaggcggctcaggcggcggcggcagcaataaagtcaaatgctatgttctgtttacagcactgctgtcaagcctgtgcgcgtatggcgcaccgcaatcaattacagaactgtgcagcgaatatcgcaatacacaaatctatacaattaatgacaaaattctgagctatacagaatcaatggcgggcaaaagagaaatggtgattattacattcaaaagcggcgcgacatttcaagttgaagttccgggcagccagcatatcgatagccagaaaaaagcaattgaacgcatgaaagatacactgagaattacatatctgacagaaacaaaaattgataaactgtgcgtctggaacaataaaacaccgaatagcattgcagcaattagcatggaaaatcatcaccatcatcatcattaa。

10、本发明还提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体中分别插入有上述的编码融合多肽的核酸片段；

11、更进一步的，所述的重组表达载体为pmg36e载体；

12、本发明再一个方面还提供一种具有高密度表达效果的重组乳酸乳球菌，其中携带有上述的重组表达载体。

13、本发明还提供所述重组菌株在制备预防猪病毒性腹泻病的口服疫苗或免疫增强剂中的应用。

14、本发明采用usp45分泌信号肽、细胞壁锚定结构域（ca）及ltb黏膜佐剂构建融合表达系统，实现了pedv保护性抗原cs和tgev多表位抗原sln在乳酸乳球菌表面的高密度稳定展示，并构建了相应的枯草芽孢杆菌分泌表达系统，实现目的蛋白的高效分泌表达。western blot及免疫荧光结果表明，所构建的重组菌株能够稳定表达目的蛋白，乳酸乳球菌可实现菌体表面展示，枯草芽孢杆菌可实现胞外分泌表达，且连续传代20代后仍具有良好的遗传稳定性。由于融合了ltb黏膜佐剂，所构建的工程菌能够有效增强机体对pedv和tgev保护性抗原的特异性免疫应答，可作为猪病毒性腹泻口服疫苗或免疫增强剂，为pedv和tgev二联黏膜疫苗的研发提供了一种新的技术方案和候选菌株，具有良好的应用前景和产业化价值。