一种特异性呼吸道疾病多重核酸病原体和炎症程度检测的试纸条及其检测方法与流程

本发明涉及生物医学检测，具体为一种特异性呼吸道疾病多重核酸病原体和炎症程度检测的试纸条及其检测方法。

背景技术：

1、呼吸道感染是全球范围内发病率最高的感染性疾病之一，尤其在婴幼儿、老年人和免疫功能低下人群中危害严重。引起呼吸道感染的病原体种类繁多，包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒（rsv）、腺病毒、sars-cov-2、肺炎支原体等。不同病原体引发的临床症状（发热、咳嗽、咳痰等）高度相似，导致临床诊断极易混淆。然而，不同病原体对应的治疗方案截然不同（如抗病毒药用于流感，抗生素用于细菌感染，大环内酯类用于支原体感染）。

2、目前临床常用的检测方法主要存在以下三大核心问题：

3、第一，检测维度单一，无法同时评估感染严重程度。 现有核酸检测技术（如pcr、crispr）仅能回答“是否存在某种病原体感染”，但无法提供“感染有多严重”“宿主炎症反应水平如何”等关键信息。大量研究表明，呼吸道感染的临床结局不仅取决于病原体本身，更与宿主的炎症反应强度密切相关。过度的炎症反应（即“细胞因子风暴”）是导致重症流感、细菌性脓毒症患者多器官衰竭和死亡的关键机制。临床迫切需要一种能够同步输出病原种类和炎症标志物水平的检测工具，以辅助医生快速鉴别感染类型、判断病情严重程度并指导精准治疗。

4、第二，检测通量低，难以应对混合感染和快速分流需求。 传统单靶标核酸检测每次仅能检测一种病原体，检测效率低下。在流感高发季节，发热门诊需要快速筛查多种可能的病原体，单靶标方法无法满足快速分流患者的需求。虽有部分多重pcr产品，但通常需要复杂的仪器设备和较长的检测时间（2-4小时），不适合即时检测（poct）场景。

5、第三，缺乏对疾病进展的预测能力。 现有检测方法无法预警重症发生风险（如呼吸衰竭、脓毒症休克）。研究证实，血清中il-6、ip-10等炎症因子水平在重症患者中显著升高，可作为早期预警的生物标志物。目前临床上这些指标需要单独通过免疫学方法检测，与病原检测分离，增加了检测成本和操作复杂度。

6、尽管已有少数研究尝试将crispr技术与免疫层析相结合，但多停留在双靶标层面，且未能实现对病原体核酸和炎症蛋白标志物的同步、多重、快速检测。因此，开发一种能够同时检测多种呼吸道病原体核酸和多种炎症标志物，并可据此评估疾病严重程度的快速检测试纸条及方法，具有重要的临床价值和迫切的市场需求。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种特异性呼吸道疾病多重核酸病原体和炎症程度检测的试纸条及其检测方法，解决了现有技术中的试纸条及检测方法无法对病原体核酸和炎症蛋白标志物的同步、多重、快速检测的问题。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种特异性呼吸道疾病多重核酸病原体和炎症程度检测的试纸条，包括：

3、底板。

4、样品垫，所述样品垫搭接于所述底板，所述样品垫远离所述底板的一面依次搭接有结合垫、层析膜和吸收垫。

5、所述结合垫上负载有第一标记物和第二标记物，所述第一标记物偶联有能够与呼吸道病原体核酸扩增产物特异性结合的核酸探针或crispr-cas12a/crrna复合物，所述第二标记物偶联有能够与炎症标志物特异性结合的第一抗体。

6、所述层析膜上沿层析方向设置有检测线区和质控线区，所述检测线区包括至少一条病原体检测线和炎症标志物检测线。

7、所述病原体检测线上包被有捕获分子，所述捕获分子用于捕获所述第一标记物或由所述第一标记物切割产生的报告探针片段。

8、所述炎症标志物检测线上包被有第二抗体，所述第二抗体用于捕获所述第二标记物。

9、在一些实施例中，所述病原体检测线为多条，分别对应不同呼吸道病原体的核酸靶标，所述呼吸道病原体选自甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、sars-cov-2、肺炎支原体中的至少两种。

10、在一些实施例中，所述炎症标志物检测线为一条或多条，对应的炎症标志物选自saa、crp、il-6、ip-10、pct中的至少一种。

11、所述炎症标志物的信号强度与样本中炎症标志物浓度呈正相关。

12、在一些实施例中，所述第一标记物和所述第二标记物独立地选自胶体金颗粒、荧光微球、量子点或乳胶微球。

13、所述第一标记物与所述第二标记物的发射光谱不同，或所述病原体检测线与所述炎症标志物检测线在层析膜上空间分离。

14、在一些实施例中，所述核酸探针为针对呼吸道病原体保守基因设计的特异性crrna，所述crispr-cas12a/crrna复合物在靶标核酸存在时被激活，反式切割报告探针，所述报告探针连接在所述第一标记物上或独立标记。

15、在一些实施例中，所述质控线区设置有一条或多条质控线，所述质控线上包被有抗标签抗体或能够结合所述第一标记物和/或第二标记物上通用标记的分子。

16、一种特异性呼吸道疾病多重核酸病原体和炎症程度检测的试纸条检测方法，所述检测方法应用于检测所述的试纸条，所述检测方法包括以下步骤：

17、s1：采集患者咽拭子或血清样本，对样本进行预处理，获得核酸待检液和蛋白待检液。

18、s2：对核酸待检液进行多重pcr或等温扩增，得到扩增产物。

19、s3：将扩增产物与crispr-cas12a检测体系混合，激活cas12a的反式切割活性，切割报告探针，得到第一反应液。

20、s4：将蛋白待检液与第二标记物混合孵育，得到第二反应液。

21、s5：将第一反应液和第二反应液混合后加载至所述的试纸条的样品垫。

22、s6：进行侧流层析，在层析膜上形成多条检测线和质控线，读取各检测线的信号强度。

23、s7：根据病原体检测线的信号判定样本中存在的呼吸道病原体种类，根据炎症标志物检测线的信号强度定量或半定量分析炎症标志物浓度，结合预定的阈值划分疾病严重程度。

24、在一些实施例中，所述多重pcr为多重逆转录pcr，用于同时扩增2-6种呼吸道病原体的核酸片段；所述等温扩增为重组酶聚合酶扩增或环介导等温扩增。

25、在一些实施例中，步骤s7中疾病严重程度的划分方法包括：

26、当炎症标志物il-6的浓度≥第一阈值时判定为重症高风险。

27、当il-6浓度介于第二阈值与第一阈值之间时判定为中度感染。

28、当il-6浓度≤第二阈值时判定为轻度感染。

29、在一些实施例中，整个检测过程的总时长≤60分钟，所述试纸条的检测结果通过肉眼判读或通过侧流读数仪自动采集信号。

30、本发明提供一种特异性呼吸道疾病多重核酸病原体和炎症程度检测的试纸条及其检测方法，具备以下有益效果：

31、诊断维度创新：本发明首次将病原体核酸检测与炎症标志物免疫检测集成于同一试纸条平台，实现“病原鉴定+炎症程度评估”一体化输出。不仅告知临床医生患者感染了哪种病原体，还能同步提供炎症反应强度，辅助判断疾病严重程度（轻度、中度、重症高风险），克服了现有技术“只知病原、不知轻重”的缺陷。

32、多重检测能力：通过在层析膜上设置多条病原体检测线和多条炎症标志物检测线，结合crispr-cas12a的多重识别能力和多重pcr/等温扩增技术，本发明可同时检测2-6种常见呼吸道病原体及2-4种炎症标志物，显著提升了检测通量和临床决策效率。

33、快速便捷，适配poct场景：采用侧流层析试纸条形式，无需复杂仪器，总检测时长≤60分钟（优选≤40分钟）。可实现在门急诊、基层医疗机构甚至居家环境下的快速检测，结果可通过肉眼判读或便携式读数仪读取，操作简便，成本可控，有利于分级诊疗体系推广。

34、重症预警能力：通过定量或半定量检测il-6、crp、saa等炎症标志物，并结合预定的阈值划分疾病严重程度，可早期识别重症高风险患者，为临床及时干预（如收入icu、使用抗炎治疗）提供客观依据，改善患者预后。

35、避免非特异性干扰：本发明通过优化的crrna设计、核酸外切酶处理以及内参通道设置，显著降低了crispr多重检测中的非特异性切割和免疫层析中的交叉反应，保证了检测结果的特异性和重复性。