一种多层级代谢重构丁酸生产工程菌及其构建方法与应用与流程

本发明属于合成生物学、代谢工程及工业微生物，具体涉及一种基于大肠杆菌bw25113（t7）高效表达体系构建高产丁酸工程菌的方法，尤其涉及通过异源丁酸生物合成途径构建、多位点代谢工程改造及辅酶a供给优化获得高产丁酸工程菌株的方法，并涉及所述工程菌株在丁酸生物制造中的应用。

背景技术：

1、丁酸（

butyric acid）是一种重要的短链脂肪酸，也是重要的化工平台化合物，广泛应用于食品、饲料、香精香料、医药、精细化工及生物材料等领域。近年来，随着绿色制造和可持续发展理念的不断推进，利用可再生生物质生产丁酸逐渐成为研究热点。

2、目前，丁酸主要通过化学合成法和微生物发酵法生产。化学合成法具有工艺成熟、产率较高等优点，但通常依赖石油基原料，存在资源不可再生、能耗较高及环境污染等问题。相比之下，微生物发酵法以葡萄糖、甘油及木质纤维素水解液等可再生资源为原料，具有反应条件温和、环境友好及可持续发展的优势，因此受到广泛关注。

3、梭菌属微生物是天然丁酸生产菌，但其存在生长缓慢、遗传操作困难、易形成芽孢、发酵稳定性较差等问题，不利于工业化应用。大肠杆菌具有遗传背景清晰、生长速度快、遗传操作成熟及发酵工艺完善等优点，是目前应用最广泛的代谢工程底盘菌之一。然而，大肠杆菌天然不具备完整的丁酸生物合成途径，且胞内碳流主要流向乙酸、乳酸、乙醇及琥珀酸等副产物，同时辅酶a供给能力有限，丁酸外排过程亦会影响丁酸积累，因此丁酸产量较低，难以满足工业化生产需求。

4、近年来，已有研究通过引入异源丁酸合成途径、敲除竞争代谢途径、增强辅因子供给及优化发酵工艺等策略提高丁酸产量，但仍存在代谢通量分配不合理、副产物生成较多及生产效率较低等问题。因此，有必要构建一种能够高效利用葡萄糖生产丁酸的大肠杆菌工程菌株，以进一步提高丁酸生物合成效率，为丁酸绿色生物制造提供新的技术方案。

技术实现思路

1、针对现有技术中大肠杆菌生产丁酸存在异源表达效率较低、碳流竞争严重、副产物积累较多、辅酶a供给不足以及丁酸产量较低等问题，本发明提供了一种基于bw25113（t7）高效表达体系的多层级代谢重构丁酸生产工程菌及其构建方法。通过构建异源丁酸生物合成途径，并结合竞争代谢途径阻断、辅酶a供给强化及丁酸转运优化等策略，提高葡萄糖向丁酸合成途径的代谢通量，从而获得具有较高丁酸生产能力的大肠杆菌工程菌株。

2、为实现上述技术目的，本发明采用了以下技术方案：

3、本发明目的之一是提供一种多层级代谢重构丁酸生产工程菌，其以大肠杆菌bw25113（t7）为底盘菌株，所述底盘菌株中含有重组质粒pet-28a-tahcpb，所述重组质粒表达乙酰辅酶a乙酰转移酶、3-羟基丁酰辅酶a脱氢酶、巴豆酸酶、反式烯酰辅酶a还原酶、磷酸丁酰转移酶和丁酸激酶；所述底盘菌株中敲除了poxb、pta、acka、ldha、adhe基因以及frdabcd操纵子、mdtef操纵子；且所述底盘菌株中将泛酸激酶基因coaa替换为来源于金黄色葡萄球菌的泛酸激酶基因pank。

4、优选的，所述乙酰辅酶a乙酰转移酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述3-羟基丁酰辅酶a脱氢酶基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述巴豆酸酶基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述反式烯酰辅酶a还原酶基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述磷酸丁酰转移酶基因的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述丁酸激酶基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。

5、优选的，所述乙酰辅酶a乙酰转移酶和反式烯酰辅酶a还原酶由第一个t7启动子驱动表达，所述巴豆酸酶、3-羟基丁酰辅酶a脱氢酶、磷酸丁酰转移酶和丁酸激酶由第二个t7启动子驱动表达。

6、优选的，所述poxb的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述pta的核苷酸序列如seqid no.8所示，所述acka的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述ldha的核苷酸序列如seqid no.10所示，所述adhe的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述frdabcd操纵子的核苷酸序列如seq id no.12所示，所述mdtef操纵子的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述coaa的核苷酸序列如seq id no.14所示，所述pank的核苷酸序列如seq id no.15所示。

7、本发明目的之二是提供所述工程菌的构建方法，包括以下步骤：

8、（1）构建携带乙酰辅酶a乙酰转移酶基因、3-羟基丁酰辅酶a脱氢酶基因、巴豆酸酶基因、反式烯酰辅酶a还原酶基因、磷酸丁酰转移酶基因和丁酸激酶基因的重组表达质粒pet-28a-tahcpb；

9、（2）以大肠杆菌bw25113（t7）为底盘菌株，利用crispr-cas9系统依次敲除poxb、pta、acka、ldha、adhe基因以及frdabcd操纵子、mdtef操纵子，并将底盘菌株的泛酸激酶基因coaa替换为来源于金黄色葡萄球菌的泛酸激酶基因pank，获得基因组改造的底盘菌株；

10、（3）将步骤（1）所述重组表达质粒转化至步骤（2）所述基因组改造的底盘菌株中，获得所述工程菌。

11、优选的，步骤（1）中所述乙酰辅酶a乙酰转移酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述3-羟基丁酰辅酶a脱氢酶基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述巴豆酸酶基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述反式烯酰辅酶a还原酶基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述磷酸丁酰转移酶基因的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述丁酸激酶基因的核苷酸序列如seq id no.6所示。

12、优选的，步骤（2）中所述poxb的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述pta的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述acka的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述ldha的核苷酸序列如seq id no.10所示，所述adhe的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述frdabcd操纵子的核苷酸序列如seq id no.12所示，所述mdtef操纵子的核苷酸序列如seq id no.13所示，所述coaa的核苷酸序列如seq id no.14所示，所述pank的核苷酸序列如seq id no.15所示。

13、本发明目的之三是提供所述工程菌或根据所述方法构建的工程菌在发酵生产丁酸中的应用。

14、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

15、1）本发明以大肠杆菌bw25113（t7）为底盘菌株，异源表达了乙酰辅酶a乙酰转移酶（atob）、3-羟基丁酰辅酶a脱氢酶（hbd）、巴豆酸酶（crt）、反式烯酰辅酶a还原酶（ter）、磷酸丁酰转移酶（ptb）和丁酸激酶（buk）组成的丁酸生物合成途径，使大肠杆菌获得以葡萄糖为底物从头合成丁酸的能力。

16、（2）本发明通过敲除poxb、pta、acka、ldha、adhe基因以及frdabcd操纵子，有效阻断或削弱了乙酸、乳酸、乙醇及琥珀酸等副产物的竞争代谢途径，减少了碳流损失，提高了丁酸前体乙酰辅酶a的供给效率。

17、（3）本发明通过敲除mdtef操纵子，优化了丁酸在胞内的积累与代谢过程；同时将宿主菌泛酸激酶基因coaa替换为金黄色葡萄球菌来源的泛酸激酶基因pank，增强了辅酶a的生物合成能力，为丁酸合成途径提供了充足的辅酶a供给。

18、（4）在上述多层级代谢重构策略的协同作用下，本发明的工程菌株以葡萄糖为底物摇瓶发酵48 h，丁酸产量达到1643 mg/l，相比现有技术具有显著提升，具有良好的工业应用前景。