一种乳酸富集型细胞外囊泡及其制备方法与应用

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种乳酸富集型细胞外囊泡及其制备方法与应用。

背景技术：

1、细胞外囊泡（extracellular vesicles，evs）是细胞分泌的具有脂质双层膜结构的纳米级囊泡，广泛参与细胞间信息传递，在组织修复、免疫调节及疾病治疗中具有重要应用价值。近年来，来源于间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs）的evs由于具有良好的安全性和生物学活性，逐渐成为细胞治疗的重要替代策略。

2、近年来研究发现，evs的生物学功能不仅依赖于其蛋白质、脂质及核酸组成，其所携带的代谢物同样在调控受体细胞功能中发挥重要作用。其中，乳酸作为糖酵解的重要代谢终产物，已被证实能够调节免疫细胞代谢状态，影响t细胞活化、免疫耐受建立及炎症微环境重塑，因此，开发乳酸富集型功能性evs具有重要应用价值。

3、现有研究表明，三维聚集培养可通过增强细胞间相互作用、模拟体内微环境以及诱导一定程度的代谢重塑，提高mscs来源evs的分泌效率，并在部分情况下促进evs内乳酸等代谢物含量升高。

4、然而，现有三维聚集培养过程中，乳酸富集主要依赖于聚集体内部自然形成的低氧、营养梯度及代谢应激状态，该过程具有较强的随机性，容易受到聚集体尺寸、细胞密度、培养时间、局部氧浓度波动、不同批次细胞状态等因素的影响，从而导致evs内乳酸负载水平存在较大波动，进一步增加ev产品的异质性以及批次间差异，难以实现稳定、可重复的规模化生产。

5、目前，现有技术尚缺乏一种能够在三维聚集培养基础上进一步精准调控乳酸生成与ev负载效率的技术手段，以实现乳酸富集型evs的稳定制备。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种乳酸富集型细胞外囊泡及其制备方法与应用。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种乳酸富集型细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：

4、s1、使用去甲基乙二酰甘氨酸对细胞进行预处理，得到经去甲基乙二酰甘氨酸处理的细胞；

5、s2、将步骤s1所得经去甲基乙二酰甘氨酸处理的细胞通过悬浮培养12-36h，得到三维结构的细胞聚集体，离心，收集沉淀，得到乳酸富集型细胞外囊泡。

6、本发明通过去甲基乙二酰甘氨酸对细胞进行预处理结合悬浮培养，使细胞发生代谢重编程，提高细胞外囊泡的乳酸含量以及细胞外囊泡的数量，同时使细胞外囊泡保持天然生物学特性，无需长期添加外源炎症刺激或基因操作即可实现乳酸的积累，令制备工艺更稳定，具备良好的工业化放大潜力。

7、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s1中，所述去甲基乙二酰甘氨酸的终浓度为≥0.1mm。本发明通过实验发现当去甲基乙二酰甘氨酸的终浓度≥0.1mm时细胞外囊泡的乳酸积累较多，且随着去甲基乙二酰甘氨酸的浓度提高，细胞外囊泡的乳酸积累量也随之增高。

8、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s1中，所述去甲基乙二酰甘氨酸的终浓度为0.5-5mm。优选地，所述去甲基乙二酰甘氨酸的终浓度还可以为1.5mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm、5.0mm中的至少一种。

9、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s1中，所述去甲基乙二酰甘氨酸的终浓度为1-2mm。优选地，所述去甲基乙二酰甘氨酸的终浓度还可以为1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm中的至少一种。在优选浓度下，所获得的细胞外囊泡乳酸积累量更高。

10、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s1中，所述预处理的参数为在35-39℃下培养6-72h。

11、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s1中，所述预处理的参数为在35-39℃下培养12-48h。

12、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s1中，所述预处理的参数为在37℃下培养24h。

13、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s1中，所述细胞经去甲基乙二酰甘氨酸处理后，清洗1-3次，重新悬浮于培养基中。

14、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s1中，所述细胞为间充质干细胞。优选地，所述间充质干细胞来源于人、小鼠、大鼠、牛、羊、马和兔中至少一种。

15、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s2中，所述悬浮培养的时间为24h。

16、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s2中，所述悬浮培养为以超低黏附培养板和/或低黏附离心管作为培养容器进行悬浮培养。

17、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s2中，所述超低黏附培养板、低黏附离心管的表面接触角≥110°。

18、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s2中，所述超低黏附培养板、低黏附离心管表面涂覆有聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）。

19、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s2中，所述经去甲基乙二酰甘氨酸处理的细胞的接种密度为（1×104）-（5×105）cell/ml。

20、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s2中，所述经去甲基乙二酰甘氨酸处理的细胞的接种密度为（5×104）-（2×105）cell/ml。

21、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s2中，所述经去甲基乙二酰甘氨酸处理的细胞的接种密度为1×105cell/ml。

22、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤s2中，所述离心的具体操作为：

23、1）将所得三维结构的细胞聚集体及其培养液在700-900g下离心8-12min，收集得到上清液a；

24、2）将步骤1）所得上清液a在1800-2200g下离心8-12min，收集得到上清液b；

25、3）将步骤2）所得上清液b在15000-17000g下离心30min，收集得到沉淀a；

26、4）将步骤3）所得沉淀a重悬，按照步骤3）的操作离心2次，收集得到沉淀b，所得沉淀b即为乳酸富集型细胞外囊泡。

27、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤1）中，所述离心条件为在800g下离心10min。

28、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤2）中，所述离心条件为在2000g下离心10min。

29、作为本发明所述制备方法的优选实施方式，在步骤3）中，所述离心条件为在16000g下离心30min。

30、第二方面，本发明提供了一种乳酸富集型细胞外囊泡，主要通过上述制备方法制备得到。

31、第三方面，本发明提供了上述乳酸富集型细胞外囊泡在制备抗炎药物中的应用。

32、第四方面，本发明提供了上述乳酸富集型细胞外囊泡在制备免疫抑制剂中的应用。

33、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述抗炎药物为抗牙周炎药物。

34、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述抗炎药物或免疫抑制剂的剂型包括但不限于固体剂型、半固体剂型、液体剂型和气体剂型。

35、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述固体剂型包括但不限于散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸剂、丸剂、粉针剂、锭剂、胶剂、丹剂、茶剂、栓剂、膜剂、植入剂、舌下片、口腔贴片、咀嚼片、泡腾片、分散片、浸膏剂中的至少一种。

36、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述半固体剂型包括但不限于软膏剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、贴膏剂、煎膏剂中的至少一种。

37、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述液体剂型包括但不限于溶液剂、糖浆剂、合剂、口服溶液剂、口服混悬剂、口服乳剂、芳香水剂、醑剂、酊剂、流浸膏剂、酒剂、露剂、注射剂、外用溶液剂、洗剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、灌肠剂、含漱剂中的至少一种。

38、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述气体剂型包括但不限于气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、泡沫剂中的至少一种。

39、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述抗炎药物或免疫抑制剂中还包括药学上可接受的辅料。

40、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药学上可接受的辅料包括但不限于填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、包衣材料、溶剂、矫味剂、着色剂中的至少一种。

41、作为本发明所述应用的优选实施方式，述填充剂包括但不限于乳糖、微晶纤维素、淀粉、预胶化淀粉、糊精中的至少一种。

42、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述崩解剂包括但不限于交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚维酮、羧甲基淀粉钠、玉米淀粉中的至少一种。

43、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂富马酸钠、滑石粉中的至少一种。

44、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述粘合剂包括但不限于羟丙基甲基纤维素、聚维酮、淀粉浆、阿拉伯胶、明胶中的至少一种。

45、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述包衣材料包括但不限于乙基纤维素、羟丙甲纤维素、聚乙烯醇、丙烯酸树脂、羟丙基纤维素中的至少一种。

46、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述溶剂包括但不限于注射用水、乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇中的至少一种。

47、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述矫味剂包括但不限于甜菊糖苷、蔗糖、阿斯巴甜、三氯蔗糖、糖精钠中的至少一种。

48、作为本发明所述应用的优选实施方式，所述着色剂包括但不限于日落黄、柠檬黄、胭脂红、亮蓝、诱惑红中的至少一种。

49、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

50、本发明通过去甲基乙二酰甘氨酸对细胞进行预处理结合悬浮培养，使细胞发生代谢重编程，提高细胞外囊泡的乳酸含量以及细胞外囊泡的数量，同时使细胞外囊泡保持天然生物学特性，无需长期添加外源炎症刺激或基因操作即可实现乳酸的积累，令制备工艺更稳定，具备良好的工业化放大潜力。