一种用于阻止变形杆菌弥漫性生长的培养基及其制备方法与流程

本发明涉及生物，尤其涉及a01g18/20领域，更具体地涉及一种用于阻止变形杆菌弥漫性生长的培养基及其制备方法。

背景技术：

1、变形杆菌是一类广泛存在于自然界中的革兰氏阴性杆菌，它们具有多种形态，包括球形、杆状以及丝状等，因此得名“变形杆菌”。变形杆菌常见于土壤、水、腐败有机物以及人和动物的肠道内；变形杆菌一般不致病，但在特定条件下，如高温、食物被污染且未彻底加热等可能会引起食物中毒。在临床上，变形杆菌主要包括普通变形杆菌和奇异变形杆菌；此外莫尔根氏变形杆菌、雷极氏变形杆菌、无恒变形杆菌等菌种虽然也属于变形杆菌属，但是临床上较为少见。

2、普通变形杆菌和奇异变形杆菌在琼脂粉平板上具有生长迁徙的现象是其生物特性之一。在临床检验中，变形杆菌的弥漫性生长会导致其他菌种分离难度加大，如何有效的精确抑制变形杆菌的迁徙，并且对其他的菌种生长不会造成明显的影响，这是一个亟需解决的行业性技术难题。文献：一种抑制变形杆菌迁徙生长的一种培养方法，公开了一种抑菌培养基，原料包括蛋白胨、琼脂粉、氯化钠以及水，但是其对于菌种没有体现出抑制迁徙菌种的特异性。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于阻止变形杆菌弥漫性生长的培养基及其制备方法。

2、本发明第一方面提供了一种用于阻止变形杆菌弥漫性生长的培养基，其原料包括：特殊蛋白胨、胰蛋白胨、无机盐、淀粉、琼脂粉、动物血液、抑菌剂、水。

3、优选的，所述的特殊蛋白胨在培养基中的质量浓度为15-20g/l。

4、优选的，所述的胰蛋白胨在培养基中的质量浓度为5-10g/l。

5、胰蛋白胨和特殊蛋白胨二者均富含维生素和生长因子，能够满足微生物生长所需的氮源和营养物质，促进了微生物的生长和代谢。此外胰蛋白胨和特殊蛋白胨还可以作为凝固剂，可以起到固态培养基的作用。

6、优选的，所述的无机盐包括：nacl、kcl、mgcl2、kh2po4、mgso4、feso4中的一种。

7、进一步优选的，所述的无机盐为nacl。

8、更优选的，所述的nacl在培养基中的质量浓度为5-10g/l。

9、适量的氯化钠对于保持微生物细胞的正常生长和功能是必要的，‌这是因为钠离子与维持细胞渗透压有关，‌因此在培养基中常加入少量的钠盐氯化钠，‌另外本发明人发现，适量的氯化钠在本培养基中还可特异性抑制变形杆菌的弥漫性生长。

10、优选的，所述的淀粉包括：玉米淀粉、红薯淀粉、土豆淀粉、小麦淀粉、绿豆淀粉、木薯淀粉、豌豆淀粉中的一种。

11、进一步优选的，所述的淀粉为玉米淀粉。

12、玉米淀粉是培养基中的碳源，为微生物的生长和代谢提供必要的能量；玉米淀粉可以被微生物酶解成单糖，进而通过糖解作用、柠檬酸循环和氧化磷酸化等过程释放能量，支持微生物的生长和繁殖。

13、优选的，所述的琼脂粉在培养基中的质量浓度为10-40g/l。

14、进一步优选的，所述的琼脂粉在培养基中的质量浓度为15-40g/l。

15、更优选的，所述的琼脂粉在培养基中的质量浓度为30-40g/l。

16、本发明人在实际研究中发现，琼脂粉的含量对于变形杆菌的迁徙有较大的影响，琼脂粉含量过低时，培养基可能呈现半液体状态，这会影响培养基的稳定性，由于培养基的流动性增加，变形杆菌可能无法形成稳定的菌落形态，而且变形杆菌具有活泼的运动性和多形性，在琼脂粉含量过低的培养基上更容易发生扩散生长，促进菌种的迁徙和生长。另外琼脂粉作为培养基的一部分，不仅提供物理支撑，还参与营养元素的交换。当琼脂粉含量过低时，营养元素的流动性可能增加，但也可能导致营养物质的分布不均匀，影响变形杆菌对营养的吸收和利用。当琼脂粉含量过高会导致培养基的硬度增大，影响菌落的形态和生长特性。变形杆菌在过硬的培养基上可能无法形成正常的菌落形态，菌落生长受到抑制，但是对于其他的非变形杆菌菌种也会有一定明显的抑制效果，培养基的特异抑制性会受到一定的影响，因此本发明最优选的琼脂粉的质量浓度为30-40g/l。

17、优选的，所述的动物血液包括羊血和/或马血。

18、动物血液中含有水、无机盐、维生素、糖类、脂肪、氨基酸等，能够为体外培养的微生物提供必要的营养。尽管这些营养物质的含量在动物血液中含量相对较少，但它们对于微生物的生长和代谢至关重要。

19、优选的，所述的抑菌剂包括：有机醇、无机化合物、植物提取物、生物酶。

20、进一步优选的，所述的有机醇包括：戊二醇、己二醇、乙醇、辛二醇、癸二醇中的一种。

21、更优选的，所述的有机醇为乙醇。

22、乙醇作为一种有机溶剂，能够渗透细菌细胞膜，影响细胞膜的完整性和通透性，从而干扰细菌的正常生理功能。对于变形杆菌而言，乙醇可通过破坏其细胞膜结构，抑制其运动能力，进而阻止其迁徙生长；此外乙醇能影响变形杆菌对营养物质的吸收和利用，干扰其代谢过程。当细菌处于不利环境时，如乙醇浓度较高的培养基中，其生长和繁殖能力会受到抑制，迁徙生长现象也会相应减弱或消失；但是乙醇由于易挥发，因此本发明中乙醇在培养基中的体积含量为3-5%。

23、优选的，所述的无机化合物包括：hg2+盐、 cd盐、 cu2+盐、 zn2+盐、叠氮盐中的一种。

24、进一步优选的，所述的无机化合物为叠氮盐，作为一种可实施的案例，所述的叠氮盐为nan3。

25、叠氮化钠在特定条件下可以生成具有细胞毒性的叠氮酸（hn3），这种物质能够穿过细胞膜并对细胞内的生物分子产生破坏作用；由于变形杆菌具有迁徙生长的特性，即在某些培养基上能够形成迁徙性菌落，而叠氮化钠的加入可能会干扰其迁徙过程中的信号传导、细胞运动或能量代谢等关键环节，从而抑制其迁徙生长；但是叠氮化钠对于非变形杆菌的菌种也均有一定的抑制性，特异抑制性相对较差。

26、优选的，所述的植物提取物包括：马齿苋（portulaca oleracea）提取物、牛至（origanum vulgare）提取物、无患子皂苷(soapnut saponin)中的一种。

27、进一步优选的，所述的植物提取物为无患子皂苷。

28、无患子皂苷对变形杆菌有一定的抑制作用，无患子皂苷可破坏细菌细胞壁、细胞膜，以及干扰细菌的正常代谢过程；并且无患子皂苷能够渗透进入细菌细胞内，与变形杆菌细胞壁上的受体结合，干扰细胞壁的合成和稳定性，从而抑制其迁徙能力。

29、优选的，所述的生物酶包括：溶菌酶、葡萄糖氧化酶、纤维素酶、抗菌肽中的一种或多种。

30、进一步优选的，所述的生物酶为溶菌酶。

31、变形杆菌作为革兰氏阴性菌，其细胞壁虽然与革兰氏阳性菌有所不同，但同样含有肽聚糖等关键成分。溶菌酶能够有效地水解这些成分，特别是肽聚糖中的β-1,4糖苷键，这是细菌细胞壁的主要结构支撑；当溶菌酶作用于变形杆菌时，它会特异性地识别并水解细胞壁上的这些关键化学键，导致细胞壁结构破坏，由于细胞内外存在浓度差，水分会大量涌入细胞内部，导致细菌膨胀并最终破裂从而起到抑菌的作用。

32、更进一步优选的，所述的抑菌剂包括乙醇、无患子皂苷、溶菌酶；其中无患子皂苷在培养基中的质量浓度为1-5g/l；溶菌酶在培养基中的质量浓度为1-3g/l。

33、本发明第二方面提供了一种用于阻止变形杆菌弥漫性生长的培养基的制备方法，包括：

34、s1、将特殊蛋白胨、胰蛋白胨、无机盐、淀粉、琼脂粉、动物血液、抑菌剂、水加入到烧瓶中；

35、s2、将烧瓶置于高压灭菌锅中，高温灭菌；

36、s3、将培养基冷却，加入动物血液并搅拌均匀；

37、s4、立即将搅拌均匀的培养基分装倒入培养皿中冷却凝固，即得。

38、优选的，所述的s2步骤中高温灭菌的温度为110-140℃，高温灭菌的时间为10-30min。

39、优选的，所述的s3步骤中冷却温度为50-75℃ 。

40、有益效果

41、（一）本发明所提供的培养基对于变形杆菌的弥漫性生长有很好的抑制性能，相较于其他常见的培养基有更好的抑菌作用。

42、（二）本发明提供的培养基对于其他的非变形杆菌菌种的抑制作用不明显，可以实现特定混合菌种的定向筛选。

43、（三）本发明优选的琼脂粉的浓度为10-40g/l，琼脂粉含量过低时，变形杆菌可能无法形成稳定的菌落形态，而且变形杆菌具有活泼的运动性和多形性，在琼脂粉含量过低的培养基上更容易发生扩散生长，促进菌种的迁徙和生长；琼脂粉含量过高会导致培养基的硬度增大，这会影响菌落的形态和生长特性。变形杆菌在过硬的培养基上可能无法形成正常的菌落形态，或者菌落生长受到抑制，但是对于其他的非变形杆菌菌种的菌种也会有一定明显的抑制效果，培养基的特异抑制性会受到一定的影响。

44、（四）本发明优选特定的抑菌剂，包括乙醇、无患子皂苷、溶菌酶，可以有效地抑制变形杆菌的迁徙。

45、（五）本发明中培养基的原料来源较广、成本较低，并且制备方法较为简单，变形杆菌抑菌效果优异，有望实现规模级量产，预计能产生可观的市场收益。