一种来源于显齿蛇葡萄的细胞外囊泡及其制备方法和应用

本发明属于生物医学，尤其涉及一种来源于显齿蛇葡萄的细胞外囊泡及其制备方法和应用。

背景技术：

1、炎症性肠病（ibd）是一组慢性复发性胃肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎（uc）和克罗恩病（cd）两类，其特征为肠道黏膜免疫失衡和持续性炎症反应。研究表明，在ibd的发病机制中致病性th17细胞过度活化、调节性t细胞（treg）功能不足，从而导致treg/th17细胞平衡失调，是诱发肠道免疫紊乱的关键因素。其中，转录因子stat3在th17细胞的分化及炎症反应中起核心作用：异常激活的stat3信号可促进th17细胞介导的炎症反应，并与ibd等多种疾病的发生密切相关。现有临床治疗ibd的药物（如氨基水杨酸制剂、激素、免疫抑制剂和生物制剂等）主要通过抑制炎症通路来缓解症状，但存在疗效有限、副作用较大或患者依从性差等问题，尚难以从根本上重建肠道免疫稳态。尤其是在调节treg/th17平衡环节方面，当前缺乏安全高效的治疗手段。因而，亟需一种新的治疗策略，能够靶向调节肠道免疫失衡，改善ibd患者的炎症状态。

2、显齿蛇葡萄（藤茶制作原料）是一种传统中草药和天然饮品，以富含二氢杨梅素等黄酮类成分闻名，具有抗氧化、抗炎和保肝等多种药理活性。然而，黄酮类化合物存在溶解性差、生物利用度低（文献报道口服生物利用度通常<5%）及易受酸碱、酶解破坏等局限。文献1（“systems pharmacology approach reveals the antiinflammatory effects ofampelopsis grossedentata on dextran sodium sulfate-induced colitis”，you-lanchen，等，world journal of gastroenterology，第24卷，第13期，第1398-1409页，公开日为2018-04-07）公开了从中药系统药理学数据库（tcmsp）中共筛选得到4个显齿蛇葡萄候选活性成分，分别为二氢杨梅素、杨梅素、槲皮素及花旗松素。上述4种成分均具有显著抗炎活性，且可能在溃疡性结肠炎的改善过程中发挥关键作用。该研究构建dss诱导的实验性结肠炎模型以验证药效，结果表明显齿蛇葡萄（amp）可显著改善模型小鼠整体状态及组织病理学损伤。后续基于藤茶潜在靶点网络与溃疡性结肠炎疾病靶点网络，构建蛋白质互作（ppi）网络并进行功能分析。富集分析得到一系列生物学过程与信号通路，其中多数与炎症反应密切相关：包括核酸代谢过程、大分子代谢过程正向调控、应激反应正向调控、天然免疫应答调控；同时涉及tnf-α信号通路、rankl/rank（nf-κb受体活化因子）信号通路、抑瘤素m通路、rac1/pak1/p38/mmp-2通路及mapk/nf-κb信号通路等常规炎症通路。但是该文献利用显齿蛇葡萄改善模型小鼠组织病理学损伤采用的显齿蛇葡萄的游离小分子粗提物，其有效成分的形式为游离小分子混合物（二氢杨梅素、杨梅素等黄酮类），其中含有的其它组分（例如核酸）的含量微乎其微，属于症状缓解型抗炎，主要通过抑制炎症通路来缓解溃疡性结肠炎患者的炎症状况，但存在疗效有限、副作用较大或患者依从性差等问题，尚难以从根本上重建肠道免疫稳态。对于溃疡性结肠炎患者来说，单纯改善炎症状况远远不够，还需从调节患者肠道免疫失衡方面着手，重建免疫耐受和平衡，与改善炎症双管齐下，从而起到更好的治疗效果。因此，如何更高效利用显齿蛇葡萄起到对溃疡性结肠炎更好的治疗效果至关重要。

3、文献2（中草药囊泡研究与应用专家共识（2023年版），中草药，第55卷，第1期，第12-22页，2024-01-31）公开了中草药细胞外囊泡蕴含了中草药中绝大部分的活性成分，是中草药有效成分浓缩的精华。该文献虽然公开了中草药囊泡的概念，但未涉及显齿蛇葡萄来源的囊泡以及制作方法和由不同制作方法带来的成分差异，未涉及特定mirna（如mir-6300）的富集以及功能验证。

4、专利1（cn117821363a，公开日2024-04-05）公开了一种莓茶外泌体的制备方法，其采用的是机械粉碎、peg沉淀及五层蔗糖梯度离心获得莓茶外泌体，其制备的囊泡mir-6300富集度低（仅约2倍），且未对mirna功能进行任何研究。

5、专利2（cn121926851a，公开日2026-04-28）公开了一种基于显齿蛇葡萄不同部位的同源纳米包裹系统及其在化妆品中的应用。该方案以显齿蛇葡萄嫩叶为原料，通过清洗、匀浆、差速离心（1000~3000g→5000~8000g→8000~12000g→100000~150000g）制备纳米囊泡，并将其与成熟茎叶提取物-环糊精包合物混合后，经微射流高压均质（10000~30000psi）和冷冻干燥，得到显齿蛇葡萄同源纳米包裹物，用于化妆品的抗炎、抗氧化、促皮肤渗透和修护。专利2与本发明存在本质区别：

6、（1）制备原理不同：专利2采用机械匀浆+微射流高压均质，无酶解处理，无密度梯度纯化，所得为粒径不均的粗制囊泡混合物（粒径30-200 nm，pdi未优化），而非本发明通过果胶酶解离+差速→超速→三层梯度串联工艺获得的高纯度囊泡（粒径100-200 nm，pdi<0.2）。微射流高压均质产生的剪切力与空化效应会破坏囊泡膜结构，导致内部mirna泄漏和降解，不可能实现mir-6300的特异性富集，完全无法用于医药级mirna递送；

7、（2）核心成分不同：专利2仅关注二氢杨梅素、黄酮苷等小分子活性成分，未涉及、未检测、未利用囊泡中的mirna成分（如mir-6300），更未揭示mir-6300的富集规律和功能，也未提及任何mirna、treg/th17、sestrin 3或免疫重编程相关术语；

8、（3）技术领域与用途不同：专利2仅限于化妆品原料（皮肤外用），其作用机制为简单的抗氧化（ros清除）和炎症因子抑制（il-8），属于症状缓解型；而本发明属于医药领域（口服治疗溃疡性结肠炎），其作用机制为mir-6300介导的免疫重编程（treg/th17平衡重建），属于疾病修饰型。

9、从专利2可知，即使商业公司已从化妆品角度制备了显齿蛇葡萄囊泡，也完全未意识到其mirna cargo的医药价值，更未将其与肠道免疫稳态重建相关联。这种从"化妆品外用包裹物"到"口服疾病修饰型免疫治疗剂"的范式跃迁，需要大量的创造性劳动才能实现。

10、近年来，源自天然产物的细胞外囊泡（又称外泌体样纳米囊泡）作为新型生物递送载体受到广泛关注。植物来源的细胞外囊泡因可口服、低毒性且具有跨物种调节基因表达的潜力，被视为治疗肠道疾病的有前景工具。然而，目前公开的植物来源囊泡主要聚焦于姜、葡萄等常见作物，对于显齿蛇葡萄来源的细胞外囊泡在ibd中的应用研究仍较为缺乏。现有技术尚未见关于显齿蛇葡萄来源的细胞外囊泡通过mir-6300/sesn3轴实现treg/th17平衡重建，用于治疗ibd的公开报道，在本领域中仍存在利用显齿蛇葡萄来源的细胞外囊泡靶向调节肠道免疫的技术空白。而显齿蛇葡萄来源的细胞外囊泡其天然脂质膜结构可高效包封并保护黄酮类活性成分，通过粒径均一化（100-200 nm）实现靶向递送与生物屏障穿透能力。因此，发明人针对如何制备来源于显齿蛇葡萄的细胞外囊泡，从而对溃疡性结肠炎起到更好的治疗效果进行了研究。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种来源于显齿蛇葡萄的细胞外囊泡及其制备方法和应用，旨在解决现有技术中缺乏有效手段调节肠道免疫失衡（treg/th17失衡、stat3通路过度激活）的问题，提供一种安全、高效且可口服给药的生物治疗方案。本发明采用特定的"果胶酶解离+差速→超速→三层梯度"串联工艺制备显齿蛇葡萄囊泡，能够特异性富集mir-6300（富集度达源植物叶片的5倍以上，优选8±2倍），且该mir-6300通过靶向sesn3调控mtor/氧化应激通路，从根本上纠正treg/th17免疫失衡，实现疾病修饰型治疗。本发明细胞外囊泡的作用在于：一是调节免疫平衡，利用显齿蛇葡萄囊泡携带的mir-6300等作用于t细胞亚群，促进treg细胞功能恢复、抑制异常th17细胞反应，从而重建treg/ th17平衡；二是抑制炎症信号，通过囊泡内源性黄酮成分干预il-6/stat3等关键通路，降低黏膜炎症水平；三是改善疾病症状，在动物模型中减轻结肠组织损伤和炎症，提高机体对肠道菌群失调的耐受性。最终，实现对溃疡性结肠炎的有效防治。

2、为了实现上述目的，本技术采用了如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种来源于显齿蛇葡萄的细胞外囊泡，所述细胞外囊泡由显齿蛇葡萄茎叶经匀浆、果胶酶解离处理、差速离心、超速离心及密度梯度离心分离纯化获得，在透射电镜下呈双层膜囊泡形态；所述细胞外囊泡特异性富集mir-6300，且mir-6300的相对丰度为源植物叶片中的5倍以上。

4、在以上技术方案中，所述细胞外囊泡还富集mir-159家族和/或mir-166家族。

5、在以上技术方案中，所述细胞外囊泡还包括天然小分子化合物，所述天然小分子至少包含黄芩素、山奈酚、咖啡酸。

6、在以上技术方案中，所述细胞外囊泡的粒径主要分布于100～200 nm。

7、第二方面，本发明提供了上述细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：

8、步骤（1），取显齿蛇葡萄茎叶，清洗后剪碎或研磨，并于低温缓冲液中匀浆，得到匀浆液；

9、步骤（2），将步骤（1）所得所述匀浆液采用果胶酶缓冲液进行解离处理后，进行差速离心以去除组织碎片和大颗粒杂质，收集上清液；

10、步骤（3），将步骤（2）所得所述上清液进行超速离心，收集沉淀并重悬，得到囊泡粗提液；

11、步骤（4），将步骤（3）所得所述囊泡粗提液进行密度梯度离心，收集囊泡层，洗涤后得到所述细胞外囊泡。

12、在以上技术方案中，步骤（1）中，所述匀浆在冰浴条件下进行。

13、在以上技术方案中，步骤（2）中，所述果胶酶缓冲液的解离处理为在4℃下以0.5%～2%（w/v）果胶酶缓冲液处理1～3 h。

14、在以上技术方案中，所述差速离心在4℃下依次包括5000 g离心10 min和12000 g离心20 min；所述超速离心为100000 g离心70 min；所述密度梯度离心采用30%/45%/60%蔗糖密度梯度介质，在120000 g条件下离心2 h，离心后吸取界面处囊泡层，并用pbs洗涤以去除蔗糖。

15、第三方面，本发明提供了上述细胞外囊泡或采用上述制备方法制备得到的细胞外囊泡在制备预防或治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。

16、在以上技术方案中，所述细胞外囊泡通过调节treg/th17细胞平衡和/或抑制sestrin 3信号通路发挥治疗作用。

17、本发明的有益效果在于：本发明显齿蛇葡萄来源的细胞外囊泡在治疗溃疡性结肠炎方面表现出显著的效果。一方面，其能够有效减轻肠道炎症反应，降低促炎因子水平和组织病理损伤；另一方面，能够重建免疫耐受和平衡，恢复调节性t细胞与致炎性th17细胞的动态平衡，从根本上改善疾病状态。这种作用机制新颖独特，与传统抗炎药物主要直接抑制炎症介质的方式不同，它通过核酸介导的免疫重编程实现长效调节，具有潜在的疾病修复和缓解复发的优势。同时，本发明细胞外囊泡来源于食用植物，安全性高且制备成本低廉，易于患者接受和长期使用。由于囊泡稳定包裹mirna等活性物质，使其在胃肠道中不易被消化酶降解，生物利用度高。

18、本发明的显齿蛇葡萄细胞外囊泡有望发展为一种全新的溃疡性结肠炎防治策略，不仅可以单独作为功能性制剂使用，也可与现有治疗手段（如5- asa、益生菌等）联合，提高综合疗效。其良好的可重复性和明确的作用机理，为后续临床转化奠定了基础。