与三色堇花瓣纯色与花斑性状相关的InDel分子标记及应用

本发明涉及植物分子生物学，尤其涉及与三色堇花瓣纯色与花斑性状相关的indel分子标记及应用。

背景技术：

1、三色堇（

viola ×

wittrockiana gams）又名蝴蝶花、猫儿脸，为堇菜科堇菜属多年生草本观赏花卉，具有花色丰富、花型多变、花期较长、适应性强等优良特性，是全球花坛、花境、盆栽及园林绿化的核心花卉品种，兼具极高的园艺观赏价值与市场经济价值；花瓣性状是决定三色堇观赏品质与商品等级的核心指标，其中纯色花瓣与花斑花瓣是其最具代表性的两大性状分化类型；三色堇花斑花瓣起源于18世纪初，英国园艺师williamthompson通过将

v. tricolor、

v. lutea、

v. altacia进行种间杂交，从中选育出花瓣中下方出现大的色斑（即“猫脸”）的新园艺杂交种

v. ×

wittrockiana，备受消费者青睐；而纯净色的

v. ×

wittrockiana品种起源于20世纪初，苏格兰的charles stewart最先选育得到；纯色三色堇花色均匀、素雅规整，适用于规整式园林造景；花斑三色堇花瓣带有特异性色斑、条纹纹理，造型独特、观赏性更强，市场溢价空间更高，二者的精准选育是三色堇新品种培育、性状改良、定向配种的核心研究方向。

2、现有研究表明，三色堇花瓣花斑与纯色性状为典型的质量性状，目前学界已初步探明花青素合成通路关键基因、myb家族转录因子等参与花瓣花斑形成过程，花斑区域与非花斑区域的色素合成关键基因差异表达，是导致花瓣性状分化的重要分子基础，但尚未定位到可稳定区分纯色与花斑性状的核心功能变异位点；当前三色堇纯色、花斑品种的选育工作仍以传统表型选育为主，依赖植株盛花期的花瓣表型直观观测，需经历播种、育苗、成株、开花全生育周期，育种周期长、人力物力成本高等问题；此外，由于纯色与花斑性状遗传背景复杂，传统杂交育种难以实现性状的定向纯合选育，多代选育后仍易出现性状分离，育种效率极低，严重制约了三色堇优质纯色、特异花斑新品种的规模化、标准化培育进程。

3、分子标记辅助育种可摆脱环境与生育期限制，在苗期即可完成目标性状基因型的精准鉴定，大幅提升育种效率与精准度，已成为花卉性状定向选育的核心技术手段；indel（插入/缺失）分子标记是基于基因组片段插入、缺失变异开发的功能性分子标记，具有基因组分布广泛、多态性高、分型稳定、检测快速、成本低廉、特异性强等优势，且变异位点多直接关联基因功能差异，更适用于作物目标性状的基因型鉴定与辅助选育；现阶段，国内外针对三色堇花瓣纯色与花斑性状的特异性indel分子标记开发仍处于空白状态，尚无可稳定、精准区分三色堇纯色、花斑基因型的功能性indel标记，无法实现该两大核心性状的苗期分子辅助筛选，导致三色堇花斑与纯色性状的定向育种缺乏高效、精准的分子技术支撑，极大限制了三色堇优质新品种的育种迭代效率与品种改良精度。因此，开发一种与三色堇花瓣纯色、花斑性状紧密连锁的indel分子标记，并建立配套的快速检测与育种应用体系，对突破传统育种瓶颈、实现三色堇目标性状精准定向选育、缩短育种周期、培育优质特色三色堇新品种具有重要的理论研究价值与实际应用意义。

技术实现思路

1、为了解决上述技术难题，本发明提供了一种与三色堇花瓣纯色与花斑性状相关的indel分子标记，其为seq id no.1所示的核苷酸序列的第47位存在aatttccatgtattttaccttgtt或a多态性；当indel位点的基因型为aatttccatgtattttaccttgtt, aatttccatgtattttaccttgtt时，表型为花瓣花斑；当indel位点的基因型为aatttccatgtattttaccttgtt, a时，表型为花瓣纯色。

2、seq id no.1：

3、tcgagggcgagcatcgtttaagtgtggggatttctgattgaagcgtaatttccatgtattttaccttgttatttccatgatttactaggtaaagtacaagatatttcatcatttccctacatttttgtaggtttgtcctgacgaagcatattcggtcaaagttgaccacgcagggaggcaaggttgacggaagagcggag；

4、进一步，本发明提供了扩增所述indel分子标记的引物。

5、优选地，所述引物为seq id no.2和seq id no.3所示。

6、seq id no.2（上游引物f，5’到3’方向）：tcgagggcgagcatcgttta；

7、seq id no.3（下游引物r，5’到3’方向）：ctccgctcttccgtcaacct。

8、进一步，本发明提供了所述的indel分子标记、所述的引物在以下至少一方面中的应用：

9、（1）鉴定三色堇花瓣纯色与花斑性状；

10、（2）三色堇花瓣纯色与花斑性状相关的分子标记辅助育种；

11、（3）开发鉴定三色堇花斑与无斑纯色性状的dna分子标记。

12、进一步，本发明提供了一种鉴定三色堇花瓣纯色与花瓣花斑的方法，包括：检测所述indel分子标记的基因型，当indel位点的基因型为aatttccatgtattttaccttgtt,aatttccatgtattttaccttgtt时，表型为花斑；当indel位点的基因型为aatttccatgtattttaccttgtt, a时，表型为花瓣纯色。

13、优选地，以待测三色堇的基因组dna为模板，用seq id no.2和seq idno.3所示的引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

14、优选地，所述pcr扩增产物的大小为200 bp和177 bp。

15、优选地，将所述pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判断待测三色堇为花瓣纯色与花斑；

16、判断方法如下：

17、若pcr产物仅包含200 bp主条带，则待测三色堇为花斑品种；若pcr产物包含200bp和177 bp两条主条带，则待测三色堇为花瓣纯色品种。

18、优选地，所述pcr扩增的反应程序包括：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸15 s，35个循环；72℃终延伸10 min。

19、优选地，所述pcr扩增的反应体系包括：dna模板液5μl、2×taq mix 17.5μl、正向引物和反向引物各1μl，浓度为10μm/l，用10.5μl ddh2o将总体积补齐至35μl。

20、优选地，所述琼脂糖凝胶电泳采用2.5%琼脂糖凝胶。

21、本发明取得的有益效果是：

22、本发明提供了一种与三色堇花瓣纯色与花斑性状相关的indel分子标记，该分子标记同时与三色堇花瓣纯色与花斑性状紧密连锁，利用该分子标记能够在早期鉴定三色堇花瓣纯色与花斑性状，可在三色堇幼苗期快速、准确、高效地鉴定花瓣纯色与花瓣花斑三色堇资源，用于辅助育种时能够缩短对高品质三色堇的筛选周期，减少育种工作量，具有广阔的应用前景。