与绿壳蛋鸡蛋壳胆绿素含量相关的SNP标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学，具体地说，涉及与绿壳蛋鸡蛋壳胆绿素含量相关的snp标记及其应用。

背景技术：

1、鸡蛋壳的颜色主要受两种色素含量的影响，一种是原卟啉ix，另外一种是胆绿素。市面上的蛋壳颜色主要为褐壳蛋和粉壳蛋，这些鸡蛋的蛋壳中都含有原卟啉ix和少量的胆绿素。随着胆绿素浓度的提高，鸡蛋壳逐渐呈现出绿色或蓝色。如绿壳蛋中原卟啉ix含量太高的话会出现黄绿色。slco1b3基因是蛋壳绿色的主效基因，一般认为该基因启动子区的eav-hp反向插入是蛋壳绿色表型的致因突变。该突变的存在，使鸡产绿壳蛋成为了可能，然而并不是所有带有这个突变的母鸡就产绿壳蛋。产绿壳蛋的母鸡个体相互间所产蛋的胆绿素含量变化比较大，有产浅绿的也有深绿的，这说明蛋壳的绿色除受到这个主效基因影响外，还受到其它修饰基因的影响。另外，绿壳蛋颜色的深浅和参差不齐影响消费者的感官和购买欲望，有必要改善绿壳蛋的颜色和提高绿壳蛋色泽的整齐度。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供与绿壳蛋鸡蛋壳胆绿素含量相关的snp标记及其应用。

2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种与绿壳蛋鸡蛋壳胆绿素含量相关的snp标记，所述snp标记含有鸡参考基因组grcg7b中6号染色体第20261010位的多态性为c/t的核苷酸序列。

3、进一步地，具有所述多态性的位点的基因型为cc或ct，对应于高蛋壳胆绿素含量，具有所述多态性的位点的基因型为tt，对应于低蛋壳胆绿素含量。

4、第二方面，本发明提供用于扩增所述snp标记的引物对。

5、优选地，所述引物对包括如seq id no:1-2所示的引物。

6、第三方面，本发明提供含有所述引物对的试剂或试剂盒。

7、第四方面，本发明提供一种鉴定与绿壳蛋鸡蛋壳胆绿素含量相关的基因型的方法，包括以下步骤：

8、（1）提取待测鸡的基因组dna；

9、（2）检测所述基因组dna中与鸡参考基因组grcg7b中6号染色体第20261010位点所对应的碱基，根据检测结果确定所述位点的基因型为cc、ct或tt。

10、进一步地，步骤（2）包括：以所述基因组dna为模板，利用seq id no:1-2所示的引物进行pcr扩增，获得包含所述位点的扩增产物，然后对所述扩增产物进行测序（如sanger测序）来确定所述位点的碱基。

11、进一步地，pcr扩增所采用的退火温度为58-62℃。

12、优选地，pcr扩增的反应程序为：95℃  5 min；95℃  30 s，60℃  30 s，72℃  1min，35个循环；72℃  5min。

13、优选地，pcr扩增的反应体系为：待测鸡dna 100-500 ng，2×taq pcr mix 10 µl，10 µm正向引物1 µl，10 µm反向引物 1 µl，用ddh2o将反应体系补充至20 µl。

14、其中，2×taq pcr mix是2倍浓缩的pcr扩增预混合溶液，含有taq dna聚合酶、dntps、mgcl2、反应缓冲液和稳定剂。

15、优选地，采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测pcr扩增产物的大小。

16、优选地，电泳检测中琼脂糖凝胶的浓度为1.0-1.5%（优选1%）。

17、优选地，电泳条件为：120~150v，20~25min（优选120v，20min）。

18、第五方面，本发明提供一种选育高蛋壳胆绿素含量绿壳蛋鸡的方法，其特征在于，包括采用上述方法对候选鸡群进行基因分型，并选择基因型为cc型或ct型的个体作为亲本进行后续繁育。

19、第六方面，本发明提供所述snp标记或所述引物对或所述试剂或试剂盒的以下任一应用：

20、（1）用于鉴定绿壳蛋鸡蛋壳胆绿素含量表型；

21、（2）用于高蛋壳胆绿素含量绿壳蛋鸡鉴定或选育；

22、（3）用于高蛋壳胆绿素含量绿壳蛋鸡早期预测；

23、（4）用于高蛋壳胆绿素含量绿壳蛋鸡的分子标记辅助育种。

24、优选地，所述绿壳蛋鸡为四川山地乌骨鸡。

25、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

26、本发明检测分析了绿壳蛋鸡32周龄蛋壳的胆绿素含量，利用第二代测序技术进行全基因组重测序和snp基因分型，通过全基因组关联分析筛选得到与蛋壳胆绿素含量显著相关的snp标记，为绿壳蛋鸡蛋壳胆绿素含量的选育提供了新的分子标记资源。在育种中，可根据育种目标选择cc基因型个体淘汰ct和tt基因型个体，可提高后代蛋壳的胆绿素含量，对改善绿壳蛋的感官有重要价值。本发明提供的检测方法简单易操作，具有广阔的应用前景。

1.与绿壳蛋鸡蛋壳胆绿素含量相关的snp标记，其特征在于，所述snp标记含有鸡参考基因组grcg7b中6号染色体第20261010位的多态性为c/t的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的snp标记，其特征在于，具有所述多态性的位点的基因型为cc或ct，对应于高蛋壳胆绿素含量，具有所述多态性的位点的基因型为tt，对应于低蛋壳胆绿素含量。

3.用于扩增权利要求1或2所述snp标记的引物对。

4.根据权利要求3所述的引物对，其特征在于，包括如seq id no:1-2所示的引物。

5.含有权利要求3或4所述引物对的试剂或试剂盒。

6.一种鉴定与绿壳蛋鸡蛋壳胆绿素含量相关的基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2）包括：以所述基因组dna为模板，利用seq id no:1-2所示的引物进行pcr扩增，获得包含所述位点的扩增产物，然后对所述扩增产物进行测序来确定所述位点的碱基。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，pcr扩增所采用的退火温度为58-62℃；

9.一种选育高蛋壳胆绿素含量绿壳蛋鸡的方法，其特征在于，包括采用权利要求6-9任一项所述方法对候选鸡群进行基因分型，并选择基因型为cc型或ct型的个体作为亲本进行后续繁育。

10.权利要求1或2所述snp标记或权利要求3或4所述引物对或权利要求5所述试剂或试剂盒的以下任一应用：