一种甲基异柳磷半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用

本发明属于农产品质量安全检测，具体而言，涉及一种甲基异柳磷半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、甲基异柳磷（isofenphos-methyl）是一种广泛应用于农业领域的广谱类土壤有机磷杀虫剂，化学名为o-甲基-o-[（2-异丙氧基甲酰）苯基]-n-异丙基硫代磷酰胺，对地下害虫具有强烈的毒杀作用，可防治蛴螬、蝼蛄、地老虎、金针虫等，也可用于防治黏虫、蚜虫、烟青虫、桃小食心虫、红蜘蛛等农业害虫。根据我国农业农村部第536号公告，甲基异柳磷属于高毒农药，禁止在蔬菜、果树、茶叶、中草药材等作物上使用。其具有较强的触杀、胃毒及内吸作用，长期或大量接触会对人体健康产生危害，且会抑制机体乙酰胆碱酯酶的活性，导致乙酰胆碱在生物体内大量积累，对机体中枢神经系统、呼吸系统和皮肤产生剧毒作用。同时，甲基异柳磷降解半衰期较长，施用后大部分农药残留于土壤中难以降解，这些残留物可能通过食物链迁移扩散，破坏农业生态平衡，威胁农产品质量安全与绿色农业发展，因此，对甲基异柳磷残留的监测与控制对于保障农业生态安全、推动绿色农业建设具有重要意义。

2、为减少甲基异柳磷农药对人体健康、农业生态环境及农产品质量的影响，亟须建立高效的检测方法与完善的监管体系。目前，国内外对甲基异柳磷残留的检测方法主要采用气相色谱法、气相色谱-质谱联用技术、液相色谱-质谱联用技术、表面增强拉曼光谱法、近红外光谱法、高效薄层色谱法。这些方法虽具备高灵敏度、准确性、稳定性和重复性，可实现甲基异柳磷残留的快速定量检测，但存在依赖复杂精密且昂贵的仪器设备、检测成本高、操作步骤烦琐、检测周期长、对操作人员技术要求高、样本前处理要求严格、环境友好性不足、不适合现场或批量检测等缺陷。近年来发展的基于抗原抗体特异性结合反应的免疫分析法，具有操作简便、成本低廉、高通量、检测灵敏、便携性强等优势，既适用于现场快速筛查，也可满足实验室大批量检测需求，有效弥补了传统仪器检测方法的不足，为甲基异柳磷残留检测提供了新的技术路径，对强化农业投入品监管、保障农业生态安全、促进绿色农业发展具有重要支撑作用。

3、免疫分析法基于抗体与抗原的高度特异性识别反应，实现对农药残留的高选择性检测，已成为农业生态环境监测、农产品质量安全分析等领域的主要分析方法，在农药残留检测领域具有广阔的应用前景。在建立甲基异柳磷残留免疫检测方法并推广应用时，核心技术在于获取特异性强、灵敏度高的抗体，而制备合适的甲基异柳磷半抗原是实现这一目标的前提。研究表明，甲基异柳磷的磷酰基与硫代磷酰胺结构为核心骨架，异丙氧基羰基是其特征结构，对免疫反应的特异性起着关键作用。现有发明专利cn115925740a、cn110760004a、cn114292818a均采用将甲基异柳磷的-nh衍生化为带-cooh的间隔臂，再与载体蛋白偶联的技术方案，该修饰方式会破坏甲基异柳磷的硫代磷酰胺结构（即p=s-n键断裂），无法保留其专属取代基团，易导致半抗原特异性大幅下降，进而影响免疫检测的准确性与可靠性。此外，此类方法需直接使用剧毒甲基异柳磷原药作为起始原料，存在操作危险性高、环保风险大等问题。

4、因此，亟须开发一种无需使用甲基异柳磷原药且能在不破坏硫代磷酰胺键的前提下，精准保留其完整药效团的半抗原设计策略，以解决现有技术中因表位失真导致的交叉反应高、特异性差等缺陷。这对优化免疫检测效果、保障农产品质量安全、推动绿色生态农业发展具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种甲基异柳磷半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用，该甲基异柳磷半抗原通过在甲基异柳磷母核磷原子的烷氧基侧（p-o-c位点）引入含羧基的碳链连接臂，完整保留了磷酰基、硫代磷酰胺及异丙氧基羰基三大特征官能团，避免了对敏感硫代磷酰胺键的化学修饰，从而实现了对甲基异柳磷完整药效团的免疫呈递。

2、为实现上述发明目的，本发明提供了一种甲基异柳磷半抗原，所述甲基异柳磷半抗原为6-（（（2-（异丙氧基羰基）苯氧基）（异丙基氨基）硫代磷酰基）氧基）己酸，其具有如式i所示的结构。

3、

4、式i

5、本发明提供的甲基异柳磷半抗原在甲基异柳磷的磷原子烷氧基侧p-o-c引入6-羧己氧基连接臂，从而可以与载体蛋白进行偶联得到人工抗原用于免疫；该半抗原完整保留了甲基异柳磷的所有特征基团，仅最小改变甲基异柳磷原有结构特征，同时与载体蛋白偶联后，突出的是甲基异柳磷本身独有的磷酰基、硫代磷酰胺结构和异丙氧基羰基结构，为后续刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体奠定基础。

6、本发明还提供上述甲基异柳磷半抗原的制备方法，其是由异丙基水杨酸酯与硫代磷酰氯在三乙胺介导下发生磷酰化反应得到中间体1，该中间体与异丙胺经胺化取代反应得中间体2，所述中间体2与6-叔丁氧基-6-氧代己醇在氢化钠作用下发生亲核取代反应得中间体3，最后该中间体3经甲酸介导的脱保护反应制得目标半抗原。

7、进一步地，该制备方法包括以下步骤：

8、（1）在氮气保护、-10℃条件下，将异丙基水杨酸酯与硫代磷酰氯溶于二氯甲烷，滴加三乙胺，升温至20℃搅拌12 h，得到异丙基-2-硫代磷酰氧基苯甲酸酯，即甲基异柳磷中间体1；

9、（2）在氮气保护、0℃下，向甲基异柳磷中间体1的二氯甲烷溶液中加入三乙胺和异丙胺，0℃搅拌2 h，减压浓缩后经0～10%乙酸乙酯/正己烷梯度硅胶柱色谱纯化，得到异丙基-2-[氯-（异丙基氨基）硫代磷酰基]氧基苯甲酸酯，即甲基异柳磷中间体2；

10、（3）在氮气保护、0℃下，向6-叔丁氧基-6-氧代己醇的四氢呋喃溶液中加入氢化钠，搅拌15 min后滴加甲基异柳磷中间体2的四氢呋喃溶液，搅拌1 h，经饱和氯化铵淬灭、乙酸乙酯萃取、饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、减压浓缩，再经5%～7%乙酸乙酯/正己烷梯度硅胶柱色谱纯化，得到异丙基-2-[（6-叔丁氧基-6-氧代己氧基）-（异丙基氨基）硫代磷酰基]氧基苯甲酸酯，即甲基异柳磷中间体3；

11、（4）将甲基异柳磷中间体3溶于甲酸，20℃搅拌1 h，0℃加水淬灭，乙酸乙酯萃取、饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、减压浓缩，先经25%～35%乙酸乙酯/正己烷梯度硅胶柱色谱得粗品，再经制备型高效液相色谱纯化，得到所述甲基异柳磷半抗原；

12、其中，步骤（1）中异丙基水杨酸酯:硫代磷酰氯:三乙胺=1:1.3:2；步骤（2）中甲基异柳磷中间体1:三乙胺:异丙胺=1:1:1.1；步骤（3）中甲基异柳磷中间体2:6-叔丁氧基-6-氧代己醇:氢化钠=1:1:0.9。

13、本发明根据甲基异柳磷的结构特点，合理设计合成路线，从异丙基水杨酸酯出发逆向构建甲基异柳磷骨架并同步引入连接臂，无需使用剧毒甲基异柳磷原药，反应操作安全，条件温和，各步中间体稳定性高，最终产物纯度达100%，收率可控，适合放大生产。

14、本发明还提供一种甲基异柳磷人工抗原，其是载体蛋白和上述甲基异柳磷半抗原偶联得到的偶联物。所述甲基异柳磷人工抗原可以作为免疫原，也可以作为包被原。

15、进一步地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白。

16、更具体的如：甲基异柳磷半抗原-牛甲状腺球蛋白（btg）形成的免疫原；甲基异柳磷半抗原-牛血清白蛋白（bsa）形成的包被原。

17、本发明还提供上述甲基异柳磷人工抗原的制备方法，包括：

18、s1：将所述甲基异柳磷半抗原溶于二甲基亚砜，加入edc和nhs，室温避光搅拌3 h，得活化半抗原溶液a液；其中，甲基异柳磷半抗原:edc:nhs摩尔比为1:2:2；

19、s2：将载体蛋白溶于ph 9.6碳酸盐缓冲液，浓度为5-10 mg/ml，得b液；

20、s3：冰浴搅拌下将a液滴加至b液，用naoh调节ph至9.6，避光反应过夜，再用0.01mol/l pbs透析3天，每日换液3次，获得所述人工抗原。

21、本发明还提供一种甲基异柳磷抗体，它是由上述甲基异柳磷人工抗原经动物免疫得到，其能与甲基异柳磷发生特异性免疫反应。

22、进一步地，所述甲基异柳磷抗体为单克隆抗体。另外，对于所述甲基异柳磷抗体，可以采用本领域常规方法来进行制备。

23、在一个具体的实施方案中，所述甲基异柳磷抗体为特异性针对上述甲基异柳磷半抗原的甲基异柳磷人工抗原的鼠源单克隆抗体。

24、采用本发明的甲基异柳磷人工抗原得到的甲基异柳磷抗体对甲基异柳磷的ic50为6.09 ng/ml，线性检测范围为1.16-30.49 ng/ml，且对水胺硫磷、丙溴磷、甲基对硫磷、三唑磷、吡唑硫磷、倍硫磷、毒死蜱、乙酰甲胺磷、滴滴涕、六六六、三氯杀螨砜的交叉反应率均低于1%。

25、本发明还提供上水甲基异柳磷抗体在制备检测甲基异柳磷残留的应用，包括所述的甲基异柳磷半抗原、甲基异柳磷完全抗原和甲基异柳磷抗体。

26、本发明通过甲基异柳磷人工抗原诱导免疫动物产生抗体，从而用于甲基异柳磷免疫检测分析中。所述的甲基异柳磷免疫检测包括但不限于甲基异柳磷elisa试剂盒。

27、本发明的有益效果：

28、（1）表位完整，抗体特异性显著提升。本发明提供的甲基异柳磷半抗原既最大程度保留了甲基异柳磷的特征结构，使得甲基异柳磷半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用甲基异柳磷半抗原与载体蛋白偶联后得到的甲基异柳磷人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，为后续建立甲基异柳磷的各种免疫分析方法提供基础。

29、（2）合成路线安全，无需剧毒原药。本发明公开了甲基异柳磷半抗原的制备方法，所使用的原料易得，反应操作较为简单，反应条件易于控制，制备的甲基异柳磷半抗原的纯度和收率较高，且避免了对硫代磷酰胺键的破坏，解决了现有技术中因-nh位点修饰导致的表位失真问题。

30、（3）检测性能优异，实用性强。采用本发明的甲基异柳磷人工抗原得到的甲基异柳磷抗体的效价、特异性、亲和力都较好，所构建的间接竞争酶联免疫分析方法对甲基异柳磷灵敏度ic50为6.09 ng/ml，检测范围为1.16-30.49 ng/ml，线性范围广，灵敏度较高，可满足快速筛查需求，且对11种结构类似农药（水胺硫磷、丙溴磷、甲基对硫磷、三唑磷、吡唑硫磷、倍硫磷、毒死蜱、乙酰甲胺磷、滴滴涕、六六六、三氯杀螨砜）的交叉反应率均低于1%，显著优于现有技术中因-nh修饰导致的高交叉反应抗体。该抗体特别适用于出口农产品等对假阳性容忍度极低的高特异性监管场景。