MOG-EGFP融合蛋白及其应用的制作方法
本发明属于生物，具体涉及一种mog-egfp融合蛋白及其应用。
背景技术：
1、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（mog）是存在于中枢神经系统髓鞘外表面的一种极其重要的自身抗原。mog抗体相关疾病（mogad）的准确诊断高度依赖于对患者血清中mog-igg的精准检测。目前临床检测的金标准为细胞底物免疫荧光法（cba）。
2、天然mog蛋白结构具有极强的特殊性：其胞外部分极短，仅包含一个单一的igv样结构域，且该结构域通过仅有3-4个氨基酸的“超短茎区”直接连接至细胞膜的跨膜区。这种天然结构导致mog的致病核心表位极其贴近细胞膜表面（糖萼层）。
3、现有的cba底物制备工艺中，存在的问题是：临床常规的4%多聚甲醛（pfa）固定不仅会强行扭曲mog的三维构象，还会中和膜表面氨基的原始阳性电荷，破坏抗原-抗体结合的静电微环境，导致大量临床漏检。
技术实现思路
1、鉴于此，本发明提供了一种mog-egfp融合蛋白及其应用，对低滴度临床致病样本表现出极高的捕获灵敏度，且具备长效冷藏稳定性。
2、为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供了一种mog-egfp融合蛋白，融合蛋白从n端到c端依次包含如下结构：截短的mog胞外结构域，刚性α-螺旋连接肽以及mog跨膜结构域及胞内结构域，其中截短的mog胞外结构域，包含野生型mog完整的信号肽及免疫球蛋白可变区样结构域。
4、需要说明的是，本发明摒弃了使用野生型全长序列的传统方法，创造性地在mog胞外igv样结构域（第153位氨基酸处）与跨膜区之间，精准插入了一段纯刚性的α-螺旋连接肽（如eaaak重复序列）。该支撑臂利用氨基酸侧链间的强盐桥作用形成坚固的柱状结构，将mog致病表位强行向胞外空间垂直托举约2.5纳米。提高了检测准确性。
5、优选地，所述截短的mog胞外结构域包括人源野生型mog蛋白的第1位至第153位氨基酸；和/或，
6、刚性α-螺旋连接肽包含至少两个串联重复的eaaak氨基酸基序。
7、优选地，所述刚性α-螺旋连接肽的氨基酸序列为eaaakeaaakeaaak或eaaakeaaakeaaakeaaak。
8、优选地，c端还包括荧光报告蛋白。
9、优选地，所述融合蛋白的核苷酸序列如seq id no .1所示。
10、seq id no .1具体为：maslsrpslpsclcsfllllllqvsssyagqfrvigprhpiralvgdevelpcrispgknatgmevgwyrppfsrvvhlyrngkdqdgdqapeyrgrtellkdaigegkvtlrirnvrfsdeggftcffrdhsyqeeaamelkvedpfywvspeaaakeaaakeaaakgvlvllavlpvlllqitvgliflclqyrlrgklraeienlhrtfdphflrvpcwkitlfvivpvlgplvaliicynwlhrrlagqfleelrnpfmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk。
11、第二方面，本发明提供了一种含有所述核苷酸序列的表达载体。
12、第三方面，本发明提供了一种含有所述表达载体的工程菌。
13、第四方面，本发明提供了一种神经免疫自身抗体检测试剂盒，包括cba抗原底物，所述cba抗原底物由所述的mog-egfp融合蛋白制备而成。
14、优选地，所述cba抗原底物的制备方法包括以下步骤：
15、s1、将mog-egfp融合蛋白的基因序列转载克隆至真核表达载体后，转染真核细胞，获得高表达mog-egfp融合蛋白的活细胞；
16、s2、将高表达mog-egfp融合蛋白的活细胞与dtbp固定工作液混合，于15-25℃交联孵育15-30分钟；
17、s3、弃去固定液，加入含有l-精氨酸的复合微环境稳定液，室温孵育猝灭10-20分钟；
18、s4、清洗后置于含防腐剂的缓冲液中保存，或进行脱水封片。
19、在上述技术方案中，在底物固定阶段，本发明摒弃了pfa，采用空间臂长为11.9å的dtbp进行柔性膜脂质交联，同时引入l-精氨酸猝灭体系。l-精氨酸的游离氨基不仅能高效竞争性结合并终止dtbp交联，其胍基结构更能在已被托举的融合蛋白及底层交联网络表面，形成一层极其致密的非共价水合保护膜。
20、在上述技术方案中，刚性α-螺旋连接肽将igv样结构域向上托举，使其暴露于由交联剂在细胞膜表面形成的化学交联网络之外；且l-精氨酸在融合蛋白及交联网络表面形成非共价的水合保护膜。
21、本发明底部的dtbp交联网牢牢锁住细胞膜，而顶端的mog致病表位被刚性柱稳稳托举于交联网之外，使得抗体结合畅通无阻。
22、本发明保留了mog的原始电荷及水合状态，抵御了剧烈洗涤带来的物理塌陷。
23、并且本发明还对临床低滴度、高隐匿性样本的捕获灵敏度远超现有技术，且常温/冷藏稳定性可达6个月以上，具备极高的商业转化价值。
24、优选地，在步骤s2中，dtbp固定工作液的浓度为1-5mm；和/或，
25、在步骤s3中，含有l-精氨酸的复合微环境稳定液的终浓度为50-150mm。
26、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
27、本发明提出了“内源性刚性托举”与“外源性水合交联”的双重协同策略：在序列层面，于mog的胞外igv样结构域与跨膜区之间精准敲入刚性α-螺旋连接肽，将致病表位向胞外强行托举；在工艺层面，采用具有特定臂长的亚氨酸酯类交联剂（dtbp）与构象支撑氨基酸（l-精氨酸）组成协同固定体系。该底物完美保留了mog的原始电荷、三维构象并彻底解除了物理遮蔽，对低滴度临床致病样本表现出极高的捕获灵敏度，且具备长效冷藏稳定性。
1.一种mog-egfp融合蛋白，其特征在于，融合蛋白从n端到c端依次包含如下结构：
2.根据权利要求1所述的mog-egfp融合蛋白，其特征在于，所述截短的mog胞外结构域包括人源野生型mog蛋白的第1位至第153位氨基酸；和/或，
3.根据权利要求1所述的mog-egfp融合蛋白，其特征在于，所述刚性α-螺旋连接肽的氨基酸序列为eaaakeaaakeaaak或eaaakeaaakeaaakeaaak。
4.根据权利要求1所述的mog-egfp融合蛋白，其特征在于，c端还包括荧光报告蛋白。
5.根据权利要求4所述的mog-egfp融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的核苷酸序列如seq id no .1所示。
6.含有权利要求5所述核苷酸序列的表达载体。
7.含有权利要求6所述表达载体的工程菌。
8.一种神经免疫自身抗体检测试剂盒，其特征在于，包括cba抗原底物，所述cba抗原底物由权利要求1-5任一项所述的mog-egfp融合蛋白制备而成。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述cba抗原底物的制备方法包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，在步骤s2中，dtbp固定工作液的浓度为1-5mm；和/或，