一种布鲁氏菌BacA蛋白纯化及相应单克隆抗体制备及应用

本发明涉及单克隆抗体制备和生物检测，具体涉及布鲁氏菌baca蛋白纯化及相应单克隆抗体制备及应用。

背景技术：

1、布鲁氏菌病(简称“布病”)是由布鲁氏菌引起的以流产和发热为特征的人畜共患病，感染后病人最明显的症状表现波浪热，又称“地中海弛张热”或“马他耳热”。目前，世界动物卫生组织(woah)将布病列为必须通报动物疫病。

2、布鲁氏菌分为6个经典种：羊种(b.melitensis)、牛种(b.abortus)、猪种(b.suis)、犬种(b.canis)、绵羊种(b.ovis)和沙林鼠种(b.neotomae)。对人产生致病力的主要是羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌和犬种布鲁氏菌。其中羊、牛、猪种布鲁氏菌属于光滑型布鲁氏菌，对人致病力较强，且是家畜布鲁氏菌病主要病原，受到广泛关注；而犬种布鲁氏菌属于粗糙型菌株，对人致病力弱，长期以来研究报道相对较少。

3、布鲁氏菌的外膜包括三个部分，分别是外膜蛋白(omps)、脂多糖(lps)、磷脂。布鲁氏菌感染后产生的大多数抗体是针对脂多糖(lps)。布鲁氏菌的lps由类脂a、核心寡聚糖和o链组成，依据是否含有o链，将其分为光滑型和粗糙型。布鲁氏菌baca基因编码的蛋白称为baca蛋白，baca蛋白广泛存在于布鲁氏菌的细胞外膜上，属于一种细胞质膜转运蛋白，是布鲁氏菌的一种重要毒力因子，主要参与细菌的生存和感染过程。在脂多糖合成过程中，baca参与类脂a生物合成中不寻常的超长链脂肪酸(c28)的生成，影响其特异性修饰。

4、目前动物布病的检测主要以血清学检测方法为主，例如虎红平板凝集试验、试管凝集试验和酶联免疫吸附试验(elisa)等。但由于布鲁氏菌脂多糖与其他革兰氏阴性菌lps存在相同的抗原表位，血清学检测存在一定假阳性结果，故此制备针对布鲁氏菌baca的特异性单克隆抗体，并基于特异性单克隆抗体建立的检测方法对布病检测变得尤为重要。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供布鲁氏菌baca蛋白纯化及相应单克隆抗体制备及应用，提高布鲁氏菌检测的准确性，本发明制备的抗布鲁氏菌baca的单克隆抗体，具有特异性好、亲和性强的优点，为我国布病血清学检测技术的开发提供坚实基础。

2、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是:

3、本发明提供一种抗布鲁氏菌baca蛋白的单克隆抗体1a7，所述单克隆抗体1a7重链可变区包括氨基酸序列为gytlarrgmqcv的cdr1，氨基酸序列为idgcdsyisg的cdr2以及氨基酸序列为aregllr的cdr3。所述单克隆抗体1a7轻链可变区包括氨基酸序列为qdvgnavawyqq的cdr1，氨基酸序列为wastrhtgvp的cdr2以及氨基酸序列为qqysss的cdr3。

4、进一步地，所述单克隆抗体1a7的重链可变区的氨基酸序列如seq id no：2所示；所述单克隆抗体1a7的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：4所示。

5、本发明还提供一种核酸分子，所述核酸分子包含能够编码抗布鲁氏菌baca蛋白的单克隆抗体的核酸序列，其中所述核酸序列包含氨基酸序列分别为重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3；和氨基酸序列分别为轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3。

6、本发明还包括一种载体，所述载体包括所述的核酸分子。

7、本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述的核酸分子或所述的载体。

8、进一步地，所述的单克隆抗体1a7能与猪种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌以及羊种布鲁氏菌发生特异性免疫反应，且不与大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌发生特异性反应。

9、进一步地，所述的单克隆抗体1a7的重链为igg2b，轻链为kappa。

10、本发明还提供一种所述单克隆抗体在布鲁氏菌抗体竞争elisa检测方法的应用。

11、进一步地，所述布鲁氏菌抗体竞争elisa检测方法具体包括：将布鲁氏菌baca蛋白稀释至0.5μg/ml，按100μl/孔包被酶标板，置4℃条件下作用15小时，弃去孔中溶液，拍干；将5％bsa作为封闭液，每孔加200μl，置37℃下作用1小时，弃去孔中溶液，拍干；加入1:5稀释的待检血清和1：200稀释的单克隆抗体，每孔各50μl，置37℃温育45分钟，弃去孔中液体，拍干；加入1：5000稀释的酶标二抗，每孔100μl，置37℃温育30分钟，甩去板孔中的液体，用洗涤液洗板5次，每孔300μl，最后一次在吸水纸上拍干；加入底物显色液，每孔100μl，避光显色20分钟；加入终止液，每孔50μl，用酶标仪测定各孔od450nm值。

12、进一步地，所述布鲁氏菌竞争elisa抗体检测方法的判定标准为：

13、当待测血清样品抑制率(pi)≥60％，布鲁氏菌抗体检测结果判为阳性；

14、当待测血清样品抑制率(pi)＜60％，布鲁氏菌抗体检测结果判为阴性。

15、本发明还提供一种baca蛋白的表达纯化方式，具体包括：(1)以猪种布鲁氏菌基因组为模板，pcr扩增目的基因片段，构建重组质粒pet28a-baca。(2)将质粒转化大肠杆菌bl21感受态，诱导表达出了布鲁氏菌蛋白baca。(3)对表达的包涵体蛋白破碎后进行变性、复性处理，之后再使用镍柱亲和层析法纯化蛋白。

16、本发明公开了以下技术效果：

17、本发明使用的免疫源是纯化的布鲁氏菌baca蛋白，免疫原性强，能有效刺激机体产生特异性抗体，不含活菌成分，安全性高。

18、本发明提供的单克隆抗体与猪种布鲁氏菌抗原和临床分离株抗原均可产生特异性免疫学反应，而与布鲁氏菌有强烈交叉反应的小肠结肠炎耶尔森氏菌、大肠杆菌、都柏林沙门氏菌均不反应。

19、本发明提供的单克隆抗体亲和性好，结合能力强，特异性良好，在竞争elisa中，布鲁氏菌阳性血清能够高效抑制该单克隆抗体与布鲁氏菌baca结合，显示该单克隆抗体可用于建立布鲁氏菌竞争elisa抗体检测方法，能够为今后开展布鲁氏菌病原及抗体检测方法的建立奠定良好的实验基础。

1.一种抗布鲁氏菌baca蛋白的单克隆抗体1a7，其特征在于，所述单克隆抗体1a7重链可变区包括氨基酸序列为gytlarrgmqcv的cdr1，氨基酸序列为idgcdsyisg的cdr2以及氨基酸序列为aregllr的cdr3。所述单克隆抗体1a7轻链可变区包括氨基酸序列为qdvgnavawyqq的cdr1，氨基酸序列为wastrhtgvp的cdr2以及氨基酸序列为qqysss的cdr3。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体1a7，其特征在于，所述单克隆抗体1a7的重链可变区的氨基酸序列如seq id no：2所示；所述单克隆抗体1a7的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：4所示。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的单克隆抗体1a7的核酸分子。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体1a7，其特征在于，所述单克隆抗体1a7能与猪种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌以及羊种布鲁氏菌发生特异性免疫反应，且不与大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌发生特异性反应。

6.根据权利要求1所述的单克隆抗体1a7，其特征在于，所述的单克隆抗体1a7的重链为igg2b，轻链为kappa。

7.根据权利要求1所述的抗布鲁氏菌baca蛋白的单克隆抗体在制备布鲁氏菌竞争elisa抗体检测方法中的应用。

8.根据权利要求8所述的应用，所述布鲁氏菌竞争elisa抗体检测方法为：将布鲁氏菌baca蛋白稀释至0.5μg/ml，按100μl/孔包被酶标板，置4℃条件下作用15小时，弃去孔中溶液，拍干；将5％bsa作为封闭液，每孔加200μl，置37℃下作用1小时，弃去孔中溶液，拍干；加入1:5稀释的待检血清和1：200稀释的单克隆抗体，每孔各50μl，置37℃温育45分钟，弃去孔中液体，拍干；加入1：5000稀释的酶标二抗，每孔100μl，置37℃温育30分钟，甩去板孔中的液体，用洗涤液洗板5次，每孔300μl，最后一次在吸水纸上拍干；加入底物显色液，每孔100μl，避光显色20分钟；加入终止液，每孔50μl，用酶标仪测定各孔od450nm值。

9.根据权利要求9所述布鲁氏菌竞争elisa抗体检测方法，其特征在于，判定标准为：

10.布鲁氏菌baca蛋白的表达纯化步骤：(1)以猪种布鲁氏菌基因组为模板，pcr扩增目的基因片段，构建重组质粒pet28a-baca；(2)将质粒转化大肠杆菌bl21感受态诱导表达出了布鲁氏菌蛋白baca；(3)对表达的包涵体蛋白破碎后进行变性、复性处理，之后再使用镍柱亲和层析法纯化蛋白。