一种三文鱼骨排抗氧化肽及其制备方法与应用

本发明属于食品生物，具体涉及一种三文鱼骨排抗氧化肽及其制备方法与应用。

背景技术：

1、抗氧化肽是一类由2~20个氨基酸组成、具有特定氨基酸序列的小分子寡肽，多通过蛋白酶水解天然蛋白质原料制备。抗氧化肽的生物活性表现为清除各类自由基、抑制活性氧过量生成、阻断脂质过氧化链式反应，兼具抗氧化活性优异、生物相容性好、易被机体吸收、无潜在毒性、来源广泛等多重优势，成为替代合成抗氧化剂的理想功能成分。抗氧化肽除了具有很强的抗氧化性能外，还可能具有抗菌、抗炎和修复皮肤的能力。因此，抗氧化肽在功能性食品开发、食品保鲜、医药和化妆品领域等领域展现出巨大的应用潜力。

2、三文鱼（salmon，别名鲑鱼）是数种鲑形目鲑科鲑亚科的广盐性辐鳍鱼的通称，涵盖北太平洋6种太平洋鲑属鱼类（大麻哈鱼、大鳞大麻哈鱼、银大麻哈鱼、马苏大麻哈鱼、细鳞大麻哈鱼、红大麻哈鱼）和北大西洋的大西洋鲑，其营养价值丰富，在全球市场上赢得了广泛的关注和青睐，有着“海洋中的营养宝库”的美誉。三文鱼不仅是全球水产养殖业的重要品种，也是人类饮食中优质蛋白质、ω-3脂肪酸、维生素d和多种矿物质的重要来源，对心血管健康和大脑发育都具有显著的生理益处。目前市面上三文鱼主要以生鲜刺身的方式进行销售，然而三文鱼除了用于生鲜刺身的部分外，还会产生大量的鱼头、鱼骨、鱼皮和鱼内脏等副产物，这些副产物约占整条鱼重量的50%。目前，这些副产物除部分被用作饲料和生产鱼粉、提取鱼油外，其余大部分作为垃圾被丢弃，利用途径单一、附加值低，不仅造成了资源的严重浪费，而且给生态环境保护造成了极大的压力。因此，加快三文鱼副产物的高值化利用和深加工技术的应用至关重要。目前已有学者从三文鱼加工副产物中提取不饱和脂肪酸、生物活性肽以及用三文鱼骨排熬汤等。但从三文鱼骨排中分离纯化抗氧化肽的研究鲜有报道。

3、因此，以三文鱼骨排为原料制备纯天然活性抗氧化肽，能够为三文鱼骨排抗氧化肽在天然食品来源制取功能性食品中的应用提供基础，对三文鱼副产物的深加工及高值化利用具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种三文鱼骨排抗氧化肽及其制备方法和应用，开发三文鱼下脚料的新用途，得到具有清除自由基的功能的抗氧化肽。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种三文鱼骨排抗氧化肽，为pygpr、rpygp、lcypr、gprgppgpp、igppgpr或rgpgy。

4、优选地，所述抗氧化肽基于分子模拟可以与受体蛋白keap1对接，主要结合位点为位于keap1-kelch结构域上的氨基酸残基arg415、tyr525、ser363和tyr572。

5、优选地，抗氧化肽与受体蛋白keap1对接能量为-8.6 kcal/mol~-8.0 kcal/mol。

6、本发明还提供了所述的三文鱼骨排抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：

7、（1）将三文鱼骨排清理后，加水制浆，采用复合蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解，得到三文鱼骨排酶解液；

8、（2）将所得三文鱼骨排酶解液离心，取上清，过滤，收集滤液进行超滤，冷冻干燥后得到三文鱼骨排粗肽；

9、（3）将三文鱼骨排粗肽复溶，过滤，分离纯化后，收集各洗脱组分，浓缩、冷冻干燥，得不同组分的三文鱼骨排肽冻干粉；

10、（4）通过lc-ms/ms鉴定肽序列、计算机虚拟筛选和分子对接筛选具有抗氧化活性多肽。

11、优选地，步骤（1）中三文鱼骨排和水的质量体积比为：1g:3~5ml；

12、以三文鱼骨排质量计，步骤（1）所述复合蛋白酶的添加量为132.5~400u/g；碱性蛋白酶的添加量为535~1600u/g；

13、酶解条件为：ph8.0~12.0，40~60℃水浴下酶解1~5h。

14、优选地，步骤（2）所述离心的条件为：8000~12000rmp转速离心15~25min；

15、所述超滤的截留分子量为m1＜3kda，3kda＜m2＜5kda，5kda＜m3；

16、所述冷冻干燥的条件为：-85~-75℃预冷20~24h，冷阱温度为-65~-55℃，冻干时间为45~50h；

17、优选地，步骤（3）复溶后三文鱼骨排粗肽浓度为18~22mg/ml；

18、采用凝胶色谱进行分离，选用sephadex g-15凝胶色谱柱，进样量为2ml，去离子水洗脱；选择紫外检测器，在214nm波长处收集信号；使用自动收集器系统收集所有组分；

19、所述浓缩为蒸发浓缩，将收集的峰组分在30~50℃下蒸发至原始体积的1/5~3/5；

20、所述冷冻干燥的冷阱温度设置为-60℃，冻干时间为30~48h。

21、优选地，将步骤（4）中分离的不同组分的三文鱼骨排肽冻干粉配制成0.2g/l的溶液。

22、优选地，所述的lc-ms/ms检测方法中，流动相a为0.1%甲酸；b相为0.1%甲酸水溶液-80%乙腈；流速为600nl/min，梯度洗脱66min；流动相b比例：4~8%持续2min，8~28%持续33min，28~40%持续20min，40~95%持续1min，95~95%持续10min；

23、所述计算机虚拟筛选具体为：peptideranker预测多肽的生物活性，预测得分从0~1，得分越高，生物活性越高，选择＞0.8的多肽；使用toxinpred预测多肽的毒性；使用anoxpepred预测肽的自由基清除活性，选择抗氧化活性值＞0.5的肽段；利用innovagen与protparam，评估多肽的水溶性与稳定性；使用biopep-uwm数据库进行肽的新颖性验证；

24、所述分子对接使用autodock-vina分析所选抗氧化肽与keap1的相互作用；从蛋白质数据库下载人类氧化应激受体蛋白keap1的晶体结构（pdb id：2flu）；小分子配体在discovoury studio 2019 client中绘制多肽的3d结构，并通过minimization ligand模块对其进行优化；在对接之前，将蛋白结构导入autodocktools进行加氢、检查电荷、选择配体的可扭转键、指定原子类型并保存为“pdbqt”格式。使用pymol和ds可视化软件获得了多肽和目标蛋白之间相互作用的2d和3d结构。

25、优选地，所述三文鱼为大西洋鲑。

26、本发明还提供了所述三文鱼骨排抗氧化肽在制备食品、药品或化妆品中的应用。

27、本发明以三文鱼骨排为原料，清洗后打成匀浆，经复合蛋白酶和碱性蛋白酶进行复合酶解后得到三文鱼骨排酶解液，经超滤分离、凝胶色谱纯化、质谱鉴定、虚拟筛选后，得到抗氧化肽。制备操作简便，条件温和，对环境的污染小，并且无有害副产物生成，适宜大规模生产，实现了三文鱼骨排的高价值利用。

28、本发明的抗氧化肽与蛋白受体keap1对接能量分别为-8.6kcal/mol、-8.6kcal/mol、-8.4kcal/mol、-8.2kcal/mol、-8.1kcal/mol和-8.0kcal/mol，均具有abts、dpph自由基清除活性，对细胞的氧化损伤具有保护作用，能增强细胞的抗氧化能力，抗氧化活性良好，可用于食品、药品或化妆品，对新型抗氧化产品的开发具有重要意义。