甘草中一种自动环化酶及其在制备环肽类化合物中的应用

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新的、来源于豆科甘草属植物的自动环化酶、其核酸分子，包含该核酸分子的表达载体与包含该载体的宿主细胞、该自动环化酶gurburp的制备方法，以及该自动环化酶gurburp或宿主细胞在环肽类化合物glycnsisitina合成中的应用。

背景技术：

0、技术背景

1、glycnsisitin是从乌拉尔甘草干燥根中分离得到的一类新的双环八肽，其结构特点为，第六位酪氨酸侧链酚羟基氧与第一位谷氨酰胺形成的焦谷氨酸γ碳形成c-o-c键，焦谷氨酸γ碳的构型有r型和s型两种，第八位酪氨酸侧链酚羟基邻位碳与第四位甘氨酸α碳形成c-c键，甘氨酸α碳构型为r型。在doxorubicin(dox)诱导的心肌细胞损伤的体外模型中，glycnsisitin的代表化合物glycnsisitin a表现出优异心脏保护活性。glycnsisitina治疗不仅以剂量依赖的方式降低了心力衰竭(hf)小鼠的死亡率，还减轻了dox诱导的心脏功能障碍和心肌损伤、纤维化。对差异表达基因进行基因集富集分析(gsea)表明，glycnsisitin a的心脏保护作用主要归因于其维持心肌铁稳态的能力。从机制上讲，glycnsisitin a与转铁蛋白相互作用，并促进其与转铁蛋白受体(tfrc)的结合，从而导致心肌细胞中铁的摄取增加。这些发现突显了双环肽作为炙甘草汤治疗心力衰竭的生物活性分子的关键作用，而glycnsisitin a构成了治疗心力衰竭的有前景的治疗剂(zhou，jichao，et al.glycnsisitin a：a promising bicyclic peptide against heartfailure that facilitates tfrc-mediated uptake of iron in cardiomyocytes.actapharmaceutica sinica b，2024，14.7：3125-3139.)。

2、目前，glycnsisitin a仅在乌拉尔甘草中发现，来源有限，且含量低。而且该类化合物的化学全合成困难；另外，化学合成往往会使用有毒的试剂，造成环境污染等等，应用受限。该类化合物来源受限，制约了其作为药物的开发与应用。生物合成可为解决这一问题提供一种有效的手段，然而，迄今仍无关于其生物合成研究的报道。

3、因此，发现并功能鉴定glycnsisitin a生物合成关键前体相关的自动环化酶，将为利用生物合成方法合成具有潜在药用价值的化合物glycnsisitina奠定基础，具有潜在的应用价值。

技术实现思路

1、为克服现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种新的自动环化酶gurburp、其核苷酸，包含该核苷酸的表达载体与包含该载体的宿主细胞以及该自动环化酶gurburp在制备glycnsisitin a中的应用。

2、第一方面，本发明提供一种新的自动环化酶gurburp，其具有如seq id no.1所示的氨基酸序列，或者具有与如seq id no.1所示的氨基酸序列有至少90％同一性且具有催化生成氨基酸侧链相连的环肽的氨基酸序列。

3、本发明提供的自动环化酶gurburp可以进行化学修饰和/或固定化修饰。所属化学修饰可以选自乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇peg修饰中的一种或多种。所述固定化修饰可以采用物理吸附、化学交联等常规方法。

4、本发明提供的自动环化酶gurburp可以连接有用于检测和/或纯化的标签，用于检测或纯化。所述标签可以选自his6、gst、egfp、mbp、nus、ha、igg、flag、c-myc或profinityexact中的一个或多个。

5、第二方面，本发明同时提供所述自动环化酶gurburp的截短型。

6、作为一种优选方案，所述截短型为所述自动环化酶gurburp截去信号肽的截短型，如所述自动环化酶gurburp的第25-277残基。

7、本发明提供的自动环化酶gurburp的截短型可以进行化学修饰和/或固定化修饰。所属化学修饰可以选自乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇peg修饰中的一种或多种。所述固定化修饰可以采用物理吸附、化学交联等常规方法。

8、本发明提供的自动环化酶gurburp的截短型可以连接有用于检测和/或纯化的标签，用于检测或纯化。所述标签可以选自his6、gst、egfp、mbp、nus、ha、igg、flag、c-myc或profinity exact中的一个或多个。

9、第三方面，本发明提供编码自动环化酶gurburp的核苷酸。

10、作为一种具体方案，所属核苷酸具有如seq id no.2所示的核苷酸序列，序列命名为gurburp。

11、本发明同时提供编码自动环化酶gurburp截短型的核苷酸。

12、第四方面，本发明提供一种重组载体。所述载体中插入了第三方面所述的核苷酸，和/或能够外源性表达第一方面所述的自动环化酶gurburp或第二方面所述自动环化酶gurburp的截短型。

13、作为一种优选方案，所述载体可以是能够在细菌、酵母、植物或动物细胞中表达目标蛋白的表达载体。更优选地，所述载体为能够在大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、拟南芥、本氏烟草、昆虫细胞中表达目标蛋白的表达载体。

14、作为一种具体实施方案，可以将本发明第三方面所述的核酸分子通过酶切、同源重组的方式连接于表达载体。

15、第五方面，本发明提供外源转入了第三方面所述核苷酸和第四方面所述的载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是细菌、酵母、植物细胞或动物细胞。优选地，所述宿主选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、拟南芥、本氏烟草或昆虫细胞。

16、第六方面，本发明提供利用所述核苷酸、所述载体或所述宿主细胞制备第一方面所述自动环化酶gurburp或第二方面所述自动环化酶gurburp的截短型的方法。

17、作为一种具体实施方案，所述方法包括：对所述宿主进行培养，收集含有所述自动环化酶gurburp的培养物，提取所述自动环化酶gurburp或含有所述自动环化酶gurburp的组织。所述培养为本领域依据宿主特性采用的常规方法，如对细菌、酵母进行发酵培养，对植物进行组织培养或种植栽培，对动物细胞进行细胞体外培养等。所述提取为本领域依据蛋白特定采用的常规方法。

18、第七方面，本发明提供第一方面所述的自动环化酶gurburp或第二方面所述自动环化酶gurburp的截短型在酶促反应中的应用。

19、作为一种具体方案，所述酶促反应是指：催化自动环化酶gurburp上的肽段或底物肽段进行环化反应。

20、第八方面，本发明提供所述自动环化酶gurburp、所述自动环化酶gurburp的截短型、所述核苷酸、所述载体或所述宿主细胞在制备环肽类化合物中的应用。

21、本发明所述环肽类化合物为glycnsisitin a，所述glycnsisitin a具有如下所示的结构：

22、

23、作为一种具体方案，所述应用包括：利用所述自动环化酶gurburp或所述自动环化酶gurburp的截短型，在金属离子(如铜离子)存在的条件下，进行体外酶促反应自动催化生成酪氨酸与其余氨基酸侧链连接的环，后在肽酶或蛋白水解酶作用下生成glycnsisitina。

24、作为一种具体方案，所述应用包括：对外源转入了本发明所述表达载体的宿主进行培养，在宿主体内制备glycnsisitin a。其中，所述宿主可以选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、拟南芥、本氏烟草或昆虫细胞。

25、作为一种具体方案，所述应用包括：在本氏烟草中，外源转入表达所述自动环化酶gurburp或所述自动环化酶gurburp的截短型的表达载体，制备glycnsisitin a。

26、有益技术效果：

27、本发明所述的自动环化酶gurburp包括重组工程细胞和重组酶能够合成glycnsisitin a，避免了化学合成法存在的立体及区域选择性差、官能团的保护和脱保护、路线长和成本高以及污染环境等缺陷，且无需从植物中提取，为获得glycnsisitin a提供了新方法。